Summary
Vi rapporterer en teknik til fremstilling af mikrolommer inden electrospun membraner til at studere celle adfærd. Specifikt beskrives en kombination af microstereolithography og elektrospinning til fremstilling af PLGA (poly (lactid-co-glycolid)) hornhinde biomateriale, som er udstyret med microfeatures.
Abstract
Corneal problemer påvirker millioner af mennesker verden reducerer deres livskvalitet betydeligt. Hornhinde sygdom kan være forårsaget af sygdomme som aniridi eller Steven Johnsons syndrom samt af eksterne faktorer såsom kemiske forbrændinger eller stråling. Aktuelle behandlinger er (i) brugen af hornhinde transplantationer, og (ii) anvendelse af stamceller udvidet i laboratoriet og leveret transportvirksomheder (f.eks fosterhinde); disse behandlinger er relativt vellykket, men desværre kan de ikke efter 3-5 år. Der er behov for at designe og fremstille nye hornhinde biomateriale enheder i stand til at efterligne i detaljer det fysiologiske miljø, hvor stamcellerne opholde sig i hornhinden. Limbal stamceller er placeret i limbus (cirkulære område mellem hornhinden og sclera) i bestemte nicher kendt som Palisades af Vogt. I dette arbejde har vi udviklet en ny platform-teknologi, der kombinerer to avancerede fremstillingsteknikker (microstereolithography og electrospinning) til fremstilling af hornhinden membraner, der efterligner et vist omfang limbus. Vores membraner indeholder kunstige mikrolommer som har til formål at give cellerne med beskyttelse som Palisades af Vogt gøre i øjet.
Introduction
Hornhinden, den avaskulære centrale yderste væv i øjet, er en af de mest vigtige væv, der er involveret i syn 1. Der er flere typer af celler, der opretholder funktionen af hornhinden. Den øverste yderste lag af hornhinden består af epitelceller, der kan være omkring 5-7 lag tykkelse 2. Dette lag forhindrer bakteriel invasion i hornhinden 3 og tillader optagelse af ilt 4. Det er blevet rapporteret, at stamceller hornhindeepitelet ligger i nicher eller krypter (med størrelser på 120-150 um) på det perifere område af hornhinden kaldes limbus 5,6. Som stamcellerne opdele de afledte celler også kendt som forbigående forstærkende celler rejse ud af nicher og som deling fortsætter cellerne bevæger sig centripetalt indad og opad resulterer i terminalt differentierede celler ved den centrale hornhinde område 7,8. Disse celler bliver rutinemæssigt tørres væk med blink i øjet exposing nyere celler under 9.
Ud over at være placeringen af de epiteliale stamceller limbus spiller også en rolle i at holde vaskulariserede bindehinde væk fra hornhinden område 10. Skader på limbus kan skyldes termisk / kemiske forbrændinger, stråling og også genetiske sygdomme 10. Når dette sker, er limbus barriere opdelt tillade konjunktivale celler til at flytte ind på hornhinden, vascularizing regionen, der forårsager smerte og blindhed i nogle tilfælde. Betingelsen er kendt som limbale stamcelle mangel (LSCD) 10.
Forskellige naturlige substrater er blevet rapporteret som mulige stamceller bærere til medvirken i hornhinde regenerering. For eksempel blev collagen-baserede membraner anvendes af Dravida et al. 11 og Rama og kolleger 12 rapporterede anvendelsen af fibrin i en undersøgelse med 112 patienter. Men på nuværende tidspunkt det mest almindeligt anvendte metode til behandlinger at bruge menneskelige fosterhinde fra en vævsbank og kultur limbal epitelceller på dens overflade 13,14. Når et monolag er dannet, fosterhinde limet celle opad på den beskadigede hornhinden som har alle de konjunktivale celler og arvæv kirurgisk fjernet fra det forud for denne celletransplantation 14. Den fosterhinde nedbrydes inden for uger til måneder forlader epitelceller er knyttet til det blottede område for at regenerere epitel 15,16. Denne teknik har været en succes med at genoprette vision, men der er stadig et par praktiske spørgsmål, der begrænser dens udbredte optagelse klinisk. Som den fosterhinde er humant væv er det nødvendigt at gennemgå screening ved hjælp af god væv bankprocedurer inden de anvendes til celle transplantation på patienter. Denne screening kun sænker risikoen for overførsel af sygdomme, men kan ikke helt fjerne den 17. Ud over dette har der været rapporter om variabilitet i PPFYLDELSE af fosterhinde grundet inter donor variation 18,19 og forskellige forarbejdningsmetoder 19,20. Ved siden af den lille risiko for overførsel af sygdomme der er kravet til kirurgiske centre skal have adgang til veldrevne vævsbanker, ikke er tilgængelige for alle.
