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Medicine

Renale Ischämie Reperfusionsschaden: Ein Maus-Modell der Schädigung und Regeneration

doi: 10.3791/51816 Published: June 7, 2014

Abstract

Renale Ischämie Reperfusionsschaden (IRI) ist eine häufige Ursache der akuten Nierenschädigung (AKI) in Patienten-und Verschluss der Nierendurchblutung ist bei Nierentransplantation unumgänglich. Experimentelle Modelle, die genau und reproduzierbar zu rekapitulieren Nieren IRI sind entscheidend bei der Zerlegung der Pathophysiologie des AKI und die Entwicklung neuartiger Therapeutika. Präsentiert hier ist ein Maus-Modell der Nieren IRI, die in reproduzierbarer AKI führt. Dies wird durch eine Mittellinie Laparotomie Ansatz für die Operation mit einem Einschnitt ermöglicht sowohl eine rechte Nephrektomie das Kontrollgewebe und Klemmung der linken Nieren Pedikel Ischämie der linken Niere induzieren stellt erreicht. Durch sorgfältige Überwachung der Spannposition und die Körpertemperatur während der Dauer der Ischämie dieses Modell erzielt reproduzierbare funktionelle und strukturelle Verletzung. Mäuse getötet, 24 Stunden nach der Operation zeigen, Verlust der Nierenfunktion mit Erhöhung des Serum-oder Plasma-Kreatinin-Spiegel sowie Strukturliche Nierenschäden mit akuten Tubulusnekrose offensichtlich. Die Nierenfunktion verbessert und nach Nieren IRI, so dass dieses Modell verwendet werden, um die Nierenregeneration untersuchen die akute Gewebeverletzung löst im Laufe von 7 Tagen. Dieses Modell der Nieren IRI wurde verwendet, um die molekularen und zellulären Pathophysiologie der AKI sowie die Analyse der nachfolgenden Nierenregeneration zu studieren.

Introduction

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Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) ist eine häufige Art der Verletzung mehrerer Organe, einschließlich Niere, Herz und Gehirn. Renal IRI kann zu akuten Nierenschädigung (AKI) in Patienten zu führen und keine spezifische Behandlung zur Verfügung steht. AKI infolge IRI eine komplizierte Pathogenese den sowohl der angeborenen und erworbenen Immunantwort 1. Ein experimentelles Modell der Nieren IRI bietet die Möglichkeit, die wichtigsten Zellen und Mediatoren in der Pathogenese der AKI sowie die anschließende Nierenregeneration, die über folgenden Tagen erfolgt beteiligt sezieren. Darüber hinaus sind die Auswirkungen der neuen therapeutischen Mittel bei Krankheitsprozessen beurteilt werden kann.

Das Gesamtziel des experimentellen Modell der Nieren IRI hier beschrieben ist, um sowohl akuten funktionellen und strukturellen Nierenschädigung zu induzieren. Einige Forscher haben ein Modell, das die Induktion von bilateralen IRI 2 beinhaltet genutzt. Obwohl die bilateralen Nieren IRI-Modell ist der Einsatz, die einseitige ernal IRI-Modell hat den Vorteil einer Nephrektomie rechts zum Zeitpunkt der Operation vorgenommen. Das Recht Nephrektomie Gewebe dient als wertvolle Kontrollgewebe in Studien mit Vorbehandlungsstufe, die entweder induziert oder unterdrückt die Expression eines Gens oder des Proteins. Zum Beispiel haben wir dieses Modell verwendet, um die Wirkung von Häm Präkonditionierung Arginat (HA) Injektion 24 Stunden vor Nieren IRI 3 zu beurteilen. Die erfolgreiche Induktion der zellschützenden Enzyms Häm-Oxygenase-1 (HO-1) von HA vor IRI in die richtige Nephrektomie Kontrollgewebe 4 bestätigt. HA reduzierten Nieren IRI in alten Mäusen zum Teil über eine HO-1-abhängigen Mechanismus. Ebenso haben wir das Modell in Makrophagen-Depletion Studien verwendet, um die Rolle von Makrophagen im Nieren IRI 5 zu prüfen. Immunhistochemische Analyse des rechten Nephrektomie Gewebe kann verwendet werden, um die Wirksamkeit der Ablation Methode zu bestätigen. Das Recht Nephrektomie Gewebe kann daher sowohl bestätigen verwendet werden und auch den Grad von induction oder Hemmung des Moleküls von Interesse in jedem einzelnen Versuchstier. Dieses Modell wird von Interesse für Forscher, die mit Medikamenten oder anderen Verbindungen, die Expression der Gene oder Proteine ​​usw. vor der Induktion der Nieren IRI modulieren.

