Introduction
Murine modeller har været anvendt i udstrakt grad i hjernen forskning 1. Genotype-fænotype-korrelationer er blevet undersøgt i mus og rottehjerner ved at studere genekspression på RNA-og / eller proteinniveauer på den ene side, og morfologiske, funktionelle, elektrofysiologiske og / eller adfærdsmæssige fænotyper på den anden 2-6. Til fuldstændig at forstå de mekanismer, der forbinder fænotype til genotype, er det bydende nødvendigt at undersøge de molekylære begivenheder nedstrøms for proteinekspression, dvs. metabolismen af de biokemiske substrater, hvorpå enzymer virker 7. Dette krav førte i løbet af de seneste 10 til 15 år, til en renæssance for metabolisk forskning i mange grene af biologi 8,9. Mens klassiske metaboliske undersøgelser ofte har været fokuseret på detaljer i bestemte veje, er den nye metabolomiske strategi rettet mod en altomfattende undersøgelse af den globale metaboliske profil af vævet under overvejelse.En konsekvens af dette koncept er et indlysende behov for analyseværktøjer, der minimerer bias i retning af specifikke metaboliske veje og / eller klasser af forbindelser. Imidlertid er en klassisk biokemisk assay baseret på en bestemt kemisk reaktion af en specifik analyt, der skal specificeres, inden analysen udføres. Derimod er spektroskopiske teknikker, såsom kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi og massespektrometri (MS) (i) er baseret på bestemte molekylære (fysiske) egenskaber af biokemiske forbindelser, som hver især giver anledning til en eller flere bestemte signaler i et spektrum påvises i løbet af et forsøg; og (ii) påvisning af en lang række forskellige forbindelser per eksperiment.
Således hvert spektrum indeholder den kombinerede information om en hel række metabolitter. Af denne grund spektroskopiske metoder er passende værktøjer til metabolomics, som uden forudgående udvælgelse skal gøres med hensyn til arten af den analyt, der skal måles 8
Selv om NMR-spektroskopi og MS kan anvendes i flæng til analyse af mange metabolitter, hver metode har særlige fordele og ulemper, der er for nylig blevet revideret 10. Sammenfattende kan NMR-spektroskopi normalt udføres fra råekstrakter og ikke kræver kromatografisk separation af prøven forbindelser før analysen. Derimod arbejder MS med gas eller væske kromatografi (GC eller LC) adskillelse, med undtagelse af særlige seneste udvikling såsom massespektrometri billeddannelse. I nogle få særlige tilfælde, såsom analyse af sukkerarter, kan LC adskillelse blevet en nødvendighed for NMR-spektroskopi så godt, fordi resonans linjer af forskellige former for sukker overlapper betydeligt i proton (1H) NMR-spektre. Alligevel 1H NMR spektroskopi uden chromatographic adskillelse er den mest populære, næsten universelt anvendt metabolomiske NMR-metode. Generelt prøveforberedelse er mere tidskrævende og kompleks til MS, end det er for NMR-spektroskopi. Alvorlige problemer på grund af matrix virkninger er langt mindre udbredt i NMR-spektroskopi end i MS, hvor de kan føre til betydeligt svækkede signaler. Metabolitten kvantificering kan opnås med begge metoder. Der er imidlertid behov flere standard forbindelser til MS skyldes variationer i matrix effekter og ionisering effektivitetsgevinster mellem metabolitter. Derimod er der behov for kun én standard per prøve for et NMR-spektroskopisk analyse, fordi under passende betingelser måling, sidstnævnte metode er uløseligt kvantitative takket være den strengt lineær NMR-respons ved de observerede kerner. En væsentlig ulempe ved NMR er dens relativt lave følsomhed. MS, især LC-MS, er mere følsom end NMR med flere størrelsesordener; af denne grund, MS er at foretrække frem NMR foranalyse af forbindelser, der forekommer ved meget lave koncentrationer. På den anden side, ikke-destruktiv natur af NMR-eksperiment er en klar fordel i forhold til MS; på denne måde, kan NMR udføres gentagne gange på den samme prøve, fx til forskellige NMR-aktive kerner, såsom 1H, phosphor-31 (31 P), carbon-13 (13C), fluor-19 (19F) mv., som ikke er forbrugt ved NMR i modsætning til MS målinger.