Selvom fosterhinde er forholdsvis vellykket, er der behov for udvikling af nye syntetiske bionedbrydelige celle carrier alternativer til behandling af hornhinden sygdom. Syntetiske luftfartsselskaber vil kunne imødekomme behovet for bankprocedurer samt eliminere den lille risiko for overførsel af sygdomme og inter-donor variabilitet. I denne forstand har materialer såsom polyethylenglycol 21,22 og PLGA 23,24 undersøgt.
I udviklingen af en syntetisk alternativ til den menneskelige fosterhinde er der også mulighed for at designe ind i det ønskelige træk til forhåbentlig hjælpe overlevelsen af de dyrkede celler. Udtagningenlusion af microfeatures inden biomateriale indretninger til specifik styring af celle adfærd er en spirende område af interesse. Mange forfattere har rapporteret arbejde hen imod udviklingen af kunstige stamceller nicher 25-30. Denne gruppe har for nylig rapporteret om oprettelsen af et mikrofabrikeret PEGDA fibronectin-biofunctionalized kunstig limbus til levering af limbal epitelceller 22 og en metode til fremstilling af electrospun bionedbrydelige membraner indeholdende mikrofabrikerede lommer til støtte af limbal epitelceller 31.
Målet med dette arbejde er at udvikle en ny produktionsteknologi til udvikling af biomateriale apparater indeholdende microfeatures som efterligner et omfang de mikromiljøer, hvor stamceller opholde sig i kroppen. Vi har udviklet en teknik, der kombinerer microstereolithography og elektrospinning, der tillader fremstilling af biologisk nedbrydelige mikrostrukturerede membraner, der viser stot potentiale for vævsregeneration applikationer.
Det er vigtigt at bemærke, at selv om der i dette arbejde har denne teknik været anvendt til fremstilling af ringe til hornhinden regenerering, kan teknologien anvendes til fremstilling af anordninger til regenerering af en bred vifte af epitelvæv, fx hud, oral slimhinder, tarm, respiratoriske og blære epiteler. Specifikt i denne undersøgelse har vi udviklet en syntetisk bionedbrydelig membran, der fungerer på en måde svarende til den fosterhindemembranen at levere celler til hornhinden. Denne membran indeholder mikrolommer på omkring 300 um (større end de limbal krypter af Pallisades af Vogt (omkring 150 um)). Endelig har vi etableret en emballage protokol, som tillader disse membraner skal opbevares ved -20 ° C i mere end 6 måneder uden at vise nogen tegn på nedbrydning.
Protocol
Etiske retningslinjer: Øjnene anvendt i denne undersøgelse blev anvendt i overensstemmelse med erklæringen om Åbenhed for Dyrs Forskning:
1. Fremstilling af PLGA Bionedbrydelige Membraner Udstyret med mikrolommer
- Ringen stilladser blev skabt ved en kombination af microstereolithography og electrospinning teknikker 31. I det væsentlige, kan processen sammenfattes i 2 dele (i) oprettelse af PEGDA skabeloner efter microstereolithography og (ii) electrospinning på skabelonerne til reproduktion af de underliggende PEGDA struktur (i dette tilfælde en mikrofabrikeret ring). Disse to trin er beskrevet detaljeret nedenfor (figur 1 og 2).
- Fabrikation af PEGDA skabeloner ved microstereolithography (microSL)
- Fabrikere ringene ved hjælp af et 2-lags-model, med det første lag (L1) er bunden af strukturen og det andet lag (L2) præsentation 6 mikrolommer med hestesko morfologiskees i en række størrelser fra 300 til 500 um. Fremstillingen af PEGDA ringe blev for nylig beskrevet af denne gruppe 22.
- Opret L1 ved at tegne en 1,2 cm sort cirkel ved hjælp af enhver egnet tegneprogram.
- Opret L2 på samme måde, men omfatter 8 hvid 0,5 x 0,35 mm hesteskoformede strukturer. Fordel de små hvide hesteskoform inden for det sorte cirkel struktur.
- Gem L1 og L2 i JPEG-format.
- I en mørk hætteglas blandes polyethylenglycoldiacrylat (PEGDA, Mn = 250 g / mol) med 1% w / w kamferquinon, en fotoinitiator, på en magnetomrører i 20 min.
- Udvid laserstrålen af microstereolithography set-up ved hjælp af en teleskopisk objektiv arrangement og derefter projicere det over på en computer programmerbar digital multimirror enhed (UV-aktiveret DMD startpakke). BEMÆRK: DMD afspejler billedet (i dette tilfælde en ring) på et spejl via en 10 cm brændvidde rør linse. Billedet er derefter instrueret af sølv-CoAted spejl ind i et hætteglas indeholdende det lyshærdende polymer (PEGDA).