Andere Studien haben Flanke Einschnitte verwendet werden, um die Nieren zu gelangen. Das hier beschriebene Modell verwendet einen einzelnen Mittellinie der Bauchchirurgie, sowohl die rechte Nephrektomie durchführen und induzieren Ischämie Reperfusion der linken Niere. Dieses chirurgische Vorgehen bietet eine hervorragende Visualisierung des Operationsfeldes einschließlich der Nieren Stiele und Farbveränderungen, die die Nierenstielspann folgen. Unsere veröffentlichten Erfahrungen mit dem Modell 6.4 zeigt, dass Mäuse, schnell von der Operation erholen mit einer nahezu 100% Überlebensrate.

Schließlich kinetische Analyse der Modell über einen Zeitraum von 7 Tagen zeigt, dass dieses Modell die Wiederherstellung der Nierenfunktion und beide Rohr Integrität, mitsignifikante Rohrzellproliferation.

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Protocol

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HINWEIS:. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften durch die Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 auferlegt wurden Verfahren durchgeführt unter Verwendung von sterilen (autoklaviert) chirurgische Instrumente und Verbrauchsmaterialien durchgeführt. 15 Wochen, mit dem optimalen Alter Befinden - Während die Mausmodell der Nieren IRI präsentiert hier wurde auf einem 8-Wochen alten männlichen Balb / c-Maus ist es reproduzierbar auf einer Vielzahl von Maus-Stämme von beiden Geschlechtern in der Regel zwischen 7 Jahren durchgeführt werden durchgeführt 8 Wochen. Die in der repräsentative Ergebnisse Abschnitt präsentierten Daten wurden sowohl aus Balb / c und FVB-Mäusen erhalten. Die Anwendung von Kochsalzlösung erwärmt wird verwendet, um den Darm und OP-Bereich feucht zu halten, aber es sollte sorgfältig überwacht und auf ein Minimum, wie die übermäßige Anwendung von Flüssigkeiten aufbewahrt werden können, um ein Artefakt Senkung des Serum-oder Plasma-Kreatinin-Werte, die eine wichtige ist zu führen Versuchsanzeige.

1. Tier Vorbereitung und Laparotomie

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  • Anesthetize die Maus mit Ketamin-Hydrochlorid (70 mg / kg) und Medetomidinhydrochlorid (1 mg / kg) intraperitoneal und bestätigen Sie die Narkosetiefe durch den Verlust der Reflexe, zB Zehen Prise. Die Dauer des resultierenden Anästhesieebene beträgt 4 Stunden. Dies ist ausreichend, um die gesamte chirurgische Prozedur durchzuführen, und keine zusätzliche Anästhesie erforderlich.
  • Entfernen Sie die Haare um den Schnittbereich, sicherzustellen, dass das Gebiet ist frei von losen Haaren und desinfizieren die Bauchhaut mit einer verdünnten Lösung Chlorhexidin.
  • Platzieren Sie die Maus auf einem beheizten Operations Pad in Rückenlage und die oberen und unteren Extremitäten zu beheben, um das Pad mit Low-Tack Klebeband. Sicherzustellen, dass die oberen Enden in einer normalen Position in der Lunge zu verhindern Kompression gehalten. Während des gesamten Verfahrens überwachen die Maus für Verbrennungen. Wenn möglich, wird empfohlen, eine nicht-elektrische Wärmequelle verwendet werden.
  • Verwalten des Analgetikum Buprenorphin-Hydrochlorid (0,06 mg / kg)subkutan und anwenden Auge Schmiermittel auf die Augen, um Hornhaut austrocknet. Analgetika werden vor der Operation, um die postoperative Genesung zu unterstützen verabreicht.
  • Mit Trenngewebe oder eine Schere Skalpell einen Mittellinie Laparotomieschnitts und unverblümt trennen die Haut vor dem Bauchfell. Dies erlaubt der Haut und Bauchfell, die während Wundverschluss separat genäht werden. Ein Schnitt der avaskulären linea alba gemacht, die Zugang zu der Bauchhöhle.
  • Um eine klare Sicht auf das Operationsgebiet zu erstellen legen Sie eine Aufroller und legen Sie die Maus.
  • 2. Harnleiter-Division und der rechten Nephrektomie