Både NMR og MS kan anvendes i forskellige former, der hver er optimalt til påvisning af forbindelser med særlige kemiske egenskaber. For eksempel 31P-NMR er ofte bedre end 1H NMR til analyse af moderat koncentreret phosphorylerede forbindelser, skønt næsten alle phosphorylerede metabolitter også indeholder protoner. Imidlertid kan deres 1 H NMR-signaler skjules af en H NMR-signaler fra andre, ikke-phosphorylerede forbindelser, mens sidstnævntenaturligvis ikke forårsager baggrundssignaler i 31P-NMR-spektre. I en analog situation 19F NMR-analyse er at foretrække for fluorholdige forbindelser, fx fluorinerede lægemidler (ingen baggrund signaler fra endogene metabolitter), mens det særlige tilfælde af 13C NMR er af interesse næsten udelukkende om skæbnen for 13 C- mærkede eksogene metaboliske forstadier skal følges på grund af den ekstremt lave naturlige overflod af 13C isotop (ca. 1%). Mange massespektrometre arbejde i enten negativ ion-mode eller positiv ion-mode. Derfor er det vigtigt at vide forud for analyse, om de ioner, der skal overholdes, er negativt eller positivt ladede. Vi fokuserer her på en protokol for analyse af hjernevæv metabolomet ved 1H og 31P NMR-spektroskopi, fordi denne metode giver et stort antal vigtige metabolitkoncentrationer til lave omkostninger i form af (i) nødvendige tid til prøveforberedelse ennd (ii) indsats, der kræves for metabolit kvantificering. Alle forsøg kan udføres ved hjælp af udstyr til en standard våd-kemi laboratorium og en høj opløsning NMR-spektroskopi facilitet. Yderligere krav er beskrevet i protokol afsnittet nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: dyreetik ERKLÆRING
Dyreforsøg med rotter fulgt de retningslinjer, der gælder i Frankrig, og blev godkendt af den lokale etiske komite (# 40,04, University of Aix-Marseille Medical School, Marseille, Frankrig).
1. Høst og Frysning Rat Brain
- Forbered elementer påkrævet: flydende kvælstof (N 2liq.) I Dewar, der er stor nok til at holde en frysning klemme (mindst 2-3 l volumen); bedøvelsesmiddel (fx isofluran eller ketamin / xylazin); anæstesi kammer; sterile dissektion værktøjer: kirurgiske saks, skalpel, pincet; væv klude og en flaske med sprit (ethanol); nåle (25 g); 1 ml og 10 ml sprøjter. Label aluminiumsplader (ca. 10 x 10 cm) med tape. Brug ark til wrap individuelle fryse-fastspændt rotte hjerner.
BEMÆRK: Brug altid beskyttelseshandsker og øjenbeskyttelse beskyttelsesbriller eller maske ved håndtering af flydende kvælstof! - Fyld Dewar med N 2liq. Og placere fripift klemme i en Dewar. Sørg mængde N 2liq i Dewar er tilstrækkelig til gentagne fryse-clamp procedurer (flere liter den mængde N 2liq inddampning under hver fryse-fastspænding afhænger af størrelsen af klemmen).
- Bedøve dyr (fx ved isofluran eller ved intraperitoneal injektion af en ketamin / xylazin-blanding). Fortsæt til eutanasi ved hjertepunktur til at forebygge blødninger når hovedbunden er fjernet, og kraniet er åbnet. Trin 1,4-1,7 nedenfor beskriver denne standard procedure.
BEMÆRK: I særlige protokoller kræver maksimal bevarelse af glucose og højenergi-metabolitter, offer rotte ved tragt indefrysning hjernen i bedøvede dyr med N 2liq 11 efter tilbagetrækning af hovedbunden. Derefter dissekere hjernen ud af kraniet med vekslende N 2liq at minimere post mortem stofskifte 12. - Fugt leder af rotte rensealkohol. Brug kirurgiske sakse til (i) remove hovedbund, og (ii) åbne kraniet langs kranielle suturer.
- Brug pincet til at åbne kraniet videre, og til at fjerne hele hjernen fra undersiden af åbne kraniet, positionering af hovedet nedad. Fjern hurtigt nogen synlige spor af blod ved hjælp af væv klude. Hvis hjernehalvdele er metabolisk og morfologisk symmetrisk, er det praktisk at bruge en af halvkugler til metabolisk analyse efter adskille det fra den anden halvkugle ved snit med skalpel. Hvis det er nødvendigt, bruge den resterende halvkugle til andre hjerne undersøgelser såsom histologi.
- Hurtigt fjerne frysning klemme fra N 2liq -filled Dewar placere hele eller halve rotte hjerne på en indre overflade, klemme og straks indsætte frysning klemme i N 2liq -filled Dewar, mens du holder klemme fast komprimeret. Sørg for, at trin 1,3-1,6 tage længere end 60 sek.
- Efter 1-2 min fjern frysning klemme fra Dewar, åbne klemme, løsne frosne hjernevæv fra klemme, og wrapfrosset væv i behørigt mærket aluminiumsplade (se 1.1 ovenfor). Sørg for, at etiketten er læselig og forbliver på plads, efter at prøven er pakket ind. Anbring hurtigt indpakkede prøve i N 2liq. Udfør hele proceduren så hurtigt som muligt for at undgå optøning af frosne hjernevæv.
- Opbevar frosne prøve i N 2liq eller i en fryser ved -80 ° C indtil metabolit ekstraktion.
BEMÆRK: Når en biologisk prøve skal opbevares i mere end et år, opbevaring ved N 2liq temperatur er at foretrække frem for -80 ° C. Dette gælder også for den resterende del af denne protokol.
2. Fremstilling af metabolit ekstraktionsmetode
- Forbered vævshomogenisator og matchende reagensglas (f.eks, 10 mm indvendig diameter, afhængigt af diameteren af homogenisatoren akslen; regel lavet af plastik). Brug elektriske homogenisatorer snarere end manuelt drevne homogenisatorer (væv kværne). Prestudse Vortexer og laboratorium balance.
