Introduction
מודלים עכבריים כבר נוצלו בהרחבה בחקר מוח 1. מתאמי גנוטיפ, פנוטיפ נחקרו במוח עכבר וחולדה על ידי לימוד ביטוי גנים בRNA ו / או רמות חלבון מצד האחד, ופנוטיפים מורפולוגיים, תפקודיים, אלקטרו ו / או התנהגותי על 2-6 האחר. עם זאת, כדי להבין את המנגנונים המקשרים פנוטיפ לגנוטיפ לחלוטין, זה הכרחי כדי לחקור את האירועים המולקולריים במורד הזרם של ביטוי חלבון, כלומר. חילוף החומרים של מצעים ביוכימיים שעליו אנזימים לפעול 7. דרישה זו הובילה, על 10 עד 15 השנים האחרונות, לרנסנס של מחקר מטבולים בענפים רבים של 8,9 ביולוגיה. בעוד שמחקרים מטבוליים קלאסיים פעמים רבות מתמקדים בפרטים של מסלולים ספציפיים, גישת metabolomic החדשה מיועדת לחקירה כוללנית של הפרופיל המטבולי הגלובלי של הרקמה תחת שיקול.אחת תוצאות של תפיסה זו היא צורך ברור לכלים אנליטיים שלמזער את ההטיה לכיוון מסלולי מטבוליים ספציפיים ו / או סוגי תרכובות. עם זאת, assay ביוכימיים קלאסי מבוסס על תגובה כימית מסוימת של אנליטי ספציפי שצריך להיות מוגדרים לפני assay מבוצע. בניגוד לכך, טכניקות ספקטרוסקופיות כגון תהודה מגנטית ספקטרוסקופיה הגרעינית (NMR) וספקטרומטריית מסה (MS) (i) מבוססות על מאפיינים מסוימים מולקולריים (פיזיים) של תרכובות ביוכימיות, כל אחד מהם מעורר אותות אחד או כמה ברורים בספקטרום זוהה במהלך ניסוי אחד; וכן (ii) לזהות מספר רב של תרכובות שונות לכל ניסוי.
לפיכך, כל ספקטרום מכיל מידע המשולב של מגוון רחב של מטבוליטים כל. מסיבה זו, שיטות ספקטרוסקופיות הם כלים נאותים לmetabolomics, כמו שאף בחירה לפני צריכה להיעשות לגבי אופי אנליטי כדי להימדד 8
למרות ספקטרוסקופיה NMR וMS ניתן להשתמש לסירוגין לניתוח מטבוליטים רבים, כל שיטה הוא בעל יתרונות וחסרונות לאחרונה כי נבדקו 10 ספציפיים. בקצרה, ספקטרוסקופיה NMR יכולה בדרך כלל להתבצע מתמציות גולמיים ואינה דורשת הפרדת chromatographic של תרכובות מדגם לפני הניתוח. בניגוד לכך, MS עובד עם גז או כרומטוגרפיה נוזלית (GC או LC) הפרדה, למעט התפתחויות מסוימות האחרונות כגון הדמיה ספקטרומטריית מסה. בכמה מקרים מיוחדים, כגון הניתוח של סוכרים, הפרדת LC עשויה להיות הכרח עבור ספקטרוסקופיה NMR, כמו גם, כי קווי התהודה של סוכרים שונים חופפים באופן משמעותי בפרוטון (1 H) NMR ספקטרום. אף על פי כן, ספקטרוסקופיה H NMR 1 ללא chrהפרדת omatographic נשארה השיטה הפופולרית ביותר, כמעט אוניברסלי השימושית metabolomic NMR. באופן כללי, הכנת מדגם היא יותר זמן רב ומורכב עבור MS מאשר לספקטרוסקופיה NMR. בעיות חמורות בשל השפעות מטריצה הן הרבה פחות נפוצות בספקטרוסקופיה NMR מאשר בטרשת הנפוצה שבו הם עלולים להוביל לאותות משמעותי מוחלשים. quantitation המטבוליט ניתן להשיג גם עם שיטה. עם זאת, תרכובות סטנדרטיים מרובות נדרשות עבור MS עקב שינויים בהשפעות מטריצה ויעילות יינון בין מטבוליטים. לעומת זאת, רק אחד סטנדרטית לדגימה דרושה לניתוח ספקטרוסקופיות NMR כי בתנאי מדידה מתאימים, השיטה השנייה היא מהותית בזכות כמותיים לתגובת NMR ליניארי בקפדנות על ידי הגרעינים שנצפו. חסרון עיקרי של NMR הוא הרגישות הנמוכה יחסית שלה. MS, בLC-MS בפרט, הוא רגיש יותר מתמ"ג על ידי צווים שונים של גודל; מסיבה זו, הטרשת הנפוצה היא להיות מועדפת על פני NMR לניתוח של תרכובות המתרחשות בריכוזים נמוכים מאוד. מצד השני, הטבע הורסות של ניסוי NMR הוא יתרון ברור על פני MS; בדרך זו, ניתן לבצע NMR שוב ושוב על אותו המדגם, למשל, לגרעיני NMR פעיל שונים כגון 1 H, זרחן 31 ב( 31 בP), פחמן -13 (C 13), פלואור-19 (19 F) וכו '., כמו שאף חומר הנצרך על ידי NMR בניגוד למדידות MS.
יכולים להיות מועסק NMR וMS הן במצבים שונים, כל אחד מהם להיות אופטימלי לזיהוי של תרכובות עם מאפיינים כימיים מסוימים. לדוגמא, ביום 31 בP NMR הוא לעתים קרובות מתאים יותר מ1 H NMR לניתוח של תרכובות פוספורילציה מרוכזות במתינות, אם כי מטבוליטים כמעט כל פוספורילציה גם מכילים פרוטונים. עם זאת, 1 אותות H NMR שלהם עשויים להיות מוסתרים על ידי 1 אותות H NMR מתרכובות אחרות, שאינה פוספורילציה, ואילו האחרוניםברור שאתה לא לגרום לאותות רקע ביום 31 בספקטרום P NMR. במצב אנלוגי, 19 ניתוח F NMR יש להעדיף לתרכובות פלואור, למשל, תרופות פלואור (אין אותות רקע ממטבוליטים אנדוגני), ואילו במקרה המיוחד של 13 C NMR הוא עניין כמעט אך ורק אם גורלו של 13 C- מבשרי חילוף חומרים אקסוגניים שכותרת צריך להיות אחרי, בשל השפע הטבעי הנמוך מאוד של איזוטופ 13 C (בערך 1%). ספקטרומטרים המוניים רבים לעבוד במצב או יונים שליליים או במצב יון חיובי. לכן, חשוב לדעת מראש את הניתוח אם היונים כדי לצפות חיוב או לשלילה יחויבו. אנו מתמקדים כאן בפרוטוקול לניתוח metabolome רקמת המוח על ידי H 1 ויום 31 בספקטרוסקופיה P NMR כי שיטה זו מניבה מספר גדול של ריכוזי המטבוליט חשובים בעלות נמוכה במונחים של זמן (i) דרוש למדגם הכנהnd (ii) מאמץ הנדרש כדי לכמת את המטבוליט. ניתן לבצע את כל הניסויים באמצעות הציוד של מעבדה כימיה רטובה סטנדרטית ומתקן ספקטרוסקופיה NMR ברזולוציה גבוהה. דרישות נוספות המתוארים בסעיף הפרוטוקול להלן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: מסר של בעלי החיים אתיקה
מחקרים בבעלי חיים על חולדות ואחרי ההנחיות תקפות בצרפת, ואושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית (# 40.04, אוניברסיטת בית הספר לרפואת Aix-Marseille, מרסיי, צרפת).
.1 קצירה והקפאת מוח חולדה
- הכן פריטים דרושים: חנקן נוזלי (2liq N.) בדיואר כי הוא גדול מספיק כדי לשמור על מהדק הקפאה (לפחות 2-3 L נפח); הרדמה (למשל, isoflurane, או קטמין / xylazine); תא הרדמה; כלים סטריליים לנתיחה: מספריים כירורגיות, אזמל, מלקחיים; מגבוני רקמה ובקבוק עם ניקוי אלכוהול (אתנול); מחטים (25 G); 1 מ"ל ו10 מ"ל מזרקים. גיליונות אלומיניום לייבל (בערך 10 x 10 סנטימטר) עם סרט דביק. השתמש בגיליונות לעטוף את מוח של חולדה הקפאה-הדק בודדת.