- Juster og rengør omhyggeligt optikken i microstereolithography oprettet.
- Sæt 300 ul af PEGDA blandingen i en brønd på en 12-brønds vævskulturplade. Sørg brøndene præ-belagt med teflon eller andet ikke-klæbende materiale til nem fjernelse af struktur efter hærdning.
- Tænd for blå laser (MBL-III 473 nm 150 mW) og uploade L1 i ALP3-grundlæggende software tidligere installeret på pc'en. Bestråle det første lag til 60 sek. BEMÆRK: ALP3-basic er en USB-grænseflade, der giver forbindelse mellem PC og Digital mikrospejlindretning.
- Tilføj til brønden 250 pi flere af PEGDA, upload L2 som beskrevet ovenfor og bestråle L2 i 60 sek.
- Tag den uhærdede polymer og vaske ringen med isopropanol O / N.
- Fabrikere ringene ved hjælp af et 2-lags-model, med det første lag (L1) er bunden af strukturen og det andet lag (L2) præsentation 6 mikrolommer med hestesko morfologiskees i en række størrelser fra 300 til 500 um. Fremstillingen af PEGDA ringe blev for nylig beskrevet af denne gruppe 22.
- Fabrikation af Bionedbrydelig PLGA membraner ved hjælp elektrospinning
BEMÆRK: PEGDA ringene blev brugt som skabelons hvorover PLGA blev electrospun med PLGA gengiver den underliggende topografi, som det er spundet i løbet af disse skabeloner. Efter spinding blev arket af PLGA-polymer skrælles af opsamleren. Den endelige PLGA membranen ikke indeholde PEGDA ringe, som blev efterladt bundet til den metalliske samler.- Fordel PEGDA ringene på en galvaniseret aluminiumsplade (12 cm x 20 cm) for at skabe et statisk electrospinning samler.
- Monter ringene ved hjælp ledende carbon tape. BEMÆRK: Disse ringe engang dannede kan genbruges som skabeloner til electrospinning.
- Forbered polymeropløsningen til spinding. Opløses PLGA (50:50 DL-lactid (52 mol%): glycolid (48 mol%), 44 kg / mol) i dichlormethan (DCM) ved 20% vægt / vægt koncentration.
- Stir O / N før brug.
- Place 4 insulin sprøjter (stumpendet, nåle 0,8 cm indvendig diameter) på en sprøjte pumpe. BEMÆRK: Fire sprøjter sikres hurtigere electrospinning end at arbejde med en enkelt sprøjte.
- Load 2,5 ml PLGA opløsning i hver sprøjte.
- Electrospin anvendelse af en 30 ul / min flow og spændinger spænder fra 12 til 15 kV. Efterlad en afstand mellem nåle og opkøber på 15 cm.
- Electrospin i 1 time og 30 minutter og til sidst forsigtigt PLGA electrospun ark fra solfanger understøtter PEGDA ringe.
- Skær electrospun stilladser i 22 kredse mm diameter ved hjælp af en cirkulær hulning og forlader ringen struktur placeret i midten.
- Fabrikation af PEGDA skabeloner ved microstereolithography (microSL)
2. Langsigtet opbevaring af PLGA Mikrofabrikerede membraner
Bemærk: PLGA ringene blev fremstillet og steriliseret af akkrediterede eksterne virksomheder; prøverne var bestrålet ved en ekstern dosisområde på 25-40 KGy.
- Monter membran i en lille beholder (Plastic petriskål), og placere den i en medicinsk kvalitet taske.
- Brug filtrerpapir til at skabe små filterposer til tørremidler. To skabe de poser, fold filtrerpapir (diameter 125 mm) og skær den resulterende halvcirkel i halve; derefter forsegle enderne sammen ved hjælp af tape.
- Fyld tre filterenheder papirposer med 1 g silica orange, cobalt (II) chlorid og kobber (II) sulfat, hhv.
- Sæt de tre poser af tørremiddel inde i medicinsk kvalitet pose sammen med electrospun membran.
- Tilføj til posen en kommercielt tilgængelig seks spot luftfugtighed indikator kort til at opdage enhver fugtophobning i lagringsperioden.
- Brug et vakuum varme forsegling maskine til at støvsuge og luk posen.
- Sende den ring membraner til et eksternt firma til γ-bestråling.
- I en inkubator indeholdende 5% CO 2 Store γ-bestrålede PLGA membraner i et bredt temperaturområde fra -20 ° C til +37 ° C i et fugtigt miljø.
- Indlæg opbevaring undersøge luftfugtighed indikator for at bekræfte, at niveauet af luftfugtigheden er under 30%.