- Forbered spand fyldt med knust is. Hold tilstrækkelige maengder methanol, chloroform og vand på is (4 ml hver pr 250-350 mg frosset hjernevæv).
- Forbered overførselspipetter og hætteglas.
- Forbered hætteglas (≥20 ml volumen) med skruelåg og sted på is (ét hætteglas pr vævsekstrakt). Fit skruelåg med en Teflon septa resistent over for chloroform.
- Forbered 5 ml plastpipetter til dispensering af methanol og vand, og glaspipetter eller Hamilton sprøjter til afgivelse af chloroform. Forbered yderligere plastpipetter (5 eller 10 ml volumen) til overførsel af blandinger af vævshomogenat og methanol.
- Sørg for at alle glasvarer skylles grundigt med destilleret vand og tørres omhyggeligt før brug for at fjerne spor af urenheder, især NMR-påviselige formiat og acetat.
- Fyld porcelæn mørtel med N 2liq, sted porcelæn pistil i morter og fyld med N 2Liq. Kvælstof vil fordampe, indtil temperaturen af morter og støder er tilstrækkelig lav. Hold lille mængde N 2liq i mørtel.
3. Udvinding af metabolitter
- Fjern frosne hjerne vævsprøve fra lageret (N 2liq tank eller -80 ° C fryser). Derefter straks overføre vævsprøve til mørtel delvist fyldt med N 2liq.
- Brug N 2liq Kolde pistil til at bryde den frosne hjernevæv i mindre stykker, der let passer ind i reagensglassene anvendes til væv homogenisering. For at forhindre stykker af frosset væv bliver projiceret ud af mørtlen i processen, opbryde væv mens der stadig er indpakket i aluminiumsplade. Slib ikke frosset væv til pulver, da dette vil gøre overførsel til reagensglasset mere vanskeligt (øget risiko for kondensvand). VIGTIGT: Gennem hele proceduren, tilføje N 2liq til mørtel, som er nødvendig for at holde prøven dybfrosset.
- Mix small stykker af frosset hjernevæv grundigt afvejes 250-350 mg og overføre til et reagensglas fyldt med iskold methanol (4 ml til 250-350 mg hjernevæv). Hver gang stykker af frosset væv tilsættes, blandes disse straks med vævshomogenisator.
BEMÆRK: komplet hele denne procedure hurtigt for at undgå (i) betydelig kondens på prøven, der ville føre til en overvurdering af prøvens vægt, og (ii) opvarmning og optøning af prøven. Individuelle vævsstykker bør være i frossen tilstand ved begyndelsen af homogeniseringen processen. - Efter det sidste stykke af den frosne rottehjerne prøve er blevet tilsat til reagensglas og homogeniseret overføre homogenatet til en ≥20 ml volumen hætteglas tæt skruelåg og lad stå på is i 15 min. Hvis omfanget af reagensglasset ikke er tilstrækkeligt stort til ≥4 ml methanol, bruge en mindre methanol volumen at homogenisere en del af den frosne hjernevæv, overføre blandingen tilhætteglas og fortsætte med at homogenisere de resterende vævsstykker med frisk methanol. Sørg for, at den samlede metanol volumen er 4 ml pr 250-350 mg hjernevæv.
- Tilsæt samme mængde iskold kloroform (dvs. 4 ml pr 250-350 mg hjernevæv) til homogenatet, vortex grundigt og lad stå på is i 15 min.
BEMÆRK: Brug altid ventileret kemisk hætte ved håndtering flygtige opløsningsmidler, navnlig kloroform! - Tilsæt samme mængde vand (dvs. 4 ml pr 250-350 mg hjernevæv) til homogenatet, vortex grundigt og lad det stå ved -20 ° C natten over.
4. Fremstilling af faseadskillelse og fordampning af opløsningsmiddel
- Forbered kold centrifuge (4 ° C, 13.000 xg ved maksimal radius) og centrifugerør. Sørg for, at sidstnævnte er ≥20 ml volumen, modstandsdygtig over for chloroform, og kan modstå centrifugale kræfter 13.000 x g. Brug dedikerede glascentrifugerør men skyl (som alle glas ware) med destilleret vand væreforgrunden brug (se 2.3).
- Forbered skylles grundigt glas Pasteur-pipetter og et passende propipettor (pære, manuel pipette pumpe, automatisk pipette bistand / pipettor etc.).
- Forbered to yderligere skylles grundigt rør (≥15 ml volumen) pr hjerne prøve, hvoraf den ene skal være resistente over for chloroform (lavet af glas eller teflon), den anden til methanol (lavet af plastik modstandsdygtig over for methanol eller glas).
- Forbered apparat opløsningsmiddelafdampning (kommercielt tilgængelige eller hjemmebygget). Kontroller, at denne enhed indeholder en fint styret strøm af tør nitrogengas, der er rettet mod overfladen af en opløsning ekstrakt indeholdende flygtige opløsningsmidler (methanol, chloroform).
- Forbered to ekstra bakker eller spande fyldt med is: én for transport prøve på is, og en anden til at holde prøver koldt i løbet af fordampning processen.