הערה: תמיד ללבוש כפפות מגן ומשקפי מגן משקפי מגן או מסיכה בעת טיפול חנקן נוזלי! - מלא דיואר עם 2liq N. ומקום חינםמהדק זיע בדיואר. ודא את כמות 2liq N בדיואר מספיק לנוהלי הקפאת מהדק חוזרים ונשנים (כמה ליטרים; הסכום של 2liq N מתאדה במהלך כל הקפאה-הידוק תלוי בגודל של המהדק).
- הרדימי בעלי חיים (למשל, על ידי isoflurane, או על ידי הזרקת intraperitoneal של קטמין / תערובת xylazine). המשך להמתת חסד על ידי לנקב לב כדי למנוע דימום כאשר הקרקפת מוסרת וגולגולת נפתחה. צעדים 1.4-1.7 להלן מתארים הליך סטנדרטי זה.
הערה: בפרוטוקולים מיוחדים הדורשים שימור מרבי של מטבוליטים גלוקוז ואנרגיה גבוהה, עכברוש הקרבה על ידי המוח של החיה המורדמת עם N הקפאה-משפך 2liq 11 לאחר הנסיגה של הקרקפת. לאחר מכן, לנתח מוח מהגולגולת מתחת 2liq N לסירוגין כדי למזער את חילוף החומרים שלאחר המוות 12. - להרטיב את הראש של חולדה עם ניקוי אלכוהול. השתמש במספרי כירורגיות לrem (i)קרקפת אובה, וכן (ii) גולגולת פתוחה לאורך תפרי גולגולת.
- שימוש במלקחיים כדי לפתוח גולגולת נוספת, וכדי להסיר כל המוח מתחת לגולגולת הפתוחה, מיצוב הראש במהופך. להסיר במהירות כל עקבות גלויות של דם באמצעות מגבוני רקמה. אם אונות המוח הן מטבולית ומורפולוגית סימטריות, זה נוח להשתמש באחד מהחצאים המוח לניתוח מטבולים לאחר הפרדתו מחץ הכדור השני על ידי חתך עם האזמל. במידת הצורך, להשתמש בחץ הכדור שנותר ללימודים אחרים במוח כגון היסטולוגיה.
- להסיר במהירות הקפאת מהדק מ2liq N -filled דיואר, למקם את מוח חולדה שלם או חצי על פני השטח פנימיים אחד, מהדק ומייד להכניס להקפאת מהדק לתוך 2liq N -filled דיואר תוך החזקת מהדק דחוסה בחוזקה. ודא שצעדים 1.3-1.6 כבר לא ייקחו יותר מ60 שניות.
- לאחר מהדק הקפאת 1-2 להסיר דקות מדיואר, המהדק פתוח, לשחרר את הרקמה קפוא מוח ממהדק, ולעטוףרקמה קפוא בגיליון אלומיניום שכותרתו כראוי (ראה 1.1 לעיל). ודא שהתווית היא קריא ונשאר במקומו לאחר המדגם עטוף. במהירות למקום מדגם עטוף ב2liq N. לבצע את ההליך כולו במהירות אפשרית, כדי למנוע הפשרת רקמת מוח קפוא.
- אחסן מדגם קפוא ב2liq N או במקפיא ב-80 ° C עד מיצוי המטבוליט.
הערה: בכל פעם מדגם ביולוגי הוא להיות מאוחסן במשך יותר משנה, אחסון בטמפרטורת 2liq N הוא להיות מועדפת על פני -80 מעלות צלזיוס. זה חל גם על השארית של פרוטוקול זה.
2 הכנת המטבוליט הפקת הנוהל
- הכן homogenizer רקמות ומבחנות התאמה (לדוגמא, קוטר 10 מ"מ פנימי, בהתאם לקוטר של פיר homogenizer, בדרך כלל עשוי מפלסטיק). השתמש homogenizers חשמלי ולא homogenizers מונע באופן ידני (ומטחנות רקמות). טרוםלקלף vortexer ואיזון מעבדה.
- הכן דלי מלא בקרח כתוש. שמור כל כמויות מספיקות של מתנול, כלורופורם ומים על קרח (4 מ"ל כל אחד לרקמת מוח הקפוא 250-350 מ"ג).
- הכן טפטפות העברה ובקבוקונים.
- הכן בקבוקוני זכוכית (≥20 מ"ל נפח) עם פקקי הברגה ומניחים על קרח (בקבוקון אחד לכל תמצית רקמה). בורג Fit כובעים עם septa טפלון עמיד לכלורופורם.
- הכן 5 מ"ל טפטפות פלסטיק לבקבוק מתנול ומים, וטפטפות זכוכית או מזרקים המילטון לבקבוק כלורופורם. הכן טפטפות נוספת פלסטיק (5 או 10 מ"ל נפח) להעברת תערובות של homogenate ומתנול רקמה.
- ודא שכל כלי הזכוכית היא שטף ביסודיות עם מים מזוקקים ומיובשת היטב לפני השימוש כדי להסיר עקבות של זיהומים, בעיקר formate ויצטט NMR-לזיהוי.
- מלא מרגמה פורצלן עם 2liq N, העלי פורצלן מקום במרגמה ולמלא עם 2L NIQ. חנקן יתאדה עד הטמפרטורה של מכתש ועלי היא נמוכה מספיק. שמור כמות קטנה של 2liq N במרגמה.
.3 הפקת מטבוליטים
- הסר דגימת רקמת המוח קפוא מאחסון (טנק 2liq N או במקפיא -80 מעלות צלזיוס). לאחר מכן, להעביר באופן מיידי דגימת רקמת מרגמות באופן חלקי מלא 2liq N.
- השתמש העלי -cold 2liq N לשבור את רקמת המוח הקפואה לחתיכות קטנות יותר, כי בקלות להשתלב במבחנות המשמשות ליצירת הומוגניות רקמה. כדי למנוע חתיכות של רקמה קפוא מלהיות מוקרן מהמרגמה בתהליך, לשבור את הרקמה כשהוא עדיין עטוף ברדיד אלומיניום. אל תשחק את הרקמה קפוא לאבקה כמו זה יגרום העברה למבחנה (סיכון מוגבר לעיבוי מים) יותר קשה. חשוב: לאורך כל ההליך, להוסיף 2liq N מרגמות לפי צורך כדי לשמור על המדגם הקפוא עמוק.
- מיקס שלחתיכות קניון של רקמת מוח קפוא ביסודיות, שוקלות את 250-350 מ"ג ולהעביר למבחנה מלאה במתנול קר כקרח (4 מ"ל לרקמת מוח 250-350 מ"ג). כל חתיכות של רקמה קפוא זמן מתווספות, homogenize אלה מייד עם homogenizer הרקמות.
הערה: השלם כל הליך זה במהירות כדי למנוע (i) עיבוי משמעותי של מים על המדגם שיוביל להערכת יתר של משקל המדגם, וכן (ii) חימום והפשרה של המדגם. פיסות רקמת אדם צריכה להיות במצב קפוא בתחילתו של תהליך יצירת הומוגניות. - אחרי חתיכת מדגם מוח חולדה קפוא האחרונה נוספה למבחנה, ומעוורים, להעביר את homogenate לבקבוקון זכוכית נפח ≥20 מ"ל, כובע בורג קרוב ולתת לעמוד על קרח במשך 15 דקות. אם הנפח של המבחנה הוא לא גדול מספיק עבור מתנול מ"ל ≥4, להשתמש קטן מתנול נפח לhomogenize חלק מרקמת המוח הקפוא, מעביר את התערובת לבקבוקון הזכוכית ולהמשיך מאחד את חתיכות רקמה שיורית עם מתנול הטרי. ודא הכולל מתנול הנפח 4 מ"ל ל250-350 רקמת מוח מ"ג.
- להוסיף את אותו הנפח של כלורופורם קר כקרח (כלומר, 4 מ"ל ל250-350 רקמת מוח מ"ג) לhomogenate, מערבולת ביסודיות ולתת לעמוד על קרח במשך 15 דקות.
הערה: השתמש תמיד במכסת מנוע כימי מאוורר בעת טיפול ממסים נדיפים, בעיקר כלורופורם! - להוסיף את אותו הנפח של מים (כלומר, 4 מ"ל ל250-350 רקמת מוח מ"ג) לhomogenate, מערבולת ביסודיות ולתת לעמוד ב-20 לילה C °.
.4 הכנת הפרדת שלב ואידוי ממס
- הכן צנטריפוגות הקרה (4 ° C, 13,000 XG ב רדיוס מרבי) וצינורות צנטריפוגה. ודא שהאחרונים הם ≥20 מ"ל נפח, עמיד לכלורופורם, ויכולים לעמוד בכוחות צנטריפוגליים של 13,000 x גרם. השתמש בצינורות צנטריפוגה זכוכית ייעודיים אבל לשטוף (כמו כל כלי הזכוכית) עם מים מזוקקים להיותשימוש קדמי (ראה 2.3).