    1. Drücken Sie vorsichtig den Darm in Richtung der linken Seite der Bauchhöhle mit einem Wattestäbchen im Autoklaven sterilisiert mit Kochsalzlösung, um die rechte Niere und Harnleiter aussetzen befeuchtet. Bedecken Sie den Darm mit angefeuchteten Vorhänge Austrocknen zu verhindern.
    2. Heben Sie den rechten Harnleiter mit abgewinkelten Pinzette. Ligation das Recht Harnleiter zweimal mit 6/0 silk-geflochten Naht. Für Langzeit-Experimenten, verwenden Sie resorbierbaren Fäden für alle Bauchoperationen.
    3. Teilen Sie die Harnleiter zwischen den Nähten. Während die Blasen-Harnleiter-Kreuzung sollte Urin aus undichten in das Peritoneum von der Blase zu verhindern, der Harnleiter wird als Schutz gegen Leckagen postoperativ bei Langzeitexperimenten ligiert.
    4. Um einen leichteren Zugang zu ermöglichen, wenn die Durchführung der Nephrektomie rechts, schieben die Leber und auf der rechten Seite mit einem angefeuchteten Wattestäbchen und halten Sie ihn mit feuchten Gaze, um die rechte Nierenarterie und Vene freizulegen.
    5. Unverblümt sezieren das Bindegewebe und Fett zusammen medial der rechten Niere bis in die rechte Nierenarterie und Vene.
    6. Erstellen Sie einen Kanal unterhalb der Nierenarterie und Vene durch vorsichtiges Schieben der abgewinkelten Pinzette unterhalb der Blutgefäße. Führen Sie die Zange mit unter die Spitzen geschlossen und vorsichtig mit den Spitzen, um die Bildung des Kanals erleichtern offen zu entfernen.
    7. Wiederholen Sie Schritt 2,6 bis die Spitzen der Zange sind durch das Bindegewebe nur über die Nierenarterie und Vene sichtbar. Sobald sichtbar sanft reiben die Spitzen der Zange gegen die Spitzen der anderen Satz von abgewinkelten Pinzette vorsichtig brechen das Bindegewebe.
    8. Mit der Nierenarterie und Vene deutlich zugänglichen sie nun verschlossen werden. Schieben abgewinkelten Pinzette unterhalb der Nierenarterie und Vene mit die Spitzen geschlossen. Einmal im Ort öffnen die Spitzen der Pinzette und führen die blutstillende Clip-Applikator zwischen den Spitzen und fest wenden eine blutstillende Clip auf die Nierenarterie und Vene in der Nähe der Niere. Alternativ kann die Nierenarterie und Vene kann mit 6/0 Seide geflochtene Nahtmaterial ligiert werden.
    9. Teilen Sie die verstopften Nierenarterie und Vene in der Nähe der Niere, die jetzt mit jedem noch anhaftende Bindegewebe entfernt werden können.
    10. Entfernen Sie alle Gaze verwendet, um die Leber zu halten und ersetzen den Darm mit Wattestäbchen.

    1. Drücken Sie vorsichtig den Darm auf die rechte Seite der Bauchhöhle mit Wattestäbchen, um die linke Niere und Harnleiter freizulegen und decken mit angefeuchteten Vorhänge. Bei Bedarf kann die Bauchspeicheldrüse mit angefeuchteten Mull abgelenkt werden, einen leichteren Zugang zu ermöglichen.
    2. Verwenden stumpf, um sanft zu brechen das Bindegewebe vor und hinter der linken Nierenarterie und Vene, und erstellen Sie einen Kanal unterhalb der Gefäße in einer ähnlichen Weise wie in Harnleiter-Division und der rechten Nephrektomie beschriebenen Schritt 2.4.
    3. Induzieren Ischämie der linken Niere, indem eine Mikro serrafine Clip auf die Nierenarterie und Vene. Erfolgreiche Ischämie kann visuell durch einen allmählichen Verdunkelung des einheitlichen Niere bestätigt werden. Blutgefäße neben der linken Nierenarterie und-vene gelegentlich liefern die Niere. Falls vorhanden, müssen auch diese zusätzlichen Blutgefäße mit Mikro serrafine Clips, um erfolgreich verschlossen werdeninduzieren Ischämie der gesamten Niere.
    4. Ersetzen Sie den Darm und sorgfältig sicherzustellen, dass es keine abrupten Wendungen, die zu Darm Ischämie kompromittierenden Ergebnissen führen können. Vorübergehend schließen Sie das Bauchfell mit einer einzigen Naht.
    5. Nach Ischämie Induktions sofort die Maus auf einem homöothermen Decke mit einer rektalen Thermistor mit einer Steuereinheit, die die Körpertemperatur bei 37 ° C für die erforderliche Dauer der Ischämie beibehält befestigt. Um die entsprechende Länge der Ischämie notwendig definieren, um den gewünschten Grad der Nierenschädigung und Nierenversagen induziert wird empfohlen, dass eine Titration für jeden Stamm und chirurgischen Operateur durchgeführt werden.
    6. Kurz vor dem Ende des ischämischen Periode wieder öffnen das Bauchfell und sorgfältig positionieren den Darm, den Zugang zu der Klemme ermöglichen und sehen Sie die Niere. Einsetzen des Retraktors, wie in dem Video gezeigt wird, ist nicht erforderlich und wurde lediglich aus Darstellungszwecken durchgeführt.
    7. Entfernen Sie die clamp nach der Zeit der Ischämie wurde abgeschlossen. Unmittelbar nach der Entfernung der Niere die Farbe von einem dunklen kastanienbraunen schnell ändern, um eine gesunde dunkelrosa was eine erfolgreiche Reperfusion.
    8. Wieder sicher, dass der Darm nicht vor dem Schließen des Bauchfells mit einem Zierstich mit 6/0 geflochtenen Seidennahtmaterial verdrillt. Schließen Sie dann die Haut mit Hilfe metallische Haut-Clips.
    9. Um die Gefahr von postoperativen Infektion zu minimieren, wenden ein Antiseptikum, wie Iod / Alkohol-Lösung auf das Operationsgebiet.