- USE Scanning Electron Microscopy (SEM) for at vurdere fiber integritet.
3. Isolering af limbale Eksplantater
Kanin limbal eksplantater blev isoleret fra kaninøjne (opnået fra en gård, hvor kaniner er avlet til forbrug).
- Desinficere kaninøjnene anvender antiseptisk opløsning (3%).
- Rens øjnene ved at fjerne eventuel overskydende væv omkring hornhinden.
- Adskil limbale region (identificeret som en tynd cirkulær området mellem hornhinden (gennemsigtig) og sclera (hvid)) fra resten af hornhinden under anvendelse af et dissektionsmikroskop.
- Skær i segmenter (omkring 1,5 cm lang) under dissektion mikroskop.
- Desinficere limbal segmenter i 1,5% antiseptisk opløsning i 1 min.
- Skær limbal segmenter i små stykker (100-500 um) med en skalpel.
- Opbevar de små stykker af væv i kultur (DMEM + Glutamax: Ham's F12 (1: 1), 10% føtalt bovint serum, 1 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 2,5 ug / ml amphotericin 10 ng / ml EGF, og 5 ug / ml insulin) ved 37 ° C og 5% CO 2 indtil anvendelse (ikke mere end 60 minutter).
4. Udvækst Celler fra limbal Eksplantater
Kanin limbal eksplantater blev anbragt på begge frisk spundne mikrofabrikerede og membraner, der var vakuumpakket og opbevaret i 6 måneder ved -20 ° C.
- Coat ring stilladser med 15 ul af fibrinklæber (1: 1 blanding af fibrinogen fra humant plasma i en koncentration på 18,75 mg / ml og thrombin fra humant plasma i en koncentration på 2,5 U / ml) ved hjælp af en celleskraber for distribution fibrin jævnt.
- Placer vævseksplantater direkte på PLGA mikrolommer ved hjælp af en 25 G kanyle og et dissektionsmikroskop.
- Tilføj celledyrkningsmedier meget forsigtigt for at undgå afmontering eksplantaterne.
- Skift medier hver 3 dage (medie opskrift beskrevet i afsnit 3.7) og kEEP i kultur i 2 uger i en befugtet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Fastgør prøver med 3,7% bufferet formaldehyd i 10 minutter efterfulgt af 3 vaske med PBS.
- Counterstain ved inkubering i 1 ug / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) eller propidiumiodid (PI) i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Vask 3 gange i PBS og gemme dækket med folie prøver.
- Billede prøverne ved hjælp af en fluorescens mikroskop ved bølgelængder på 543 og 800 nm (to-foton).
5. NEDSÆTTELSE Kanin Wounded Cornea 3D-modeller
- Rens og desinficer kaninøjnene som beskrevet ovenfor.
- Wound kaninøjnene ved at nedsænke dem i 0,14% ammoniumhydroxid i 5 min.
- Skyl øjnene i PBS og skrab epithelet med en sclerotome kniv.
- Skær og isolere hornhinden-scleral knap fjerne eventuelle resterende væv.
- Placer hornhinder epitelial side ned påen steril kop og fyld med 0,5% agar lavet i DMEM.
- Når de er indstillet, satte hornhinder epitelial opad i små petriskåle og tilføje dyrkningsmedier (opskrift beskrevet ovenfor) op til limbale område. BEMÆRK: Du må ikke dække hele hornhinden; holde organkultur ved luft-væske-grænsefladen.
6. Isolering af limbale Eksplantater og inklusion for Ring Stilladser i Rabbit Cornea 3D-modeller
- Coat ring membraner med 15 ul af fibrinklæber (1: 1 blanding af fibrinogen i en koncentration på 18,75 mg / ml og thrombin i en koncentration på 2,5 U / ml) .Bruger en celleskraber som beskrevet ovenfor.
- Placer vævseksplantater direkte på PLGA mikrolommer ved hjælp af en 25 G kanyle og et dissektionsmikroskop.
- Placer ringene med vævseksplantater på de blottede hornhinder med eksplantaterne står op og på luft-væske grænseflader. (Disse betingelser er tidligere blevet beskrevet 22).
- Vedligehold organkultur modeller for4 uger i en befugtet inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2, hvorved medierne hver 2 dage.
7. Vurdering af Hornhinde Regeneration og stamceller Vedligeholdelse
- Efter 4 uger fastsætte hornhinder ved hjælp af 3,7% formaldehyd.
- Proces hornhinder til konventionel histologi at producere 6 um paraffinsnit.
- Farv med hematoxylin og eosin (H & E).
- Til immuncytokemi afvokse sektionerne i xylen (3min) og rehydrere i 100% ethanol (1 min), 70% ethanol (1 min) og destilleret vand (2 minutter).