- Forbered frysetørringsapparat (fryse-tørretumbler) og nødvendige materialer til frysetørring: (i) et 50ml centrifugeglas eller vakuum rundbundet kolbe pr ekstrakt, og (ii) N 2liq at fryse den vandige fase af prøverne (≤0.3 L per prøve). Hvis der anvendes centrifugeglas også forberede bred hals vakuumfilter flaske egnet til frysetørringsapparat.
5. faseadskillelse og fordampning af opløsningsmiddel
- For fuldstændig faseadskillelse overføre methanol / chloroform / vand / hjernevæv homogenat (se 3.6) til en chloroform-resistent centrifugeglas (≥20 ml volumen) og centrifugeres ved 13.000 xg og 4 ° C i 40 min.
BEMÆRK: To faser dannes, adskilt af et lag af udfældet protein. Den nederste (tungere) fase består af methanol, chloroform og opløste lipider, mens den øvre (lysere) fase består af vand, methanol og opløste vandopløselige metabolitter. - Anvend en Pasteur-pipette til at overføre den øvre fase til en passende ≥15 ml rør (plast resistent over for methanol eller glas). Hold på jegce.
- Brug en frisk Pasteur pipette til at overføre den nedre fase til en passende ≥15 ml rør (glas eller teflon). Hold på is.
- Opbevar lag af udfældet protein ved -80 ° C, hvis den skal anvendes til bestemmelse af det totale protein; ellers kasseres.
- Hold røret med vand / methanol fase (se 5.2) på is og inddampes methanol ved at lede en tør nitrogenstrøm på overfladen af ekstraktopløsningen. Alternativt forsigtigt boble nitrogen gennem opløsningen ekstraktet. Afslut fordampning processen, når nitrogengennembobling medfører ikke længere volumen reduktion i opløsning ekstraktet. På dette tidspunkt, fortsætte med frysetørring (se 5.7), eller fryse og holde prøven ved -80 ° C med røret lukket (skruelåg eller Parafilm) indtil den er klar til frysetørring.
- Placer røret med methanol / chloroform fase (se 5.3) på is og fordampe methanol ved at dirigere en tør nitrogenstrøm på surface løsning ekstraktet. Når alt Opløsningsmidlet afdampes, afslutte processen og holde prøven ved -80 ° C med røret lukket (skruelåg eller Parafilm) indtil den er klar til NMR-analyse.
- Forbered vandfasen for Lyofilisering
- Efter afslutningen af methanol fordampning proces (se 5.5), overføres prøven til en grundigt skyllet 50 ml centrifugeglas (hvis prøven er frosset, tø før overførsel). Alternativt overføres til en vakuum rundbundet kolbe.
- Frys opløsning ekstrakt ved at dreje centrifugeglas (eller rundbundet kolbe) delvist indsat i N 2liq sådan at den indvendige overflade af røret eller kolben gradvis er dækket af frossen væske. Sørg for, at ingen N 2liq. Kan komme ind i beholderen.
- Når al væsken er frosset, dække glasset med en punkteret låg eller skruelåg at tillade damp at undslippe, og glasset anbringes i en bred hals vakuumfilter flaske.
- Start frysetørring efter attaChing kolben eller flasken til frysetørreren.
- Afslut frysetørringsprocessen, når prøven er helt tør. Hold prøven ved -80 ° C i et lukket rør (med en stram hætte!) Indtil anvendt til NMR-analyse.
BEMÆRK: Normalt ikke mere end 24 timer er nødvendige til frysetørring. Adskillige prøver kan lyofiliseres samtidigt, afhængigt af udformningen af frysetørreren, og om centrifugerør i bredhalsede flasker eller rundkolber anvendes.
6. Fremstilling af NMR-prøver
- Store tørrede og frysetørrede ekstrakter ved meget lav temperatur (≤-80 ° C). Re-opløse lyofilisater til fremstilling af NMR-prøver umiddelbart før NMR-eksperiment.
BEMÆRK: Lagring af prøver i opløsning og / eller nær stuetemperatur kan resultere i prøve nedbrydning! - Forbered en vandig 200 mM opløsning af chelatdanner, trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic syre (CDTA), som følger:
- Tilføj rent vand (f.eks 20 ml) til et reagensglas eller centrifugeglas, og tilsæt den mængde CDTA pulver for at generere en 200 mM opløsning.
BEMÆRK: En betydelig del af CDTA vil ikke være opløselig, fordi pH-værdien er meget lav, da den sure form af CDTA blev anvendt i stedet for en CDTA salt. - Derefter tilsættes forsigtigt, skridt for skridt, stigende mængder CsOH pulver til CDTA løsning, og vortex grundigt efter hver tilsætning.
BEMÆRK: opløselig CDTA fraktion vil stige med stigende CsOH indhold i den vandige opløsning. Undgå "overtitration", dvs tilføje mindre end den støkiometriske mængde CsOH til CDTA opløsning. - Når næsten alle CDTA pulveret er opløst, skal du starte måling af pH efter hver CsOH tilsætning og grundig vortexblanding. Terminate CsOH Desuden, når den endelige pH-værdi er nået (tabel 1).