- הכן טפטפות שטוף היטב פסטר זכוכית וpropipettor מתאים (הנורה, משאבה ידנית פיפטה, סיוע / pipettor פיפטה האוטומטית, וכו '.).
- הכן שני צינורות נוספים שטוף היטב (≥15 מ"ל נפח) לדגימה מוח, שאחד מהם צריך להיות עמיד לכלורופורם (עשוי מזכוכית או הטפלון), האחר אחד למתנול (עשוי מפלסטיק עמיד למתנול, או זכוכית).
- הכן מנגנון אידוי ממס (זמין מסחרי או homebuilt). ודא שמכשיר זה מספק זרם דק מבוקר של גז חנקן יבש שמופנה על פני השטח של פתרון תמצית מכיל ממסים נדיפים (מתנול, כלורופורם).
- הכן שני מגשים נוספים או דליים מלאים בקרח: אחד לתחבורת מדגם על קרח, ועוד אחד לשמירת דגימות קרות במהלך תהליך האידוי.
- הכן lyophilizer (להקפיא מייבש) וחומרים הדרושים לlyophilization: (i) אחד 50צינור מ"ל צנטריפוגות או ואקום עגול בקבוק תחתון לתמצית, וכן (ii) 2liq N להקפיא את השלב המימית של דגימות (L ≤0.3 לדגימה). אם נעשה שימוש בצינור צנטריפוגות, גם להכין רחב צוואר בקבוק מסנן האבק מתאים לlyophilizer.
.5 הפרדת שלב ואידוי ממס
- להפרדה פאזות המלאה, להעביר את homogenate רקמת מתנול / כלורופורם / מים / המוח (ראה 3.6) לצינור כלורופורם עמיד צנטריפוגות (≥20 מ"ל נפח) ו צנטריפוגות ב XG 13,000 ו4 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
הערה: שני שלבים יהוו, מופרדים על ידי שכבה של חלבון זירז. השלב נמוך יותר (כבד יותר) מורכב ממתנול, כלורופורם ושומנים מומסים, ואילו השלב העליון (בהיר יותר) מורכב ממים, מתנול ומטבוליטים מסיסים במים מומסים. - השתמש בפיפטה פסטר להעביר את השלב העליון לצינור מתאים ≥15 מ"ל (פלסטיק עמיד למתנול, או זכוכית). שמור על ice.
- השתמש בפיפטה פסטר טרי להעביר את השלב נמוך יותר לצינור מתאים מ"ל ≥15 (זכוכית או טפלון). שמור על קרח.
- אחסן את השכבה של חלבון זירז ב -80 מעלות צלזיוס אם זה הוא לשמש לקביעת חלבון בסך הכל; או השלך אחר.
- שמור את הצינור עם שלב המים / מתנול (ראה 5.2) על קרח ולהתאדות מתנול על ידי הפניית זרם חנקן יבש על פני השטח של פתרון התמצית. לחלופין, בעדינות חנקן בועה דרך פתרון התמצית. לסיים את תהליך האידוי כאשר מבעבע חנקן כבר לא גורם להקטנת נפח בפתרון התמצית. בשלב זה, להמשיך בlyophilization (ראה 5.7), או להקפיא ולשמור מדגם ב -80 מעלות צלזיוס עם הצינור סגור (כובע בורג או Parafilm) עד מוכנה לlyophilization.
- מניחים את הצינור עם שלב מתנול / כלורופורם (ראה 5.3) על קרח ולהתאדות מתנול על ידי הפניית זרם חנקן יבש על surface של פתרון התמצית. כאשר כל הממס הוא התאדה, לסיים את התהליך ולשמור על המדגם ב -80 מעלות צלזיוס עם הצינור סגור (כובע בורג או Parafilm) עד מוכן לניתוח NMR.
- הכן שלב מימי לlyophilization
- לאחר סיום תהליך אידוי מתנול (ראה 5.5), להעביר את המדגם לצינור צנטריפוגות 50 מ"ל שטוף היטב (אם המדגם הוא קפוא, להפשיר לפני ההעברה). לחלופין, להעביר לואקום עגול בקבוק תחתון.
- להקפיא פתרון תמצית על ידי החלפת צינור צנטריפוגות (או בקבוק תחתון עגול) הוכנס באופן חלקי ב2liq N כך שהמשטח הפנימי של הצינור או הבקבוק מכוסה בהדרגה על ידי נוזל קפוא. הפוך 2liq לא N בטוח. יכול להיכנס לכלי הקיבול.
- כאשר כל הנוזלים הוא קפוא, לכסות את הצינור עם מכסה ניקב או כובע בורג כדי לאפשר האדים לברוח, ובמקום הצינור בבקבוק מסנן ואקום רחב צוואר.
- התחל lyophilization לאחר אתאצ'ינג הבקבוק או בקבוק להקפאת המייבש.
- לסיים את תהליך lyophilization כאשר המדגם הוא יבש לגמרי. שמור את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס בצינור סגור (עם מכסה הדוק!) עד המשמש לניתוח NMR.
הערה: בדרך כלל אין שעות יותר מ -24 נדרשת לlyophilization. ניתן lyophilized כמה דגימות בו זמנית, בהתאם לעיצוב של lyophilizer, ועל האם צינורות צנטריפוגה בבקבוקים רחב צוואר או צלוחיות תחתית עגולות המשמשים.
.6 הכנת דוגמאות NMR
- חנות מיובשת ותמציות lyophilized בטמפרטורה נמוכה מאוד (≤-80 ° C). להתמוסס Re lyophilizates להכנת דגימות NMR מייד לפני ניסוי NMR.
הערה: אחסון דגימות בפתרון ו / או בטמפרטורת החדר ליד עלולה לגרום להשפלת מדגם! - הכן פתרון מ"מ 200 מימיים chelating הסוכן, חומצת טרנס 1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic (CDTA) של, כדלקמן:
- מוסיף מים טהורים (לדוגמא, 20 מ"ל) לצינור מבחנה או צנטריפוגות, ולהוסיף את כמות אבקת CDTA צורך ליצור פתרון מ"מ 200.
הערה: חלק ניכר מCDTA לא יהיה מסיס, בגלל pH הוא נמוך מאוד מאז את טופס החומצה של CDTA שימש ולא מלח CDTA. - להוסיף בזהירות, צעד אחר צעד, הגדלת כמויות של אבקת CsOH לפתרון CDTA, ומערבולת ביסודיות לאחר כל ההוספה.
הערה: חלק CDTA המסיס יגדל עם הגדלת תכולת CsOH בתמיסה המימית. הימנע "overtitration", כלומר להוסיף פחות מסכום stoichiometric של CsOH לפתרון CDTA. - כאשר כמעט כל אבקת CDTA נמס, להתחיל למדוד pH לאחר כל הוספת CsOH וvortexing היסודי. לסיים בנוסף CsOH כאשר מגיע pH הסופי (טבלה 1).
הערה: בשלב זה, כל CDTA יפורק. השימוש בCs + כcounterion לCDTA הוא generהעדיף ברית על Na + או K +. Cs + היא חומצת לואיס רכה בשל הרדיוס היוני הגדול שלה, בניגוד לNa + K + ושיש לי רדיוס יוני קטן יותר והן חומצות קשות. כתוצאה מכך, Cs מתחמים + צורות עם פוספטים (בסיסים קשים) פחות בקלות מאשר לעשות Na + וK +. זהו יתרון עבור ספקטרוסקופיה NMR ביום 31 בP של מטבוליטים פוספורילציה משום complexation נוטה להגדיל linewidths NMR, בעיקר בתנאים של איטי לחילוף יוני ביניים.
- מוסיף מים טהורים (לדוגמא, 20 מ"ל) לצינור מבחנה או צנטריפוגות, ולהוסיף את כמות אבקת CDTA צורך ליצור פתרון מ"מ 200.
- ליום 31 בP NMR ניתוח של פוספוליפידים (PL), לפזר שומנים מיובשים (ראו 5.6) ב700 μl של תערובת ממס בהיקף של כלורופורם deuterated (CDCl 3), מתנול ופתרון CDTA מוכן כפי שתואר ב6.2 (5: 4: 1 יחס נפח). להעביר את המדגם לצינור microcentrifuge. השתמש ישירה עקירה (או חיובי עקירה) micropipette עם כלורופורם להתנגדטיפים נמלה בשני השלבים.