    4. Post-operative Wiederherstellung und Pflege

    1. Teilweise Rückwärts Anästhesie mit Atipamezol-Hydrochlorid (2 mg / kg) subkutan zu verabreichen und Flüssigkeiten mit einer subkutanen Injektion von 1 ml Kochsalzlösung erwärmt, um eine Dehydratation nach der Operation zu verhindern.
    2. Mäuse sorgfältig zu überwachen, bis sie das Bewusstsein wiedergewonnen, erscheint aufmerksam und sind in der Lage, sich aufzurichten.
    3. Veröffentlichung Mäuse in einem beheizten Feld wieder bei 29 ° C, loc gehaltenATED in einer ruhigen Umgebung, für 24 Std. Mäuse eine beeinträchtigte Fähigkeit, aufgrund der Anästhesie thermoregulate haben und es ist daher wichtig, dass sie bei einer erhöhten Temperatur untergebracht, um effektive Rückgewinnung zu ermöglichen. Angefeuchtet Nahrung kann ebenfalls vorgesehen, um Fluid-und Nahrungsaufnahme fördern.
    4. Für die langfristige Erholung Experimente liefern laufenden Analgetika und entfernen Hautklammern 7 Tage nach der Operation.

    5. Beurteilung der Struktur-und Funktions Kidney Injury und Regeneration

    1. Blut aus der Schwanzvene in Experimenten oder durch Herzpunktion zum Zeitpunkt der Euthanasie am Ende des Experiments gesammelt werden. Messen der Nierenfunktion durch Serum-Kreatinin, mit einem Creatinase basierte Methode, und Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) auf einer biochemischen Zentrifugalanalysator wie zuvor 7 beschrieben. Sollen, bevor ein Modell von Nierenversagen, wie diese ermittelt werden, der Nierenfunktion von normalen gesunden Mäusen benötigt, kann deutlich variieren depending auf der zB der Jaffe-Reaktion und Creatinase basierte Methoden zur Messung der Kreatinin-Analysemethode zu unterschiedlichen Ergebnissen.
    2. Untersuchen Nierenstruktur durch Histopathologie auf Paraffin eingebettet Nierengewebeschnitten mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) oder Periodic Acid Schiff (PAS) gefärbt. Erfassen von 5 - 10 Aufnahmen in 200-facher Vergrößerung der äußeren Streifen der äußeren Medulla (OSOM) für jede Maus. Beurteilen Sie den Grad der Verletzung in der OSOM da diese Region ist in diesem Modell verletzt, weil sie sehr anfällig für Hypoxie ist.
    3. Verwenden Sie eine der beiden unten beschriebenen Scoring-Systeme, um akute tubuläre Nekrose (ATN) oder Regeneration zu messen. Repräsentative Morphologie der in diesen Systemen verwendeten Einstufungen ist in Abbildung 1 dargestellt.
    4. Verwenden Sie einen einfachen binären System zu punkten ATN. Auf der Basis der Zellintegrität und Morphologie Marke und zählen Tubuli entweder als lebensfähig (intakte Zellmorphologie) oder nekrotischen (kompromittiert Zelle integrity, anormale Zellmorphologie oder Verlust von Zellen).
      1. Ausdruck der Anzahl der nekrotischen Tubuli als Prozentsatz der Gesamtzahl der Tubuli (Röhrchen nekrotischen%).
    5. Bewerte Regeneration mit einem anderen System, das auf die Integrität der Zelle, Morphologie und Keimzahl. Mark und zählen Tubuli als gesund, nekrotischen, verletzt oder Wiederherstellung nach den in den folgenden Schritten aufgeführten Kriterien.
      1. Wie bei der ATN-Scoring-System (in Schritt 5.4 beschrieben) markieren Tubuli mit intakter als normale Zellen, während gesunde Tubuli mit eingeschränkter Zellintegrität sollte abnorme Zellmorphologie oder offene Zellverlust als nekrotischen erzielt werden.
      2. Bewerte Tubuli als verletzt, wenn sie einen ausgedünnten Zytoplasma mit wenigen Kernen haben. Im Gegensatz dazu bezeichnen Tubuli mit mehr Kernen mit normaler Zellmorphologie als erholt.
      3. Express jedes Röhrchen Einstufung als Prozentsatz der Gesamtzahl Röhrchen.