BEMÆRK: På dette tidspunkt, vil alle CDTA opløses. Brugen af Cs + som modion til CDTA Generallierede foretrækkes frem Na + eller K +. Cs + er en blød Lewis-syre på grund af sin store ionradius, i modsætning til Na + og K +, der har mindre ioniske radier og er stærke syrer. Derfor Cs + danner komplekser med fosfater (hårde baser) mindre let end at gøre Na + og K +. Det er en fordel for 31P NMR-spektroskopi af phosphorylerede metabolitter fordi kompleksdannelse tendens til at øge NMR linjebredder, især under forhold med langsom til mellemliggende ionbytning.
- Tilføj rent vand (f.eks 20 ml) til et reagensglas eller centrifugeglas, og tilsæt den mængde CDTA pulver for at generere en 200 mM opløsning.
- For 31P NMR-analyse af phospholipider (PL), opløse tørrede lipider (se 5.6) i 700 pi af en opløsningsmiddelblanding bestående af deutereret chloroform (CDCI3), methanol og CDTA opløsning fremstillet som beskrevet i 6.2 (5: 4: 1 volumenforhold). Overfør prøven til et mikrocentrifugerør. Brug direkte deplacement (eller positiv-fortrængning) mikropipette med chloroform-modståant tips i begge trin.
BEMÆRK: Husk at ændre nogen af de følgende parametre vil påvirke udseendet (kemisk skift og linjebredder) i PL 31P NMR-spektre 13-17:
(I) volumenforhold CDCI3: MeOH: CDTA opløsning
(Ii), der anvendes i alt opløsningsmiddel volumen
(Iii) pH af den vandige komponent af opløsningsmidlet
(Iv) CDTA Koncentrationen af den vandige komponent af opløsningsmidlet.
BEMÆRK: I almindelighed, finjustering af disse eksempler parametre (tabel 1) er ikke nødvendig, og bør udføres med største omhu, hvis det ønskes i særlige tilfælde. Ændring af forholdet volumen mellem opløsningsmidler nemt resulterer i dannelsen af et system bestående af to faser i stedet for én homogen fase! Den ene-fasesystem blev fundet at være mere praktisk end to-fase-system i de fleste applikationer 13,14. - Ved 1H NMR-analyse af vandopløselige metabolitter opløses lyofilisatet (se 5.8) i 700 ul deuteriumoxid (D 2 O) indeholdende 3 (trimethylsilyl) propionsyre-2,2,3,3-d4-natriumsalt (TSPd 4) i millimolære område (D 2 O indeholdende 0,05% TSPd 4 er kommercielt tilgængelig) . Overfør prøven til et mikrocentrifugerør.
- Juster pH-værdien af den resulterende opløsning vandige ekstrakt til 7,3 ved tilsætning af små mængder (ca. 2 pi) deuterium chlorid (DCI) og natrium deuteroxide (NaOD) løsninger. Først starter med 0,02 N DCL eller Rigsrevisionen løsninger. Hvis 2 eller 3 efterfølgende tilsætninger ikke forårsager tilstrækkelig pH-ændring, fortsæt med 0,2 N DCL eller Rigsrevisionen løsninger. Vær forsigtig med ikke at overtitrate.
BEMÆRK: Det samlede beløb for DCI eller NaOD løsning er nødvendig, afhænger af mængden af hjernevæv udvundet; Bemærk at denne værdi for præcis metabolit kvantificering. I de fleste tilfælde er de samlede mængder af de tilsatte DCL og Rigsrevisionen opløsninger bør være næsten ubetydelig (tæt på 1% af NMR prøve volumen).
- For de bedste resultater ved at bruge en multinuclear høj opløsning NMR-spektrometer (≥9.4 Tesla feltstyrke, svarende til 162 MHz 31P eller 400 MHz 1 H resonansfrekvenser). Udover de 31 P-spole, sørge for, at 31P NMR roer besidder en 1H spole til protonafkobling. Indstil temperatur regulering af NMR sonden til den ønskede målværdi (normalt 25 ° C).
BEMÆRK: Probe temperatur kan have brug for 10-20 min at stabilisere! - Løsning Centrifuge PL ekstrakt i mikrocentrifugerør (se 6.3) ved 4 ° C og 11.000 xg i 30 min for at spinne ned faste restprodukter i prøven. Overfør 600 ul af supernatanten til en høj kvalitet NMR-rør (5 mm ydre diameter).
- Forbered passende koaksial indsætte stilk fyldt med en vandig 20 mM methylendiphosphonat (MDP) opløsning ved pH 7,0 til kemisk-shift referencerog kvantificering. Placer denne indsats i NMR-rør fyldt med opløsning PL ekstrakt.
- Monter NMR-rør med passende spinder og overførsel til NMR-magnet. Nu dreje prøven ved 15-20 Hz, og vent, indtil prøven er justeret til den indstillede temperatur (ca. 10 min).
- Minimere forsigtigt magnetisk felt inhomogenitet tværs prøve ved at justere på-aksen og off-axis shim spolestrømmene 18.
- Set NMR erhvervelse spektrum parametre optimale værdier, der kan variere som en funktion af felt magnet styrke (for en 9,4 T, se tabel 1 for anbefalede parameterværdier).
- Sæt antal transienter per eksperiment (= NS).