- Afgrænse de sektioner ved hjælp af en Dako pen til at afgrænse små områder, og undgå overdreven brug af antistof.
- Behandl afgrænsede områder med 0,05% trypsin (100 ul) i 20 minutter (37 ° C).
- Vask grundigt med PBS, og der tilsættes 100 ul 10% ged serum (blokering) i 1 time.
- Inkuber prøverne med 100 pi af muse monoklonalt antistof cytokeratin 3 (CK3) og 100 pi af P63 i 1% ged serum O / N ved 4 ° C.
- Vask med PBS og behandles med 100 pi af biotinyleret sekundært anti-muse-antistof (1: 1.000 i 1% gedeserum) i 1 time ved stuetemperatur.
- Tilsæt 100 pi FITC-streptavidin (1: 100 i 1% gedeserum) i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Behandl prøverne med DAPI som beskrevet ovenfor.
- Billede prøverne ved hjælp af en fluorescens mikroskop ved bølgelængder på 800 nm (to-foton) og 488 nm.
Representative Results
Electrospun mikrofabrikerede ringe blev fremstillet ved hjælp af en kombination af microstereolithography og electrospinning (figur 1 og 2). PEGDA ringe af forskellige størrelser blev fremstillet ved hjælp microstereolithography (figur 3); denne teknik gør det muligt for fabrikation strukturer i størrelsesordenen cm og den samtidige inkorporering af microfeatures. I dette tilfælde ringe af diametre spænder fra 1,2 til 1,6 cm, der indeholder mikrolommer af 350-500 um blev fremstillet (Figur 4).
Det var i form af produktion, sterilisering og emballering af materialer til fremtidig klinisk brug konstateret, at vakuumpakning i medicinsk kvalitet poser væsentligt forbedret evnen til at opnå lang opbevaring af PLGA membraner (figur 5) sigt; anvendelsen af en medicinsk kvalitet pose (PET / Folie / LDPE) med en tykkelse på 0,12 mm tilladt os at opnå en længere holdbarhed. Dette blev undersøgt ved at sende membrAnes til vore samarbejdspartnere i Indien og membraner blev opbevaret i en periode på flere måneder ved -20 ° C, ved stuetemperatur og ved 37 ° C i bevidst fugtige forhold (en fugtig inkubator). Figur 5 viser, at anvendelse af de bevidst provokerende betingelser for opbevaring ved 37 ° C under fugtige forhold, var membranerne kun stabile i cirka en måned under ikke-vakuumpakket forhold, men Opnået 3 måneders opbevaring under vakuumpakkede betingelser (figur 5 og tabel 1).
Tabel 1 viser en forbedring i opbevaringsbetingelser, der kan opnås, selv under betingelser, udvalgt til at være befordrende for vandoptagelse og fiber hævelse, hvis man er opmærksom på valget af posen anvendes.
Ringene støttede celleudvækst fra limbal eksplantater i forskellige forhold (i) ringe frisk gjort, og (ii) Ringe lagret i 6 måneder (Figur 6). Celleoverførsel blev opnået efter 4 uger, når placing PLGA membraner på 3D sårede modeller. Celler voksede ud fra vævseksplantater anbragt på membranerne skabe et nyt epitel på den tidligere blottede cornea (figur 7). Positive (hornhinder uden behandling) og negative kontroller (sårede hornhinder) blev også opretholdt i kultur for de samme perioder. De negative kontroller bekræftede manglen på dannelse af en ny epitel i fravær af eventuelle tilsatte celler. Immunocytokemi viste, at celler, der vokser ud fra eksplantaterne var hornhindeepitelceller da de var positive for hornhindens differentiering markør CK3 (figur 7E).
Figur 1. Skematisk af microstereolithography oprettet for oprettelsen af PEGDA ringe.
her.within-page = "altid"> 
Figur 2. Skematisk af elektrospinningsprocessen hjælp PEGDA Mikrofabrikerede ringe som en skabelon.