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    Representative Results

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    Rohrschäden und Wiederherstellung kann von H & E oder beurteilt werden PAS-Färbung von Gewebeschnitten nach Nierentransplantation IRI. Tubuli innerhalb der OSOM liegen so gesund, verletzt, nekrotischen oder die Rückgewinnung nach der Zellmorphologie, Integrität und Keimzahl (Abbildung 1) eingestuft. Die funktionellen und strukturellen Schädigung in diesem Modell ist abhängig von der Dauer der Ischämie. Eine fortschreitende Zunahme der Schwere der Nierenfunktionsstörung, durch Plasma-Kreatinin und BUN beurteilt, ist offensichtlich, da die Dauer der Ischämie wird durch 2min Schritten erhöht (Abbildung 2). Das Ausmaß der strukturellen Nierenschädigung, abgeleitete von der ATN-Score, folgt einem ähnlichen Trend mit schweren Begleit ATN längeren Ischämie (Abbildung 3). Nach einer ersten Titration von unterschiedlicher Dauer der Ischämie sollte dieses Modell der Nieren IRI eine nahezu 100% ige Erfolgsquote zu erreichen, mit allen Mäusen die Entwicklung sowohl funktionellen und strukturellen Schädigung folgenden Surgery. Dieses Modell der Nieren IRI ermöglicht auch eine feine Maß an Kontrolle über den Grad der Verletzung mit zwischen Tieren (Abbildungen 2 und 3) beobachtet beschränkt Variation. Die Verwendung unterschiedlicher Dauer der Ischämie können therapeutische Interventionen für ihre Fähigkeit, verschiedene Ebenen der Verletzungsschwere modulieren sucht werden. Beispielsweise auf der Basis der Länge der Ischämie die Schädigung als mild (20 min), mittel (22 min) oder hohe (24 min) eingestuft werden. Diese Werte sind für männliche Balb / c-Mäuse im Alter von 8 Wochen und werden nur als Anleitung enthalten. Die Ermittler sollten ihre eigenen experimentellen Bedingungen zu schaffen, da diese nach Mausstamm, Alter, Geschlecht und der biochemischen Assays verwendet werden, um die Nierenfunktion zu beurteilen abweichen.

    Dieses Modell wurde erfolgreich zur Regeneration nach Nieren IRI sowohl die Nierenfunktion und-struktur in den darauffolgenden Tagen erholt studieren. Eine allmähliche Rückgang der Plasma-Kreatinin-und Harnstoffwerte sind observed, mit Plasma-Kreatinin Rückkehr zum Grundspiegel an Tag 7 (Fig. 4). Eine Bewertung der H & E-gefärbten Gewebeschnitten zeigt an, dass eine erhöhte Anzahl von Tubuli werden als gesund oder Wiederherstellung am Tag 7 im Vergleich zu Tag 4 angibt, dass die Geweberegeneration stattfindet (Abbildung 5) eingestuft. Die Verabreichung von 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) vor der Tötung erleichtert die Immunfärbung von Nierengewebe für BrdU und anschließender Quantifizierung des rohrförmigen Zellproliferation. Dramatische Kern BrdU-Expression beobachtet wird 4 Tage nach Nierentransplantation IRI darauf hinweist, dass die Röhrchen durchlaufen markiert die Zellproliferation um Tubulus Integrität und Funktion (Abbildung 6) wiederherzustellen. Die Kombination der Nierenfunktion Beurteilung, Scoring zur Strukturverbesserung und BrdU-Immunfärbung ermöglicht dieses Modell verwendet, um die Regeneration nach Nierentransplantation IRI studieren. Dies ermöglicht die langfristigen Auswirkungen von therapeutischen Interventionen, um in seinsuchten.