- Sæt NS til omkring 80 (samlet varighed af dataopsamling ca 20 min), hvis kun de mest udbredte PL'er skal kvantificeres med præcision (phosphatidylcholin (PtdCho), phosphatidylethanolamin (PtdEtn), ethanolamin plasmalogen).
- Sæt NS til omkring 100-200 (samlet varighed af derhvervelse ata 1-2 timer), hvis mindre koncentrerede PL'er skal kvantificeres (alkyl-acyl-phosphatidylcholin, phosphatidylinositol, phosphatidylserin, phosphatidsyre).
- Sæt NS til omkring 1.500-2.000 (samlet varighed af dataindsamlingen 7-10 timer; natten eksperiment) hvis meget lav koncentration PLs skal kvantificeres, f.eks phosphatidylinositol- mono og diphosphater (PtdIP og PtdIP 2), cardiolipin, lyso-PLS- , alkyl-acyl-phosphatidylethanolamin, og lejlighedsvis andre.
- Efter afslutningen af købet spektret, proces fri induktionshenfald (FID) ved hjælp af optimerede parametre. Værdierne af disse parametre varierer som en funktion af magnetisk feltstyrke, shim kvalitet, og PL signal, der skal kvantificeres.
- For at opnå de bedste resultater for hele spektret af PL'er, gentages behandling ved hjælp af flere (mindst to) forskellige filtrering procedurer. Brug stærk resolution ekstraudstyr for stærkt overlappende signaler, f.eks., For PtdCho og PtdEtnregioner.
- Brug stærke filtrering (svag eller ingen opløsning ekstraudstyr) for svage signaler.
- Filter meget svage og brede signaler uden væsentlig overlapning af apodiseringen (f.eks LB = 3 Hz) for at øge signal-støj-forhold, fx PtdIP og PtdIP 2. Se Tabel 1 for karakteristiske procesparametre.
- Kvantificer arealet for hver PL signal med hensyn til arealet under signalet referenceforbindelsen (MDP) i det samme spektrum.
- Kalibrer signal referenceforbindelsen (MDP) i et separat eksperiment ved anvendelse af en 5 mm NMR-rør fyldt med (i) en phosphorforbindelse med kendt koncentration, og (ii) det samme koaksiale indsæt stamceller anvendes i PL 31 P NMR-forsøg ( se 7.3 og 7.9).
- Beregn individuelle PL-koncentrationer baseret på relative arealer af PL-signaler på den ene side (se 7.9), og kalibrering opnåede værdi for MDP frakoaksial indsætte på den anden (se 7.10). Tage hensyn til, at antallet af fosfor kerner, der bidrager til en særlig 31P NMR-signalet kan variere som en funktion af den molekylære oprindelse af dette signal.
BEMÆRK: MDP phosphonat- signal (normalt refereres til 19,39 ppm) repræsenterer to fosfor kerner, som gør cardiolipin fosfat signalet. Alle andre PL 31 P NMR-signaler detekteres i hjerne ekstrakter repræsenterer en fosfor kerne hver. - Anvende statistikker software som nødvendige for at sammenligne hjernens PL-niveauer mellem grupper af dyr.
8. Udførelse af 1H NMR eksperiment til analyse af vandopløselige Brain Metabolitter
- Indstil temperatur regulering af 1H NMR probe til den ønskede målværdi (normalt 25 ° C). Se også bemærkninger i 7.1.
- Centrifugeres den vandige opløsning ekstrakt i mikrocentrifugerør (se 6.5) ved 4 ° C og 11.000xg i 30 min for at spinne ned faste restprodukter i prøven. Overfør 600 ul af supernatanten til en høj kvalitet NMR-rør (5 mm ydre diameter).
- Overførsel NMR-rør til NMR-magnet, mellemlæg og sat NMR-spektrum parametre erhvervelse til optimale værdier som forklaret i 7,4-7,6. Se også tabel 1 for anbefalede parameterværdier.
- Indstil antallet af transienter pr eksperiment til omkring NS = 32 (samlet varighed af datafangst ca 13 min). For at opnå gode signal-til-støj-forhold til meget svage signaler, navnlig i den aromatiske region, brug NS = 64 (samlet varighed af datafangst ca 26 min) eller mere.
- Efter afslutningen af købet spektret, proces fri induktionshenfald (FID) ved hjælp af optimerede parametre. Værdierne af disse parametre varierer lidt som en funktion af magnetisk feltstyrke, mellemlæg kvalitet, og metabolitten signal, der skal kvantificeres.
BEMÆRK: I de fleste tilfælde er det tilstrækkeligt at behandle hvert spektrum gang, Beskæftiger et sæt af procesparametre udgør et godt kompromis for alle metabolit signaler. Se Tabel 1 for karakteristiske procesparametre. - Kvantificer arealet af hver metabolit signal (ofte en multiplet, undertiden overlapper med andre slåbrokker eller multipletter skyldes forskellige molekyler) med hensyn til arealet under det signal af referencen forbindelsen (TSP-d4) i samme frekvensområde.
- Beregn individuelle metabolitkoncentrationer baseret på TSP-d4 koncentration (se 6.4). Tag hensyn til, at antallet af protoner, der bidrager til en bestemt 1H-NMR-signalet kan variere som en funktion af den molekylære oprindelse af dette signal. TSP-d4 trimethyl signal (refereres til 0,0 ppm) repræsenterer ni protoner.