הערה: זכור כי שינוי כל אחד מהפרמטרים הבאים ישפיע על המראה (היסט כימי ורוחב קו) של ספקטרום NMR P PL 31 ב13-17:
יחס נפח (i) CDCl 3: פתרון CDTA: MeOH
(Ii) בסך הכל נפח ממס משמש
(Iii) pH של הרכיב המימית של הממס
(Iv) ריכוז CDTA של הרכיב המימית של הממס.
הערה: ב, כוונון עדין כללי של פרמטרים מדגם אלה (טבלת 1) הוא לא הכרחי, ויש לבצעו בזהירות רבה אם תרצה בכך במקרים מיוחדים. שינוי יחס הנפח בין ממסים בקלות תוצאות בהיווצרותה של מערכת המורכבת משני שלבים במקום שלב אחד הומוגני! המערכת חד השלב נמצאה להיות יותר מעשי מאשר מערכת שני שלבים ברוב היישומים 13,14. - ל1 ניתוח H NMR של מטבוליטים מסיסים במים, מתמוסס lyophilizate (ראה 5.8) ב 700 תחמוצת דאוטריום μl מלח נתרן של חומצת propionic-2,2,3,3-D4 (D 2 O) המכיל 3 (trimethylsilyl) (TSPd 4) בטווח millimolar (D 2 O המכיל 0.05% TSPd 4 זמינה באופן מסחרי) . להעביר את המדגם לצינור microcentrifuge.
- התאם את pH של תמיסת תמצית המימית וכתוצאה מכך ל7.3 על ידי הוספת כמויות קטנות (בערך 2 μl) של כלוריד דאוטריום (מת"ק) ופתרונות deuteroxide נתרן (NaOD). ראשית, תתחיל עם 0.02 N פתרונות מת"ק או NaOD. אם 2 או 3 שנוספו לאחר מכן לא גורם לשינוי רמת חומציות מספק, ימשיך עם 0.2 N פתרונות מת"ק או NaOD. היזהר שלא overtitrate.
הערה: הסכום הכולל של פתרון מת"ק או NaOD הדרוש תלויה בכמות של רקמת המוח שחולצה; שים לב ערך זה כדי לכמת את המטבוליט מדויק. ברוב המקרים הכרכים משולבים של פתרונות מת"ק וNaOD הוסיפו צריכים להיות כמעט זניחים (קרוב ל -1% מתמ"ג נפח דגימה).
- לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש בספקטרומטר multinuclear ברזולוציה גבוהה תמ"ג (≥9.4 עוצמת שדה טסלה, המקביל ל162 P MHz 31 ב, או 400 MHz תדרי תהודת H 1). חוץ סליל 31 בP, להבטיח כי הבדיקה ביום 31 בP NMR בעל סליל H 1 לצימוד פרוטון. ויסות טמפרטורת סט של הבדיקה NMR לערך היעד רצוי (בדרך כלל 25 ° C).
הערה: טמפרטורת Probe ייתכן שתהיה צורך 10-20 דקות לייצוב! - פתרון צנטריפוגה PL תמצית בצינור microcentrifuge (ראה 6.3) בשעה 4 מעלות צלזיוס ו11,000 XG למשך 30 דקות לספין למטה שאריות מוצקות במדגם. העבר את 600 μl של supernatant לצינור באיכות גבוהה תמ"ג (קוטר חיצוני 5 מ"מ).
- הכן גזע להכניס קואקסיאליים מתאים מלא ב20 methylenediphosphonate מ"מ מימית פתרון (MDP) בשעה pH 7.0 להתייחסות כימית משמרתולכמת. הנח עלון זה בצינור NMR מלא פתרון תמצית PL.
- התאם את צינור NMR עם הטווה המתאימה והעברה למגנט NMR. עכשיו לסובב את המדגם ב15-20 הרץ ולחכות עד שהמדגם מותאם לטמפרטורה שנקבע (בערך 10 דקות).
- למזער זהירות inhomogeneity שדה מגנטי על פני מדגם על ידי התאמה על ציר ומחוץ לציר זרמי סליל פחית 18.
- להגדיר פרמטרים לרכישת ספקטרום NMR לערכים אופטימליים, אשר עשוי להשתנות כפונקציה של עוצמת שדה המגנט (למערכת 9.4 T, ראה לוח 1 עבור ערכי פרמטרים מומלצים).
- מספר קבוע של עוברים לכל ניסוי (= NS).
- להגדיר NS כ 80 (משך זמן כולל של בערך רכישת נתונים 20 דקות) ולו רק הפרספקטיבה הנפוצה ביותר היא להיות ונרשמת עם דיוק (phosphatidylcholine (PtdCho), phosphatidylethanolamine (PtdEtn), plasmalogen ethanolamine).
- להגדיר NS כ 100-200 (משך זמן כולל של דרכישת אתא 1-2 hr) אם פרספקטיבה פחות המרוכזת להיות ונרשמת (אלקיל-acyl-phosphatidylcholine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, חומצת phosphatidic).
- להגדיר NS כ 1,500-2,000 (משך זמן כולל של רכישת נתונים 7-10 שעה; ניסוי הלילה) אם פרספקטיבה מאוד נמוך ריכוז יש ונרשמת, cardiolipin למשל מונו phosphatidylinositol וdiphosphates (PtdIP וPtdIP 2),, Lyso-הפרספקטיבה , אלקיל-acyl-phosphatidylethanolamine, ומדי פעם אחרות.
- לאחר סיום רכישת ספקטרום, ריקבון תהליך חופשי אינדוקציה (FID) באמצעות פרמטרים אופטימליים. הערכים של פרמטרים אלה משתנים כפונקציה של כוח שדה המגנטי, איכות פחית, ואות PL לכימות.
- כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר לטווח של קווי פרספקטיבה השלם, לחזור (לפחות שניים) נהלי סינון עיבוד באמצעות מספר רב שונים. השתמש בשיפור רזולוציה חזק לאותות חזקים חופפים, למשל., לPtdCho וPtdEtnאזורים.
- השתמש בסינון חזק (חלש או לא שיפור רזולוציה) לאותות חלשים.
- לסנן אותות חלשים מאוד ורחבים, בלי חפיפה משמעותית על ידי האפודיציה (למשל, LB = 3 הרץ) כדי להגדיל את יחס אות לרעש, לדוגמא PtdIP וPtdIP 2. ראה לוח 1 לפרמטרי עיבוד אופייניים.
- לכמת את השטח של כל אות PL ביחס לאזור תחת האות של מתחם ההתייחסות (MDP) באותו הספקטרום.
- לכייל את האות של מתחם ההתייחסות (MDP) בניסוי נפרד, באמצעות צינור NMR 5 מ"מ מלא בתרכובות זרחן ריכוז ידוע (i), (ii) את אותו גזע להכניס קואקסיאליים המשמש ביום 31 בניסויי P NMR PL ( לראות 7.3 ו7.9).
- לחשב ריכוזי PL פרטניים המבוסס על אזורים יחסי של אותות PL על היד אחת (ראה 7.9), ועל ערך כיול שהתקבל לMDP מלהוסיף קואקסיאליים מאידך (ראה 7.10). קח בחשבון שמספר גרעיני זרחן תורמים לאות תמ"ג ביום 31 בP מסוימת עשוי להשתנות כפונקציה של מוצא המולקולרי של אות ש.
הערה: אות MDP פוספונאט (בדרך כלל הפניה ל19.39 עמודים לדקה) מייצגת שני גרעיני זרחן, כפי שעושה אות פוספט cardiolipin. כל אותות NMR האחרים PL 31 בP זוהו בתמציות מוח מייצגים גרעין זרחן אחת כל אחת. - השתמש בתוכנת סטטיסטיקה לפי צורך כדי להשוות רמות PL מוח בין קבוצות של בעלי חיים.
.8 ביצועים של ניסוי 1 H NMR לניתוח נמסים במי מטבוליטים מוח
- ויסות טמפרטורת סט של הבדיקה 1 H NMR לערך היעד רצוי (בדרך כלל 25 ° C). ראו גם הדברים ב7.1.
- צנטריפוגה פתרון התמצית המימית בצינור microcentrifuge (ראה 6.5) בשעה 4 מעלות צלזיוס ו11,000XG למשך 30 דקות לספין למטה שאריות מוצקות במדגם. העבר את 600 μl של supernatant לצינור באיכות גבוהה תמ"ג (קוטר חיצוני 5 מ"מ).
- צינור NMR העברה למגנט NMR, פחית ופרמטרים שנקבעו ספקטרום NMR רכישה לערכים אופטימליים כפי שמוסבר ב7.4-7.6. ראה גם טבלה 1 לערכי פרמטרים מומלצים.