    Schließlich ist die Brauchbarkeit dieses Modells hängt von der Induktion der globalen Ischämie auf die gesamte Niere und dies kann durch die Anwesenheit von Blutgefäße der Niere neben der Haupt linke Nierenarterie gefährdet. Wenn diese zusätzlichen Behälter nicht geklemmt dann Teil der Niere nicht ischämischen Schädigung (7) unterzogen werden.

    Figur 1
    Abbildung 1 Bewertung der strukturellen tubuläre Schädigung und Regeneration -.. Vertreter Morphologie gesund, erholt sich, verletzt und nekrotischen Tubuli Gewebeschnitte aus einer Niere entfernt 4 Tage nach Nierentransplantation IRI mit PAS für die Bewertung gefärbt. Tubuli innerhalb der OSOM liegen so gesund, verletzt, nekrotischen oder die Rückgewinnung nach klassifiziertZellmorphologie, Integrität und Keimzahl mit repräsentativen Beispielen hervorgehoben. Gesunde Tubuli intakt sind mit einem normalen Zellmorphologie. Nekrotische Tubuli weisen eine deutlich beeinträchtigt Monoschicht mit Zellverlust und Verlust der Zellmorphologie. Verletzte Tubuli weisen einen verdünnten Zellmonolayer und enthalten weniger Kerne. Im Gegensatz dazu zeigen Rückgewinnung Tubuli eine normale Zellmorphologie und eine ähnliche Anzahl von Kernen, gesunde Tubuli. Vergrößerung:. 400x Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 2
    Abbildung 2 Verletzungen -. Renal Ischämie beeinträchtigt die Nierenfunktion Männliche Balb / c-Mäuse im Alter von 8 Wochen unterzog sich einer Nephrektomie rechts und.linken Nieren Stiel wurde für 20, 22 oder 24 min (n = 4 pro Gruppe) eingespannt. Die Mäuse wurden bei 24 Stunden nach Nierentransplantation IRI geopfert. Plasma-Kreatinin und Blutharnstoffstickstoff zeigen einen zunehmenden Trend der Schwere wie die Länge der Ischämie erhöht. Die gestrichelte Linie stellt die Höhe der Plasma-Kreatinin und Blut-Harnstoff-Stickstoff im normalen Kontrollmäusen gefunden. Als Mittelwert ± SEM dargestellt und durch Einweg-ANOVA-Daten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Fig. 3
    . Abbildung 3 Verletzungen - Nieren Ischämie induziert signifikante akute tubuläre Nekrose Männliche Balb / c-Mäuse im Alter von 8 Wochen unterzog sich einer Nephrektomie rechts und die linke Nieren Stiel war klar.für 20, 22 oder 24 min (n = 4 pro Gruppe) Amping. Die Mäuse wurden bei 24 Stunden nach Nierentransplantation IRI geopfert. Repräsentative Mikroaufnahmen (Vergrößerung: 200x) des OSOM von H & E-gefärbten Nierenschnitten von Kontroll-und Nieren verletzt illustrieren ATN. Formal Scoring von ATN (als Anteil der nekrotischen Tubuli ausgedrückt) bestätigt die erhöhte Verletzungsgefahr mit zunehmender Dauer der Ischämie. Daten als Mittelwert ± SEM dargestellt und durch Einweg-ANOVA (**** = P ≤ 0,0001) analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Fig. 4
    . Abbildung 4 Regeneration - Die Nierenfunktion erholt sich nach renalen Ischämie Male FVB Mäusen ag.ed 8 - 10 Wochen Rück erfuhr eine Nephrektomie rechts vor 25 min Ischämie der linken Niere. Mäuse getötet 1 Tag (n = 10), 4 Tage (n = 10) oder 7 Tage (n = 6) nach renalen IRI. Sowohl Plasma-Kreatinin und Blutharnstoffstickstoff stetig im Laufe von 7 Tagen zurückgehen, mit Plasma-Kreatinin-Rückkehr zu den Grundniveaus ist, die eine Erholung der Nierenfunktion. Daten als Mittelwert ± SEM dargestellt und durch Einweg-ANOVA (*** = p ≤ 0,001, * = p ≤ 0,05) analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 5
    Abbildung 5 Regeneration -. Nierengewebe zeigt Zeichen der Erholung nach rena . l Ischämie Male FVB-Mäusen im Alter von 8 - 10 Wochen Rück unterzog sich einer Nephrektomie rechts vor 25 min der Ischämie der linken Niere. Mäuse wurden 4 Tage getötet (n = 10) oder 7 Tage (n = 6) nach renalen IRI. Repräsentative Mikroaufnahmen (Vergrößerung: 200x) des OSOM nach der Induktion der Ischämie gezeigt. Formal Scoring von der Anzahl der gesund, erholt sich, verletzt oder nekrotischen Tubuli innerhalb der OSOM wurde PAS gefärbten Paraffinschnitten beurteilt. Am Tag 4 nach Nierentransplantation IRI einen großen Teil der Tubuli im OSOM erscheinen immer noch verletzt. Jedoch um 7 Tagen gibt es eine erhebliche Zunahme des Anteils der Tubuli, die als gesund oder Wiederherstellung der Nierenricht Regeneration klassifiziert sind. Als Mittelwert ± SEM dargestellt Daten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    mmer "> Fig. 6
    . Abbildung 6 Regeneration - Dramatische Rohrverbreitung ist offensichtlich, 4 Tage nach renalen Ischämie Male FVB-Mäusen im Alter von 8 -. 10 Wochen unterzog sich einer Nephrektomie rechts vor 25 min der Ischämie der linken Niere. BrdU (50 mg / kg) wurde durch intraperitoneale Injektion 24 Stunden vor der Tötung verabreicht. Mäuse wurden 4 Tage getötet (n = 10) oder 7 Tage (n = 6) nach renalen IRI. Repräsentative Mikroaufnahmen (Vergrößerung: 200x) des OSOM von Mäusen an Tag 4 und Tag 7 nach der Induktion der Ischämie geopfert werden angezeigt. Rohrzellen-Proliferation wurde durch immunhistochemische Färbung von in Paraffin eingebetteten BrdU auf Nierenschnitten beurteilt. Rohrzellproliferation wurde durch Zählen der Anzahl von BrdU positive Kerne im OSOM mit einer erhöhten Zellproliferation quantifiziertoffensichtlich am Tag 4. präsentierten Daten als Mittelwert ± SEM und die von Studenten t-Test (*** = p ≤ 0,001) analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Fig. 7
    Abbildung 7. Linke ischämischen Niere mit nicht verschlossenen zusätzliche Nierenblutgefäße. Nicht zusätzliche Blutgefäße verstopfen Versorgung der Niere führt zu inkonsistenten Ischämie. (A) Das Fehlen der globalen Nieren Ischämie wird durch eine ungleichmäßige Farbwechsel (weißer Pfeil) angezeigt, wenn die Mikro serrafine Clip in Position ist. (B) Nach der Entfernung des Mikro serrafine Clip, der Hauptnierenarterie und Vene sichtbar sind (weißer Pfeil) zusammen mit der zusätzlichen Blutgefäß Versorgungdie mittleren und unteren Pol der Niere (schwarzer Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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    Discussion