- Anvende statistikker software som nødvendige for at sammenligne hjernen metabolit niveauer mellem grupper af dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at opnå den bedste opløsning i metabolisk NMR-spektre af hjernen og andre væv ekstrakter, har det længe været almindelig praksis at fjerne eller maske metalioner (vigtigst: paramagnetiske ioner) til stede i ekstraktet løsninger. Dette blev opnået enten ved tilsætning af et chelateringsmiddel, såsom EDTA eller CDTA til ekstraktet 19, eller ved at føre ekstrakten gennem en ionbytterharpiks såsom Chelex-100 20. Resultaterne præsenteret i figur 1 viser, at dette trin er ikke nødvendigt, at 1H-NMR-spektroskopisk analyse, hvis hjerneekstrakter omhyggeligt fremstilles ifølge den ovennævnte protokol. Her var yderst smalle spektrallinier opnået for alle spektrale analyserede regioner. Selv i meget overfyldte områder, fx, for glutamin / glutamat og myo-inositol / glycin, toppe ved en afstand på <0,01 ppm er næsten fuldstændigt adskilles ved 400 MHz (figur 1, nederst). Som følge heraf, kvalitativog kan tænkes kvantitativ analyse af de mange små, men i øjeblikket tildelte, toppe synlige i midten og nederste paneler af figur 1 i fremtiden.
Figur 1. underregioner af en typisk 1H-NMR-spektrum (400 MHz) i den vandige fase af et hjernevæv ekstrakt fra en kvindelig Lewis rotte. Alle tre paneler demonstrere ekstremt høj opløsning kan opnås under anvendelse af protokollen beskrevet i dette dokument. Hverken chelatdanner eller ionbytterharpiks er blevet anvendt under forberedelsen. Center og nederste paneler viser eksistensen af mange tildelte lavintensive toppe, der antyder det enorme dynamikområde dækket af høj opløsning 1H NMR-spektroskopi af vævsekstrakter, hvis det sker ved hjælp af optimerede eksperimentelle parametre. Disse svag men godtdetekterbare signaler kan potentielt identificeres og kvantificeres i fremtiden. Flere påviste metabolitter er specifikke af hjernevæv, fx Neuron markør NAA eller neurotransmitteren GABA.; imidlertid er de fleste forbindelser er involveret i et bredt spektrum af metaboliske veje, som er fælles for mammale celler, såsom aminosyre, forgrenet organisk syre, polyol (phospho) lipid og energimetabolisme såvel som i glycolyse og glutaminolysis, og funktioner såsom osmoregulering, cellevækst og proliferation. Stjernen betegner methyl resonans, der hidrører fra en methanol urenhed. Forkortelser: ala, alanin; lac-, lactat; threo-, threonin; BHB, β-hydroxybutyrat; val, valin; ile, isoleucin; leu, leucin; AAB, α-aminobutyrat; AHB, α-hydroxybutyrat; Tau, taurin, SCY -Ins, scyllo inositol, myo -Ins, myo-inositol; GPC glycerophosphocholine; PC, phosphocholin; cho, cholin; CRN, kreatinin; Cr, kreatin; GABA,47; aminobutyrate; asp, aspartat; NAA, N -acetylaspartate; Gin, glutamin; glu, glutamat; suc, succinat; NANA, N -acetylneuraminate; ac, acetat; Gly, glycin. De små toppe ved foden af ala dublet stammer fra laktat 13C satellit dublet (øverste panel). Genoptrykt under Creative Commons Attribution License (CCAL) vilkår fra Lutz NV m.fl. (2013) Cerebral biokemiske veje i eksperimentel autoimmun encephalomyelitis og adjuvansarthritis:. En sammenlignende metabolomiske undersøgelse. PLoS ONE 8 (2):. E56101 Klik her for at se en større version af dette tal.
I 31P NMR-spektroskopi, maskering eller fjerne paramagnetiske kationer (hovedsagelig jern) er utvivlsomt en nødvendighed, fordi fosfater let danne komplekser med divalente og trivalente ioner. Tilsætning af CDTA uddrag påvirker både spektral linjebredder end kemiske skift; sammenligne figur 2, øverste og nederste venstre. Linje indsnævring ved at vælge 1,000 mM (nederst til venstre) i stedet for 200 mM (øverst til venstre) CDTA var ønsket, men resulterede i superposition af PL signaler, der skal kvantificeres separat (øverst til venstre). Derfor er 200 mM CDTA anbefales til den vandige komponent af PL opløsningsmiddel, alle andre betingelser er lige. Desuden temperatur prøve under målingen påvirker spektrallinje bredder og kemiske skift; sammenligne Figur 2, øverst og nederst til højre. Linje indsnævring ved at vælge 277 K (nederst til højre) i stedet for 297 K (øverst til højre) var ønsket, men resulterede i superposition af PL signaler, der skal kvantificeres separat (øverst til højre). Derfor 297 K anbefales, da temperaturmåling, alle andre betingelser er lige. Sammenligning mellem de to øverste paneler viser, at et fald i CDTA koncentration fra 200 mM (øverst til venstre) til 50 mM (øverst til højre) kun resulterer ien beskeden stigning i linjer, og i næsten ingen ændring i kemiske skift. Bemærk dog, at koncentrationen væv i 50 mM CDTA ekstrakt er halvt så højt som det er i 200 mM CDTA ekstrakt, forklarer de relativt smalle linjer i det øverste højre panel 13.