- הגדר את מספר העוברים לניסוי כ NS = 32 (משך זמן כולל של בערך רכישת נתונים 13 דקות). כדי להשיג יחסי אות לרעש טובים לאותות חלשים מאוד, בעיקר באזור ארומטי, להשתמש NS = 64 (משך זמן כולל של בערך רכישת נתונים 26 דקות) או יותר.
- לאחר סיום רכישת ספקטרום, ריקבון תהליך חופשי אינדוקציה (FID) באמצעות פרמטרים אופטימליים. הערכים של פרמטרים אלה משתנים מעט כפונקציה של כוח שדה מגנטי, איכות פחית, ואות המטבוליט לכימות.
הערה: ברוב המקרים, זה מספיק כדי לעבד כל ספקטרום פעם אחת, מעסיק קבוצה של פרמטרים עיבוד הצגת פשרה טובה לכל אותות המטבוליט. ראה לוח 1 לפרמטרי עיבוד אופייניים. - לכמת את השטח של כל אות המטבוליט (לעתים קרובות multiplet, לפעמים חופף עם singlets אחר או multiplets נובעים ממולקולות שונות) ביחס לאזור תחת האות של מתחם ההתייחסות (TSP-d 4) באותו הספקטרום.
- לחשב ריכוזי המטבוליט פרטניים המבוססים על TSP-d 4 ריכוז (ראה 6.4). קח בחשבון שמספר הפרוטונים תורמים לאות תמ"ג H 1 מסוימת עשוי להשתנות כפונקציה של מוצא המולקולרי של אות ש. אות trimethyl TSP-d 4 (הפניה ל0.0 עמודים לדקה) מייצגת תשעה פרוטונים.
- השתמש בתוכנת סטטיסטיקה לפי צורך כדי להשוות רמות המטבוליט המוח בין קבוצות של בעלי חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להשיג רזולוציה הטובה ביותר בספקטרום NMR חילוף חומרים של מוח ותמציות רקמות אחרות, זה כבר זמן רב מנהג נפוץ כדי להסיר או יוני מסכת מתכת (הכי חשוב: יוני פאראמגנטיים) קיימים בפתרוני תמצית. זו הושגה על ידי הוספת סוכן chelating כגון EDTA או CDTA לתמצית 19, או על ידי העברת התמצית דרך שרף חילוף יונים כגון Chelex-100 20. התוצאות מוצגות באיור 1 מראות כי צעד זה אינו הכרחי לצורך הניתוח ספקטרוסקופיות NMR H 1 אם תמציות מוח שהוכנו בקפידה על פי הפרוטוקול לעיל. כאן, קווים ספקטרליים הצרים ביותר התקבלו עבור כל אזורי הרפאים ניתחו. גם באזורים צפופים מאוד, למשל, לגלוטמין / גלוטמט ו-inositol / גליצין מיו, פסגות במרחק של <עמודים לדקה 0.01 כמעט לחלוטין להפרדה ב400 MHz (איור 1, למטה). כתוצאה מכך, איכותי,וניתוח כמותי של פסגות קטנות רבות, אך לא הוקצו כיום, נראות לעין בפנלי המרכז והתחתון של איור 1 ניתן בחזון בעתיד.
איור 1 אזורי משנה של ספקטרום אופייני H 1 NMR (400 MHz) של השלב המימית של תמצית רקמת מוח מעכברוש לואיס נשי. כל שלושה הפנלים להדגים את הרזולוציה הגבוהה ביותר זמין באמצעות הפרוטוקול שהוצג במאמר זה. לא שרף סוכן chelating ולא חילוף יונים נעשה שימוש במהלך הכנת מדגם. מרכז ופנלים תחתון מראים את קיומם של רבים פסגות בעצימות נמוכות שלא הוקצו המרמזות על הטווח הדינמי הגדול מכוסה על ידי ברזולוציה גבוהה 1 ספקטרוסקופיה H NMR של תמציות רקמה אם נעשה שימוש בפרמטרים ניסיוניים מותאמים. אלה חלשים אבל גםניתן לזהות אותות לזיהוי פוטנציאל ולכמת בעתיד. מטבוליטים זוהו כמה ספציפיים של רקמת המוח, למשל, NAA סמן נוירון או GABA מוליך עצבי.; עם זאת, רוב התרכובות מעורבות במגוון רחב של מסלולי מטבוליים המשותפים לתאי יונקים, כגון חומצת אמינו, חומצה אורגנית מסועפת שרשרת, polyol, שומנים בדם (phospho) וחילוף חומרים של אנרגיה, כמו גם בגליקוליזה וglutaminolysis, וב פונקציות כגון ויסות לחץ האוסמוטי, גדילת תאים והתרבות. הכוכבית מציינת את התהודה מתיל הנובעת מטומאת מתנול. קיצורים: עלא, אלאנין; לאק, חומצת החלב; threo, תראונין; BHB, β-hydroxybutyrate; val, ולין; איל, isoleucine; Leu, לאוצין; AAB, α-aminobutyrate; AHB, α-hydroxybutyrate; טאו, טאורין; scy -Ins, scyllo -inositol; -Ins מיו, -inositol מיו; GPC, glycerophosphocholine; מחשב, phosphocholine; צ, כולין; CRN, קריאטינין; Cr, קריאטין; GABA,47; -aminobutyrate; asp, aspartate; NAA, -acetylaspartate N; gln, גלוטמין; Glu, גלוטמט; suc, succinate; נענע, -acetylneuraminate N; ac, אצטט; גלאי, גליצין. פסגות הקטנות בבסיס של גזע כפיל עלא מכפיל קטט 13 C הלווין (פנל עליון). הודפס מחדש תחת רישיון Creative Commons ייחוס (CCAL) מונחים מet al (2013) מסלולים ביוכימיים במוח דלקת פרקים encephalomyelitis ואדג'ובנט אוטואימוניות ניסיוניות לוץ NW:. מחקר metabolomic השוואתי. PLoS ONE 8 (2):. E56101 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ביום 31 בספקטרוסקופיה P NMR, מיסוך או הסרת קטיונים פאראמגנטיים (בעיקר ברזל) הוא ללא ספק הכרח כי הפוספטים בקלות יצירת קומפלקסים עם יונים דו ערכיים וtrivalent. תוספת של CDTA לתמציות משפיעה על הקו ספקטרלי ברוחבמשמרות כימיות ד; להשוות איור 2, עליון ושמאלי תחתון. צמצום קו על ידי בחירת 1,000 מ"מ (למטה משמאל) במקום 200 מ"מ (למעלה משמאל) CDTA היה רצוי, אבל הביא בסופרפוזיציה של אותות PL שצריך לכמת בנפרד (למעלה משמאל). לכן, 200 מ"מ CDTA מומלץ למרכיב המימית של ממס PL, כל התנאים האחרים שווים. יתר על כן, הטמפרטורה המדגם במהלך המדידה משפיעה על רוחב קו ספקטרלי ומשמרות כימיות; להשוות איור 2, עליון וימני תחתון. צמצום קו על ידי בחירת 277 K (מימין למטה) במקום 297 K (למעלה מימין) היה רצוי, אבל הביא בסופרפוזיציה של אותות PL שצריך לכמת בנפרד (למעלה מימין). לכן, 297 K מומלץ כטמפרטורת מדידה, כל התנאים האחרים שווים. השוואה בין שני הלוחות העליונים מראה כי ירידה בריכוז CDTA מ200 מ"מ (למעלה משמאל) ל50 מ"מ (למעלה מימין) רק מביא לעלייה מתונה בקו רוחב, וכמעט בכל שינוי בהיסט כימי. עם זאת, שימו לב כי ריכוז הרקמה בתמצית 50 מ"מ CDTA הוא חצי גבוה כפי שהוא בתמצית מ"מ CDTA 200, המסביר את הקווים צרים יחסית בפנל הימני העליון 13.