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    Renal IRI ist eine wichtige Ursache von AKI ohne spezifische Behandlung zur Verfügung. Die experimentelle Untersuchung der Nieren IRI sehr informativ mit früheren Arbeiten zeigen die Rolle von Makrophagen, dendritische Zellen, Lymphozyten, regulatorische T-Zellen als auch andere Zellen und Mediatoren in die Induktion sowohl der akuten Verletzung und Heilung Phase war 5,8 - 16. Zusätzlich experimentelle Nieren IRI verwendet wurde, um die Wirkung verschiedener therapeutischer Mittel 4,17-19 beurteilen.

    Das Modell der Nieren IRI detailliert hier verwendet eine Mittellinie Laparotomie Ansatz, eine richtige Nephrektomie durchführen und induzieren Ischämie in der linken Niere mit Schellen. Wie durch die Ergebnisse repräsentativ dargestellt ist, Modifizieren der Dauer der Ischämie können die Schwere der Verletzungen zu steuern. Daher kann dieses Modell angepasst werden, um zu induzieren mild, moderat oder ein hohes Maß an Nierenversagen als durch die experimentelle Fragestellung erforderlich. Allerdings ist eine Beschränkung dieses Modell, daß esist nicht geeignet für die Induktion von sehr schweren Nierenschädigung bei längerer Nieren Ischämie. Die resultierende schwere akute Nierenversagen kann zu erheblichen Mortalität führen.