Figur 3. (A) viser et eksempel på en statisk collector (elektropletteret aluminiumplade PEGDA ringe) til spinding af mikrofabrikerede PLGA membraner. (B) og (E) viser forskellige electrospun måtter bliver skrællet fra statiske samlere. (C) viser PEGDA skabeloner af forskellige størrelser fremhæver alsidighed hjælp microstereolithography til fremstilling af den underliggende overflade. (D) viser en PLGA mikrofremstillet replika./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. SEM billede af en PEGDA ring med en hestesko microfeature (A); høj forstørrelse SEM billede af en mikrofabrikeret lomme (B). Fase kontrast billede af en PLGA ring med en hestesko microfeature (C); høj forstørrelse fase kontrast billede af en mikrofabrikeret lomme (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Effekt af temperatur og tid på opbevaring af vakuum og ikke-vakuumpakket PLGA (50/50) membraner (44 kg / mol) med mikrofremstillet ringe over 6 måneder. Membran integritet blev scoret som fuldt intakte fibre (+++), nogle fibre hævelse (++), fibre sammenfletningen (+) eller ingen intakte fibre (-). SEM billeder og tre tørremidler (silica appelsin, kobolt (II) chlorid, og kobber (II) sulfat) viser ingen ændringer i fiber integritet eller fugtighed. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Fluorescensbilleder viser udvækst af LEC fra limbal eksplantater på frisklavede bionedbrydelige PLGA ringe (A, B) og ringe efter 6 måneders opbevaring ved -20° C (C, D). Billeder (A) og (B) svarer til celler farvet med DAPI (blå) og propidiumiodid (rød) hhv. Billede b er en ortogonal visning fra en konfokal z-stak af eksplantatet anbragt på en mikrofabrikeret lomme. Billeder (C) og (D) viser positiv farvning for P63 (grøn). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. (A) viser en kanin såret hornhinde model med en ring stillads og vævseksplantater placeret på stilladset, som tidligere var belagt med fibrinklæber (B) og (C) er positive og negative kontroller.; den positive kontrol er en frisk rabbiner t. hornhinden og den negative kontrol en hornhinde, hvor epitelet blev bevidst fjernes (den negative kontrol var også dyrket i 4 uger) (D) er en H & E billede af en manipuleret væv hornhinden efter 4 uger i kultur; Figuren viser den nye multi-lag epitel dannes af cellerne, der kommer ud fra eksplantaterne placeret på nicher (E) er et immunocytokemi billede, der viser celleudvækst fra en limbale eksplantat.; kerner farves med DAPI (blå) og cellerne viser positiv farvning for cytokeratin 3, en hornhinde differentiering markør (grøn). Klik her for at se en større version af dette tal.
| PLGA (50:50) | x; "> Fiber integritet membraner lagret ved 37 ° C fugtigt|||||||
| Dag 0 | Måned 1 | Måned 2 | Måned 3 | Måned 4 | Måned 5 | Måned 6 | |
| Ikke-vakuumpakket | +++ | - | - | - | - | - | - |
| Støvsuget (Bag A) (PE, PA Composite) Tykkelse: 0,14 mm | +++ | + | - | 64px; "> -- | - | - | |
| Støvsuget (Bag B) (PET / Folie / LDPE) Tykkelse: 0,75 mm | +++ | +++ | +++ | + | - | - | - |
Tabel 1. Effekt af vakuum og anderledes opbevaring poser på integriteten af PLGA (50/50) membraner (44 kg / mol) undersøgt over 6 måneders lagring. Membran integritet blev scoret som fuldt intakte fibre (+++), nogle fiber hævelse (++) fiber sammenlægning (+) eller ingen intakte fibre (-).
Discussion
Denne undersøgelse beskriver (a) en teknik til fremstilling af electrospun membraner indeholdende microfeatures i dem og (b), hvordan man forbereder sådanne membraner til klinisk brug ved vakuum pakning, gammastråling og derefter opbevaring før brug. I denne særlige anvendelse har vi udviklet PLGA membraner indeholdende mikrolommer der efterligner de fysiske træk ved de limbal stamcelle nicher. Formålene med denne undersøgelse er (i) at beskrive metoder til at give læserne med den nødvendige viden til at designe og fabrikere stilladser indeholder microfeatures til forskning i bidrag stamceller nicher til vævsregenerering og (ii) at give læseren en bedre forståelse af, hvordan man opbevarer electrospun stilladser i lange perioder.
Med hensyn til klinisk anvendelse, oplagring af ringen membraner er af afgørende betydning. I dette arbejde blev nedbrydningen af ringen undersøgt over en periode på 6 måneder. Nedbrydning afmembraner er drevet ved hydrolyse ved bare at holde membranerne fugtfri processen standset. Blackwood et al. Rapporterede, at ved at variere forholdet PLA PGA nedbrydningen af membranen ændrer 32. Denne undersøgelse viste også, at ved at øge mængden af PGA nedbrydningshastigheden af electrospun membraner forøget in vivo 22. Her er det blevet vist, at med vakuum pakning membranerne sammen med nogle tørremiddel og bestråle dem og opbevare dem ved lave temperaturer for 6 måneder, er der ingen ændring i fiberen integritet og nedbrydning. På nuværende tidspunkt, 6 måneder er så vidt vi har studeret med disse membraner indeholdende mikrolommer men lagring af data i 1 år er blevet rapporteret på almindeligt electrospun membraner ved -20 ° C 22 og vi har nu upublicerede data for deres opbevaring ved -20 ° C i 2 år uden tegn på nedbrydning. Således langtidsopbevaring det ville blive anbefalet at gemme dem tørre ved -206, C, men det er muligt at opbevare dem ved stuetemperatur, selv i Indien i mindst 6 måneder (muligvis meget længere). Inddragelsen af en fugtighed indikator giver et let middel til at kontrollere, at emballagen har holdt membraner tørre i hvilket tilfælde de vil være egnet til formålet.