איור 2 Phosphatidylethanolamine (PtdE) אזורים של פוספוליפידים ספקטרום 31 בP NMR (162 MHz) של תמציות רקמת מוח מחולדות לואיס נשיות (פנל משמאל למעלה) ריכוז רקמת המוח, 236 מ"ג / מ"ל.; ריכוז CDTA וpH ברכיב המימית של הממס, 200 מ"מ ו7.33, בהתאמה; טמפרטורת מדידה, אותות plasm וSM 297 ק PtdE נפתרים גם ריכוז רקמת המוח (למטה משמאל), 236 מ"ג / מ"ל.; conce CDTAntration וpH ברכיב המימית של הממס, 1,000 מ"מ ו7.36, בהתאמה; טמפרטורת מדידה, אותות plasm וSM 297 ק PtdE חופפים לחלוטין; הם לא יכולים להיפתר על אף רוחב קו מופחת, בהשוואה לספקטרום השמאלי העליון (למעלה מימין) ריכוז רקמת המוח, 118 מ"ג / מ"ל.; ריכוז CDTA וpH ברכיב המימית של הממס, 50 מ"מ ו7.14, בהתאמה; טמפרטורת מדידה, 297 אותות ק PtdE וSM נפתרים גם ריכוז (למטה מימין) רקמת המוח, 118 מ"ג / מ"ל.; ריכוז CDTA וpH ברכיב המימית של הממס, 50 מ"מ ו7.14, בהתאמה; טמפרטורת מדידה, 277 אותות ק PtdE וSM חופפים לחלוטין; הם לא יכולים להיפתר, למרות רוחב קו מופחת בהשוואה לספקטרום הימני העליון. קיצורים: plasm PtdE, plasmalogen ethanolamine; PtdE, phosphatidylethanolamine; SM, sphingomyelin; PtdS, phosphatidylserine; PtdC, phosphatidylcholine. הודפס מחדש באישור מוץ et NW אל. (2010) אופטימיזציה Multiparametric של ניתוח ספקטרוסקופיות NMR ביום 31 בP של פוספוליפידים בתמציות רקמה גסות. .1 שינוי כימי והפרדת אות. אנאלי Chem 82 (13): 5433-5,440. כל הזכויות שמורות 2010 האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
שימוש בפרוטוקול לעיל (מערכת חד שלב 14; איור 3, למעלה משמאל), מספר רב של קווי פרספקטיבת כימות התגלה (איור 3, ימני עליון), המשתרע על טווח ריכוז ניכר (שים לב אותות בעוצמה גבוהה קטועים). חלק מאותות אלה הם עדיין שכלא הוקצה (U1, U2, U6). אם הכנת מדגם, מדידת NMR ועיבוד ספקטרום מבוצעים כפי שצוינו בפרוטוקול זה, ברזולוציה ספקטרלית היא גם מספיק לד באופן שגרתיetect פיצול חלקי של פסגות מסוימות (PtdS, PtdE, plasm PtdE, AAPtdE; שמאלי תחתון). . כתוצאה מכך, איכותית וניתוח כמותי של תת קבוצות PL נוספות ניתן בחזון בעתיד איור 3, ימני תחתון, ממחיש את כוחה של פרמטרים עיבוד שנבחרו בשיקול הדעת באופן חלקי אותות נפרדים של תרכובות ריכוז נמוך (כאן: PtdC1u, PL נגזרים מPtdC שאינו מזוהה באופן מלא, וplasm PtdC) מהדהד קרוב לאותות חזקים מאוד (כאן: PtdC).
מערכת חד שלב ספקטרוסקופיה איור 3 פוספוליפידים ביום 31 בP NMR (162 MHz) של תמציות רקמת המוח מחולדות לואיס נשיות. (פנל משמאל למעלה) (משמאל) הייתה עדיפה על מערכת שני שלבים (מימין). המערכת הנפוצה שני שלבי צידניות נכונותquantitation PL משום שרובו של השלב העליון נמצא מחוץ לנפח רגיש של הסליל. (פנל עליון מימין) ביום 31 בספקטרום P NMR PL מלא של מוח חולדה. לנראות טובות יותר של אותות חלשים (PtdIP, PtdG), הרחבת שורת מעריכי (LB = 3 הרץ) יושם. בייצוג זה, כמה אותות PL לא טוב נפתרו-, בעיקר באזורי PtdC וPtdE. לפרספקטיבה יצירת אות ביום 31 בP NMR יותר מפעם אחת, גרעינים נצפו הם קו תחתי (P tdIP, PtdI P, P tdIP 2, PtdI P 2). נכון לעכשיו אותות שלא הוקצו מסומנים על ידי "n U" (כאשר n = 1, 2, ...). אזורי PtdE וPtdS (פנל השמאלי תחתון) של אותו הספקטרום. לרזולוצית שיא טובה יותר, שינוי צורת קו הלורנצי-גאוס יושם (LB = -1 הרץ, GB = 0.3). בגלל הפרמטרים עיבוד אלה, אותות PL מאוד חלשים רבים הם קשה לזהות. עם זאת, לפחות שני שיאים יכוליםניתן להבחין לכל איזור PtdC PtdE, plasm PtdE, AAPtdE, וPtdS. (פנל ימני תחתון) שהושג עם אותם הפרמטרים העיבוד כאזור PtdE. כמה אותות בבסיס תהודת PtdC הבולט התגלו באופן חד משמעי, ואילו הם לא יכולים להבחין בספקטרום העליון שנוצר עם הרחבת קו מעריכי (plasm AAPtdC, PtdC, PtdC1u). חוץ אנלוגי PtdC שלא הוקצה כיום, PtdC1u, תהודות קטין נוספות עשויות להיות נוכחת upfield מPtdC. קיצורים: PtdIP, פוספט phosphatidylinositol; PtdIP 2, דיפוספט phosphatidylinositol; PtdA, חומצת phosphatidic; PtdG, phosphatidylglycerol; CL, cardiolipin; PtdE .., סכום של PtdE, plasm PtdE וAAPtdE; PtdI, phosphatidylinositol. לקיצורים נוספים ראו אגדה באיור 2. הודפס מחדש באישור מוץ NW et al. (2010) אופטימיזציה Multiparametric של ניתוח ספקטרוסקופיות NMR ביום 31 בP של phospholipids בתמציות רקמה גסות. .1 שינוי כימי והפרדת אות. אנאלי Chem 82 (13): 5433-5,440. כל הזכויות שמורות 2010 האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| קצירה והקפאת מוח חולדה | |||
| דיואר ל2liq N.; הקפאת מהדק (למשל, מלקחי Wollenberger תוצרת בית, שופטים 1 ו -2, חלק תחתון של טבלה.); תא הרדמה; מספריים כירורגיות; אזמל; בקבוק מ"ל 500 עם אלכוהול ניקוי | 1 מתוך כל | ||
| מלקחיים | 2 | ||
| מזרק 1 מ"ל, מזרק 10 מ"ל | 1 מתוך כל לכל בעל חיים | ||
| 25 מחטי G | 2 לכל בעל חיים | ||
| הכנה לדוגמאation | |||
| סכום אופייני של רקמת המוח לחילוץ | 250-350 מ"ג | ||
| MeOH נפח שימוש בhomogenizing 250 - רקמת מוח מ"ג 350 | 4 מ"ל | ||
| 5 מ"ל פיפטה פלסטיק | 3 לכל תמצית | ||
| 10 מ"ל פיפטה פלסטיק | 1 לתמצית | ||
| בקבוקון זכוכית (≥20 מ"ל נפח) | 1 לתמצית | ||
| צינור צנטריפוגות כלורופורם עמיד | 1 לתמצית | ||
| תקופת מתנה לאחר הומוגניזציה הרקמה בMeOH (תערובת על 4 מעלות צלזיוס) | 15 דקות | ||
| מים וCHCl 3 נפח נוסף לרקמת המוח הומוגני ב4 מ"ל MeOH | 4 מ"ל כל אחד | ||
| תקופת מתנה לאחר ערבוב רקמה הומוגני עם מים וCHCl 3 (תערובת ב -20 מעלות צלזיוס) | לילה | ||
| צנטריפוגה לo הפרדהמימיים f משלב תמצית אורגנית (צינור צנטריפוגות זכוכית) | 13,000 × גרם, ל40 דקות ב 4 ° C | ||
| ריכוז של פתרון CDTA (שלב מימיים של תערובת ממס להמסת שומנים שחולצו) | 200 מ"מ | ||
| pH של שלב מימיים של תערובת ממס להמסת שומנים שחולצו | 7.4 | ||
| יחס נפח בשומנים ממס המשמש לניתוח PL 31 בP (CDCl 3: MeOH: פתרון CDTA) | 5: 4: 1 | ||
| כמות ממס משמשת להמסת שומנים המופקים מ250 - רקמת מוח מ"ג 350 | 700 μl | ||
| צנטריפוגה לצנח חלקיקים מוצקים במדגם תמ"ג (צינור microcentrifuge) | 11,000 XG, ל30 דקות ב 4 ° C | ||