    Es gibt mehrere Aspekte, die von diesem Modell, um vorhersagbare und reproduzierbare Nierenschädigung zu erreichen entscheidend sind. Eine Hauptquelle der Veränderlichkeit bei diesem Modell kann aus der Körpertemperatur während der ischämischen Periode 20 stammen. Es ist daher wichtig, dass die Körpertemperatur auf einem konstanten Niveau gehalten wird und während der ischämischen Periode überwacht. In diesem Protokoll ein Steuergerät mit Temperatursonden und homoeothermic Decke wurde bei 37 ° C, um die automatische Regulierung der Körpertemperatur verwendet Der Einfluss der Körpertemperatur für die Empfänglichkeit der Niere, ischämischen Verletzungen gut beschrieben. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Körpertemperatur wirkt sich auf die Schwere der Nieren IRI 20 und Veränderung der Körpertemperatur der Mäuse ist ein potentieller StörfaktorenFaktor, der die Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen können. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass Mäuse können anatomische Variante mit zusätzlicher Blutgefäße, die linke Niere liefern ausstellen. Es ist wichtig, dass solche zusätzlichen Blutgefäße verschlossen werden identifiziert und bei der Durchführung des rechten Nephrektomie und Induzieren globalen Ischämie in der linken Niere. Andernfalls wird in Widerspruch Ischämie während der Niere führen. Ebenso sollte die Farbänderung der linken Niere nach Klemmung der linken Nieren Stiel genau wie das Fehlen einer globalen Farbänderungen untersucht werden, auf das Vorhandensein eines zusätzlichen Nierenarterie, die zunächst nicht erkannt worden war.

    Im Gegensatz zu Modellen, die bilateralen Nieren Ischämie zu nutzen, wird dieses Modell von Interesse für Wissenschaftler, die verwenden die prophylaktische Verabreichung von Medikamenten oder anderen Mitteln, um die Expression von Genen zu modulieren, Proteine ​​usw. vor der Nierenschädigung. Das Rigght Nephrektomie Gewebe zu bestätigen beide verwendet werden, und auch den Grad der Induktion oder Inhibition des Moleküls von Interesse in jedem einzelnen Versuchstier. Dieses Modell wird auch von Interesse für Forscher studieren Nierenregeneration sein, wie die akute Verletzungsphase wird von prominenten Rohr Proliferation gefolgt.

    Einige experimentelle Modelle der Nierenentzündung begrenzt als signifikant Krankheit nur bei bestimmten Mausstämmen induziert werden. Im Gegensatz dazu das Modell der Nieren IRI hier beschrieben ist vielseitig und kann sowohl für männliche und 5 weibliche Mäuse 4, verschiedene Stämme von Mäusen als auch alte Mäuse 4 angewendet werden.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Tissue scissors Fine Science Tools 14072 - 10
    Micro-Adson forceps (Rat toothed) Fine Science Tools 11019 - 12
    S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled Fine Science Tools 00649-11
    Colibri retractor Fine Science Tools 17000 - 04
    Micro clip applicator Fine Science Tools 18057-14
    Micro serrafines  Fine Science Tools 18055-04
    Olsen-Hegar needle holder Fine Science Tools 12002 - 12
    Hemoclip Plus Ligating Clips Small Weck 533837
    Autoclip Wound Clip System, 9mm Harvard Apparatus PY2 52-3748
    Silk Black Braided Suture, Size 6-0 Harvard Apparatus 723288
    Standard Heat Matt
    Homeothermic Blanket & Control Unit Harvard Apparatus
    Lacri-Lube Allergan
    Vetasept Chlorhexidine   AnimalCare
    Vetalar : Ketamine hydrochloride 100 mg/ml solution
    Domitor : medetomidine hydrochloride  1 mg/ml
    Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride  0.3 mg/ml
    Antisedan : Atipamezole hydrochoride 5 mg/ml

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Kinsey, G. R., Li, L., Okusa, M. D. Inflammation in acute kidney injury. Nephron Exp Nephrol. 109, (2008).
    2. Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303, (2012).
    3. Ferenbach, D. A., Kluth, D. C., Hughes, J. Hemeoxygenase-1 and renal ischaemia-reperfusion injury. Nephron Exp Nephrol. 115, (2010).
    4. Ferenbach, D. A., et al. The induction of macrophage hemeoxygenase-1 is protective during acute kidney injury in aging mice. Kidney Int. 79, 966-976 (2011).
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    Renale Ischämie Reperfusionsschaden: Ein Maus-Modell der Schädigung und Regeneration
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    Hesketh, E. E., Czopek, A., Clay, M., Borthwick, G., Ferenbach, D., Kluth, D., Hughes, J. Renal Ischaemia Reperfusion Injury: A Mouse Model of Injury and Regeneration. J. Vis. Exp. (88), e51816, doi:10.3791/51816 (2014).More

    Hesketh, E. E., Czopek, A., Clay, M., Borthwick, G., Ferenbach, D., Kluth, D., Hughes, J. Renal Ischaemia Reperfusion Injury: A Mouse Model of Injury and Regeneration. J. Vis. Exp. (88), e51816, doi:10.3791/51816 (2014).

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