Overførsel af celler fra disse ringe til 3D hornhinde-modeller blev vist, når du placerer limbal eksplantater indenfor mikrolommer. Denne gruppe nylig rapporteret overførsel af celler på en in vitro-kanin cornea model ved at placere eksplantater på almindeligt PLGA membraner (membraner uden ringstrukturer) 24. Brug af nuværende mikrofabrikerede stilladser celleoverførsel er taget et skridt videre, da vi kan nu specifikt lokalisere vævseksplantater indenfor microfeatures. Evnen til at placere eksplantaterne direkte i nicherne giver også kirurgen at anvende membranerne direkte i operationsstue undgå behovet for en renrum først udvide limbal stamceller. Selv om dette stykke arbejdk har været fokuseret på udviklingen af anordninger til hornhinde sygdom, kan denne mikrofabrikation teknologien også anvendes til udvikling af udstyr til mange andre applikationer. Det fremtidige arbejde vil undersøge fremstillingen af konstruktioner for regenerering af andre væv, såsom hud og knogle.
Selv om udformningen og den indledende fremstilling af PEGDA mikrostrukturer kan være meget tidskrævende, når fabrikeret strukturer kan genanvendes mange gange uden nedbrydning. Derfor kan den efterfølgende fremstilling af PLGA mikrostruktureret bionedbrydelige membraner ved electrospinning udføres på en sammenlignelig sats på produktion af glatte (»ustrukturerede«) membraner efter montering af solfangeren. Selv om vi i dette arbejde har brugt microstereolithography til fremstilling formene, kan andre fremstillingsmetoder såsom 3D-print eller sprøjtestøbning også anvendes. Følgelig kunne den underliggende skimmel være lavet af andre polymerer eller metaller i stedet for PEGDA. Som sådan denne teknik er meget alsidig og forskerne kan nemt tilpasse den metode, der passer til deres egne behov og faciliteter.
Den interne microstereolithography set-up, der anvendes i denne undersøgelse vil ikke tillade fremstillingen af konstruktioner med funktioner under 30 um; dette er ikke en begrænsning for den corneale anvendelse her beskrevet, men det kan være af afgørende betydning i udformningen af andre modeller. I så fald andre teknikker såsom 2 foton polymerisation (2PP) kunne være af interesse dog elektrospinningsprocessen teknik kan ikke tillade reproduktion af strukturer på sub-micron skala (dette er i øjeblikket ved at blive undersøgt af vores gruppe).
Kritiske trin i fremstillingsprocessen er (i) Undgå overcuring af PEGDA skabeloner, som kan kontrolleres ved at justere tid og mængder af fotoinitieringsmiddel. (Ii) Styring Electrospinning betingelser, såsom temperatur og fugtighed. (Iii) Lagring på passende electrospun ring membraner ved hjælp af vakuum-pakning og tørremidler.
Sammenfattende vi ved at placere limbal vævseksplantater inden microfeatures af membranen har vist celleudgroning fra eksplantaterne på nicher, overførsel celle på en kanin sårede hornhinde og efterfølgende re-epitelisering af hornhinden. Nedbrydningen af de membraner, der er lagret ved forskellige temperaturer er også blevet undersøgt, og en emballage protokol, som tillader langtidslagring af membraner er blevet udviklet, som er nødvendigt at udvikle membraner til klinisk brug.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly (lactic-co-glycolic acid) | Purac | PDLG5004 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabilizer |
| Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
| 473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
| Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250 g/mol, 500 ml |
| DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
| Ham’s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
| Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
| EGF | R&D | 236-EG-200 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
| Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
| DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
| p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
| CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
| Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
| Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
| Gamma- irradiation (Sterilization) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40 KGy | ||
| Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
| Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
| Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
| Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
| Andrew James Vacuum Sealer rolls 28 cm x 40 meter rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | ||
| Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | ||
| Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | 3% |
References
- Ambati, B. K., et al. Corneal avascularity is due to soluble VEGF receptor-1. Nature. 443, 993-997 (2006).
- Reinach, P., Capó-Aponte, J., Mergler, S., Pokorny, K. Ophthalmic Diseases And Drug DeliveryOphthalmology Research. Ch 2, Ocular Transporters. Tombran-Tin, J., Barnstable, C. J. 2, Humana Press. 17-46 (2008).