| pH של מדגם NMR המכיל מטבוליטים מסיסים במים | 7.3 | ||
| נפח דגימה הועבר לצינור NMR, לאחר centrifugation | 600 μl | ||
| ריכוז MDP בגזע להכניס קואקסיאליים ליום 31 בP NMR | 20 מ"מ | ||
| ניסויי NMR | |||
| טמפרטורת מדגם במהלך ניסוי NMR (להיות מותאם למזעור חפיפה שיא) | 25 ° C | ||
| ספינינג תדירות במהלך ניסוי NMR | 15-20 Hz | ||
| 1 פרמטרי H NMR רכישה | |||
| ממס מתן 2 אות נעילת H | D 2 O | ||
| רוחב פולס עירור, P1 | 11 μsec | ||
| דופק עירור, הנחתה מגבר, PL1 | 0 dB | ||
| גודל FID, TD | 32 k | ||
| רכישת tim FIDדואר, א.ק. | 3.283 שניות | ||
| עיכוב הרפיה, D1 | 15 שניות | ||
| עיכוב דיכוי ממס, D4 | 6 שניות | ||
| זמן החזרה סך הכל, TR | 24.3 שניות | ||
| רוחב ספקטרלי בעמודים לדקה, SWP | 12.47 עמודים לדקה | ||
| רוחב ספקטרלי בהרץ, SW | 4,990 Hz | ||
| רווח מקלט, RG | 512 | ||
| דיכוי ממס (גל רציף) | CW | ||
| דיכוי ממס, הנחתה מגבר, PL9 | 50 dB | ||
| מספר הארעיים, NS | 32 או 64 | ||
| ביום 31 בפרמטרי P NMR רכישה | |||
| ממס מתן 2 אות נעילת H | CDCl 3 | ||
| wi דופק עירורDTH, P1 | 9.5 μsec | ||
| דופק עירור, הנחתה מגבר, PL1 | 4 dB | ||
| גודל FID, TD | 16 k | ||
| זמן רכישת FID, א.ק. | 2.019 שניות | ||
| עיכוב הרפיה, D1 | 15 שניות | ||
| זמן החזרה סך הכל, TR | 17 שניות | ||
| רוחב ספקטרלי בעמודים לדקה, SWP | 25 עמודים לדקה | ||
| רוחב ספקטרלי בהרץ, SW | 4,058 הרץ | ||
| רווח מקלט, RG (מרבי) | 16,384 | ||
| פרוטון decoupling (decoupling דופק מרוכבים) | CPD | ||
| צימוד פרוטון, הנחתה מגבר, PL13 | 19 dB | ||
| מספר הארעיים, NS | 1,500 או 2,000 | ||
| NMR עיבוד נתונים | 1 H שיפור רזולוציה, גאוס-הלורנצי טרנספורמציה Lineshape | ||
| הערכה כוללת של ספקטרום (אם נדרש, לייעל בנפרד לאזורי רפאים בודדים, באמצעות 0.1 <GB <0.4, ו-0.6 <LB <-0.2 הרץ) | GB = 0.15, LB = -0.2 הרץ | ||
| אותות חלשים מאוד, למשל, חומצות ארומטי (לחלופין האפודיציה עם LB ≥ 0.5 הרץ) | GB = 0.015, LB = -0.3 הרץ | ||
| אזורים שבפסגות: lineshape השימוש מתאים לחפיפת תהודות | |||
| שיפור רזולוציה ביום 31 בP, שינוי גאוס-הלורנצי lineshape | |||
| הערכה כוללת של ספקטרום (לייעל בנפרד לאזורי רפאים בודדים, באמצעות 0.05 <GB <0.2, ו-3.0 <LB <60; -1.0 הרץ) | GB = 0.05, LB = -1.0 הרץ | ||
| אותות חלשים מאוד, למשל, PtdIP 2, PtdA: האפודיציה | LB = 3 הרץ | ||
| אזורים שבפסגות: lineshape השימוש מתאים לחפיפת תהודות | |||
| אזכור | |||
| .1 Palladino GW, עץ JJ, פרוקטור HJ. טכניקה שונה הקפאת מהדק עבור assay רקמה. כתב העת של מחקר כירורגית 289, 188-190 (1980). | |||
| .2 Wollenberger, Ristau O, Schoffa ג [טכני פשוט להקפאה מהירה מאוד של חתיכות גדולות של רקמה]. למות gesamte פיזיולוגית des der und Menschen הפרווה Pflugers Archiv 270 Tiere, 399-412 (1960). | |||
טבלת 1 פרמטרים ניסויי לרזולוציה גבוהה 1 H וספקטרוסקופיה NMR ביום 31 בP של מוחתמציות רקמה. ערכים אופייניים עבור יחסי נפח וריכוזים של ממסים וחומרים כימיים המשמשים במיצוי רקמת המוח והכנת מדגם NMR מוצגות. ערכים מומלצים נוסף מתייחסים ללדגום pH וטמפרטורת מדידה, כמו גם פרמטרים לרכישה ועיבוד NMR. התאמות קלות עשויות להיות נחוצות, במיוחד אם פרוטוקול מיושם על רקמות אחרות מאשר המוח. הפרמטרים NMR כבר מותאמים למדידות ב9.4 T, וצריכים להיות מותאמים לפי צורך לספקטרומטרים הפועלים בעוצמות שדה מגנטי שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ספקטרוסקופיה NMR היא שיטה יעילה למדידת ריכוזים של תרכובות כימיות בפתרון בצורה מאוד לשחזור ומדויק. עם זאת, כדי לקבל נתונים באיכות גבוהה יש צורך לדבוק בכללים מסוימים הנוגעים להכנת מדגם וניתוח. בקביעת ריכוזי המטבוליט ידי ספקטרוסקופיה NMR, לא הדור ולא הקבלה של אות NMR שולטת שגיאת quantitation, אלא אם כן את עוצמת אות שנצפתה מתקרבת לסף הגילוי (אות חלשה במיוחד). בכל המקרים האחרים השתנות ביולוגית, טכניקת הכנת מדגם (יעילות חילוץ, יציבות פיזית וכימית של תרכובות, pipetting ומשקל טעויות וכו '), ו / או הבחירה של פרמטרים לרכישת עיבוד אותות ויקבעו דיוק ואת הדיוק של תוצאות. כמובן, כל שינויים מטבוליים המתרחשים בעת קציר רקמה יהיו גם באו לידי ביטוי בהמטבוליט ריכוזים להשיגed. לכן, זה מאוד חשוב כדי להשלים את קציר רקמות מהר ככל האפשר, וליישם טכניקות הקפאת רקמה מסוימות כגון משפך הקפאה אם מדויק בריכוזי vivo של תרכובות במהירות חילוף חומרים חשובים (בעיקר גלוקוז, חומצת החלב, ATP וcatabolites, ADP ו AMP).
ניתן להשיג גם בכוח ביניים השדה מגנטי (9.4 T) של ספקטרום ספקטרומטר תמ"ג שגרתי ברזולוציה גבוהה מעולה. לדוגמא, ב1 ספקטרום H NMR של השלב המימית של תמציות מוח חולדה, אותות הבדל שבהיסט כימי, Δδ, מסתכם לסך של קליפורניה 0.005 עמודים לדקה (המקביל ל 2.0 הרץ ב400 תדר תהודת MHz) ניתן להבחין ונרשמת בנפרד. זו באה לידי ביטוי על ידי ההפרדה החלקית של (i) לקטט וכפילויות תראונין, וכן (ii) כפיל אלאנין מהפסגות הקטנות בבסיסו (כפיל לווין 13 C חומצת החלב; איור 1,עליון). ספקטרומטרים הפועלים בשדות גבוהים יותר (14.1 או אפילו 18.8 T) היה להגדיל את הרזולוציה ורגישות נוספת, למרות שהמכשירים אלה הם פחות נפוצים במעבדות NMR בשל עלות הרכישה הגבוהה שלהם.
שימוש 1 ספקטרוסקופיה H NMR, מגוון רחב של מטבוליטים ניתן לנתח בו זמנית, כלומר ברכישה אחת ויחידה. הרגישות של הניסוי ניתן לשפר על ידי הגדלת מספר העוברים שנצברו, אם כי בחירה זו מגבירה את זמן מדידה יחסי. (יחס אות לרעש הוא פרופורציונאלי לשורש הריבועי של מספר העוברים.) עם זאת, הזמן המרבי כולל רכישה ניתנה בפרוטוקול לעיל (20 - 30 דקות) צריך להיות מספיק לכמעט כל הדבר והעניין, אלא אם כן הסכום של רקמה זמינה להפקה הוא מאוד מוגבל. חוץ מזה מה שהופך את השימוש בגרעין רוב NMR רגיש (פרוטון), יש ספקטרוסקופיה H NMR metabolomic 1 היתרון של מקיףמאגרי מידע להיות זמינים לעוצמות שדה שונות וpH מדגם ערכי 10. יתר על כן, תוכנה להערכת ספקטרום אוטומטית או אוטומטית למחצה הפכה זמינה 10.