- Kinoshita, S., et al. Characteristics of the Human Ocular Surface Epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 20, 639-673 (2001).
- Fatt, I., Bieber, M. T. The steady-state distribution of oxygen and carbon dioxide in the in vivo cornea: I. The open eye in air and the closed eye. Experimental Eye Research. 7, 103-112 (1968).
- Shortt, A. J., et al. Characterization of the Limbal Epithelial Stem Cell Niche: Novel Imaging Techniques Permit In Vivo Observation and Targeted Biopsy of Limbal Epithelial Stem Cells. STEM CELLS. 25, 1402-1409 (2007).
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. British Journal of Ophthalmology. 89, 529-532 (2005).
- Thoft, R. A., Friend, J. The X, Y, Z hypothesis of corneal epithelial maintenance. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 24, 1442-1443 (1983).
- Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. Journal of Cell Science. 111, 2867-2875 (1998).
- Djalilian, A., et al. Down-regulation of Notch signaling during corneal epithelial proliferation. Molecular Vision. 14, 1041-1049 (2008).
- Dua, H. S., Azuara-Blanco, A. Limbal Stem Cells of the Corneal Epithelium. Survey of Ophthalmology. Survey. 44, 415-425 (2000).
- Dravida, S., et al. A biomimetic scaffold for culturing limbal stem cells: a promising alternative for clinical transplantation. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2, 263-271 (2008).
- Rama, P., et al. Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration. New England Journal of Medicine. 363, 147-155 (2010).
- Koizumi, N., Inatomi, T., Suzuki, T., Sotozono, C., Kinoshita, S. Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders. Ophthalmology. 108, 1569-1574 (2001).
- Fatima, A., et al. Technique of cultivating limbal derived corneal epithelium on human amniotic membrane for clinical transplantation. Journal of Postgraduate Medicine. 52, 257-261 (2006).
- Nubile, M., et al. Amniotic membrane transplantation for the management of corneal epithelial defects: an in vivo confocal microscopic study. British Journal of Ophthalmology. 92, 54-60 (2008).
- Nubile, M., et al. In Vivo Analysis of Stromal Integration of Multilayer Amniotic Membrane Transplantation in Corneal Ulcers. American Journal of Ophthalmology. 151, 809-822 (2011).
- Dua, H. S. Amniotic membrane transplantation. British Journal of Ophthalmology. 83, 748-752 (1999).
- Gicquel, J., et al. Epidermal Growth Factor Variations in Amniotic Membrane Used for Ex Vivo Tissue Constructs. Tissue Engineering Part A. 15, 1919-1927 (2009).
- Connon, C. J., et al. The variation in transparency of amniotic membrane used in ocular surface regeneration. British Journal of Ophthalmology. 94, 1057-1061 (2010).
- Hopkinson, A., McIntosh, R. S., Tighe, P. J., James, D. K., Dua, H. S. Amniotic Membrane for Ocular Surface Reconstruction: Donor Variations and the Effect of Handling on TGF-β Content. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 47, 4316-4322 (2006).
- Sitalakshmi, G., et al. Ex Vivo Cultivation of Corneal Limbal Epithelial Cells in a Thermoreversible Polymer (Mebiol Gel) and Their Transplantation in Rabbits: An Animal Model. Tissue Engineering Part A. 15, 407-415 (2008).
- Ortega, I., Deshpande, P., Gill, A. A., MacNeil, S., Claeyssens, F. Development of a microfabricated artificial limbus with micropockets for cell delivery to the cornea. Biofabrication. 5, (2013).
- Deshpande, P., et al. Using poly(lactide-co-glycolide) electrospun scaffolds to deliver cultured epithelial cells to the cornea. Regenerative Medicine. 5, 395-401 (2010).
- Deshpande, P., et al. Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants. Biomaterials. 34, 5088-5106 (2013).
- Wheeldon, I., Ahari, A. F., Khademhosseini, A. Microengineering Hydrogels for Stem Cell Bioengineering and Tissue Regeneration. Charlottesv Va. 15, 440-448 (2010).
- Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. A microwell array system for stem cell culture. Biomaterials. 29, 752-763 (2008).
- Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Langer, R., Peppas, N. A. Bioinspired Materials for Controlling Stem Cell Fate. Accounts Chem. Res. 43, 419-428 (2010).
- Raimondi, M. T., et al. Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing. Acta Biomaterialia. 9, 4579-4584 (2013).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat Meth. 8, 949-955 (2011).
- Truckenmüller, R., et al. Fabrication of cell container arrays with overlaid surface topographies. Biomedical Microdevices. 14, 95-107 (2012).
- Ortega, Í, Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair. Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).
- Blackwood, K. A., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).