בעוד 1 ספקטרום H NMR של תמציות רקמה ניתן לפתור גם ללא תוספת של סוכני chelating, זה כבר לא נכון ליום 31 בספקטרום P NMR. למעשה, הריכוז chelating הסוכן של שימוש (למשל, EDTA או CDTA) יש השפעה משמעותית על רוחב קו שני והיסט כימי של 31 באותות P NMR נובעים ממטבוליטים פוספורילציה. ריכוז CDTA גובר בתמצית יורד ביום 31 ברוחב קו P NMR, אך יתרון זה עשוי להיות עולה על הבדלים קטנים יותר בין משמרות כימיות, Δδ, של פסגות שכנות. לפיכך, הסכום של סוכן chelating משמש כבר להיות מותאם לרוחב שני קו והיסט כימי יחד. בתמציות שומנים בדם, שני פרמטרים רפאים אלה הם significaהשפיע ntly על ידי ריכוז המדגם הכולל, כלומר כמות הרקמה שחולצה, אלא גם על ידי ערך pH והטמפרטורה של המדגם במהלך מדידת NMR. כתוצאה מכך, כל אופטימיזציה של תנאי מדידה יש לקחת בחשבון את ההשפעות משולבות של כל הפרמטרים הניסיוניים המעורבים, חלק מהתוסף לא להיות אלה. המורכבות של מצב זה באה לידי ביטוי בהתנהגות של ספקטרום PL 31 בP NMR שמוצגת באיור 2. למרות ריכוז הרקמה הנמוכה ביותר (118 מ"ג / מ"ל), הטמפרטורה הנמוכה ביותר (277 K) וריכוז CDTA הגבוה ביותר (1,000 מ"מ) נבדקו יביא רוחב הקו הנמוך ביותר, הפרוטוקול הציע ממליץ על השימוש בריכוז מתון רקמה (236 מ"ג / מ"ל), ריכוז CDTA ביניים (200 מ"מ) וטמפרטורת חדר (297 K), כדי למנוע חפיפה אות.
למרות שהתנאים של הכנת מדגם ורכישת ספקטרום הם בעלי חשיבות עליונה,התפקיד של פרמטרים עיבוד ספקטרום בחילוץ מרבי של מידע מהנתונים הגולמיים שנרכשו לא צריך לזלזל. קבוצה מסוימת של פרמטרים לעיבוד שלי תהיה אידיאלית לאיתור וquantitating פרספקטיבה המתרחשות בריכוזים נמוכים; עם זאת, את אותו הסט של פרמטרים עלול לטשטש פסגות בודדות באזורים 'צפופים' רפאים (איור 3, ימני עליון). לעומת זאת, פרמטרים עיבוד מתן שיפור רזולוציה אופטימלי באזורים של תהודות מאוד חופפים (איור 3, למטה) יהפכו פסגות בעצימות נמוכות לגילוי. התפתחויות אחרונות, ובכלל זה גם מסד נתונים מקיפים PL 31 בP NMR 13,14, להקל באופן משמעותי את הניתוח של ספקטרום NMR 13,14.
סופו של דבר, המטרות של היישום הבסיסי יש להגדיר את הקריטריונים לאופטימיזציה, כלומר האיזון הרצוי של רזולוציה ספקטרלית, רגישות, דיוק של quantif המטבוליטication, מהירות, וגורמים אחרים. לדוגמא, המערכת המומלצת חד פאזיים להיתרי ניתוח PL כימות PL יותר אמין ויעיל יותר ממערכות שני שלבים (איור 3, למעלה משמאל), ומספקת רזולוציה גבוהה רפאים, כמו גם רגישות מספקת לכימות של קווי פרספקטיבה פחות בשפע . עם זאת, במקרים שבם הפרדת האות הטובה ביותר היא עדיפות גבוהה בהרבה מquantitation יעיל והמדויק, השימוש באחוז גבוה יותר של כלורופורם-d בתערובת הממס עשוי להיות ניסיון, למרות שזה מוביל בקלות לשלב הפרדה במדגם. אם זה המקרה, את עוצמת הקול של השלב התחתון חייבת להיות נחוש כדי להשיג כמויות PL מוחלטות (מ"ג PL, לגרם רקמה או חלבון כולל מ"ג).
בניסויי NMR heteronuclear-decoupled פרוטון, עוצמות אות עשויות להשתנות על ידי השפעות גרעיניות אוברהאווזר (נוי), בנוסף לרוויה בשל תוכניות רכישה מהירות. אם לא תוקן תופעות אלה יגרמו qua המטבוליטשגיאות ntitation. ישנן שתי אסטרטגיות חלופיות כדי להתמודד עם אתגר זה. בגישה הראשונה, ארעיים בודדת של רכישה מופרדים על ידי עיכובים ארוכים. שיטה זו מונעת כל הרוויה או NOE אבל תוצאות בניסויים ארוכים יחסית; יש להשתמש בו אם יש צורך בתוצאות מדויקות ומדויקות. במקרים מסוימים, ייתכן שתהיה על העדיפות תינתן לרכישת ספקטרום מהר, בפרט לדגימות מאוד לדלל שיכול להימדד רק באמצעות מספר גבוה של עוברים. במקרים כאלה, תוספת של סוכני הרפיה פאראמגנטיים למדגם תאפשר רכישת נתונים מהירה ללא רוויה או NOE. לחלופין, יכולה להיות מועסק רכישת נתונים מהירה ללא תוספת של סוכני פאראמגנטיים. השיטה השנייה דורשת תיקון של אזורי אות בדרך של גורמי תיקון שצריך להיות שנקבע לכל תהודת NMR, ואילו הנוכחות של סוכני הרפיה גורמת לכמה הרחבת אותות NMR שעשוי להפחית את הדיוק של quantitation המטבוליט לאזורי רפאים צפופים. באופן כללי, הבחירה האופטימלית של תנאי ניסוי אינה מוכתבת רק על ידי סוג המדגם, אלא גם על ידי המידע שתחולץ מניסוי 13. אם בעדיפות גבוהה יש לתת לניתוח מהיר של מטבוליטים ולא בשפע, ללא הצורך ברמת דיוק גבוה ודיוק, זה עשוי להיות מספיק כדי למדוד דגימות בריכוז גבוהה ומעסיקים פעמים חזרה קצרות, אולי עם סוכן הרפיה פאראמגנטיים נוסף למדגם. לעומת זאת, אם quantitation מדויק של מספר גדול של מטבוליטים חשוב יותר ממהירות, עדיף להשתמש בתמציות מרוכזות פחות וקיבלתי פעמים רכישת NMR ארוכות, כפי שהודגם על ידי הפרוטוקול המובא כאן. יתר על כן, אם פרויקט מחקר מסוים מדגיש מטבוליטים מסוימים, יכולים להיות מותאמים תנאי ניסוי כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית אופטימלית לאזורי רפאים בשאלה. הפרוטוקול והדיון מובא כאן יכולים לשמש כמדריך לoptimization של ניתוח metabolomic של תמציות רקמה גסה על ידי ספקטרוסקופיה NMR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
| Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
| Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
| Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
| Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
| Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
| Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
| Electronic scale | Sartorius | n/a | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
| Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15 ml, 30 ml tube |
| Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
| Polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10 ml volumes |
| Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96% deuterated |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96% deuterated |
| Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20% in deuterium oxide |
| Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30% in deuterium oxide |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
| Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
| pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
| NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
| NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| Pipettes | Eppendorf | Research | With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl |
| Pipet-Aid | Drummond | XP | |
| NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
| NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
| Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
| Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity |
| Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
| TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |
References
- Manger, P. R., et al. Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction. Front Neuroanat. 2, 5 (2008).
- Buxbaum, J. D., et al. Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features. Mol Autism. 3, 1 (2012).
- Papaioannou, V., Behringer, R. R. Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).
- Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).
- Mallolas, J., et al. A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke. The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).
- Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).
- Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model. PLoS ONE. 2, e157 (2007).
- Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. Methodologies for Metabolomics. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E. Metabolomics in drug target discovery. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 235-246 (2011).
- Wishart, D. S. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats. Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).
- Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel. NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution. Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation. Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Methodologies for Metabolomics. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study. PLoS ONE. 8, e56101 (2013).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy. Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).
- Pearson, G. A. Shimming an NMR magnet. , University of Iowa. Iowa City. (1991).
- Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. Biophysical tools for biologists. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).
- Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats. Stroke. 20, 633-640 (1989).