Figur 2. Phosphatidylethanolamin (PtdE) regioner af phospholipid 31P NMR-spektre (162 MHz) af hjernevæv uddrag fra Lewis hunrotter (øverste venstre panel) Hjernevæv koncentration, 236 mg / ml.; CDTA koncentration og pH i den vandige komponent af opløsningsmidlet, 200 mM, og 7,33, henholdsvis; temperaturmåling, er 297 K. PtdE plasm og SM-signaler godt løst (nederst til venstre) Hjernevæv koncentration, 236 mg / ml.; CDTA koncentration og pH i den vandige komponent af opløsningsmidlet, 1.000 mM, og 7,36, henholdsvis; temperatur måling, 297 K. PtdE plasm og SM signaler helt overlapper; de kan ikke løses på trods af reduceret linje bredde, sammenlignet med den øverste venstre spektrum (øverst til højre) Hjernevæv koncentration, 118 mg / ml.; CDTA koncentration og pH i den vandige komponent af opløsningsmidlet, 50 mM, og 7,14, henholdsvis; temperaturmåling, 297 K. PtdE og SM-signaler er godt løst (nederst til højre) Hjernevæv koncentration, 118 mg / ml.; CDTA koncentration og pH i den vandige komponent af opløsningsmidlet, 50 mM, og 7,14, henholdsvis; temperatur måling, 277 K. PtdE og SM-signaler helt overlapper; de kan ikke løses, på trods af reduceret linje bredde i forhold til den øverste højre spektrum. Forkortelser: PtdE plasm, ethanolamin plasmalogen; PtdE, phosphatidylethanolamin; SM, sphingomyelin; PtdS, phosphatidylserine; PTDC phosphatidylcholin. Genoptrykt med tilladelse fra Lutz NW et al. (2010) Multiparametric optimering af 31P NMR-spektroskopisk analyse af phospholipider i rå vævsekstrakter. 1. Kemisk skift og signal adskillelse. Anal Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.
Under anvendelse af ovennævnte protokol (en-fase-system 14, Figur 3, øverst til venstre), blev påvist et stort antal kvantificerbare PL'er (Figur 3, øverst til højre), der dækker en betydelig koncentrationsområde (bemærk trunkerede højintensive signaler). Nogle af disse signaler endnu ikke er tildelt (U1, U2, U6). Hvis prøveforberedelse, NMR-måling og spektrum behandlingen udføres som angivet i denne protokol, spektral opløsning er selv tilstrækkeligt til rutinemæssigt detect delvis opsplitning af visse toppe (PtdS, PtdE, PtdE plasm, AAPtdE, nederst til venstre). . Som en konsekvens, kvalitativ og kvantitativ analyse af yderligere PL undergrupper kan komme på tale i fremtiden figur 3, nederst til højre, illustrerer magt velovervejet udvalgte procesparametre til delvis separate signaler med lav koncentration forbindelser (her: PtdC1u, en PL afledt fra PTDC som ikke er fuldt identificeret, og PTDC plasm) resonating tæt på meget stærke signaler (her: PTDC).
Figur 3. Phospholipid 31P NMR-spektroskopi (162 MHz) af hjernevæv uddrag fra Lewis hunrotter. (Øverste venstre panel) En en-fase-system (til venstre) blev foretrukket frem for en to-fase-system (til højre). Den almindeligt anvendte tofasesystem hindrer korrektPL kvantificering fordi det meste af den øvre fase er placeret uden for følsomme volumen af spolen. (Top højre panel) Komplet 31P NMR-PL spektrum af rottehjerne. For bedre synlighed af svage signaler (PtdIP, PtdG), eksponentiel linjeudvidelse (LB = 3 Hz) blev anvendt. I denne repræsentation, flere PL-signaler er ikke godt-løst, navnlig i PTDC og PtdE regionerne. For PL'er genererer mere end en 31P NMR-signal, der observeres kerner understreget (P TDIP, PtdI P, P TDIP 2, PtdI P 2). I øjeblikket tildelte signaler betegnes med "U n" (hvor n = 1, 2, ...). (Nederst til venstre panel) PtdE og PtdS regioner i samme spektrum. For bedre top resolutionen blev Lorentz-gaussisk linje facon transformation anvendt (LB = -1 Hz, GB = 0,3). På grund af disse procesparametre, er svære at opdage mange meget svage PL signaler. Dog kan mindst to toppeanes for hver PtdE, PtdE plasm, AAPtdE og PtdS. (nederst til højre panel) PTDC region opnået med de samme procesparametre som PtdE regionen. Flere signaler ved foden af den dominerende PTDC resonans blev påvist utvetydigt, mens de ikke kan skelnes i den øverste spektrum genereres med eksponentiel linjeudvidelse (AAPtdC, PTDC plasm, PtdC1u). Udover den aktuelt ikke er tildelt PTDC analog, PtdC1u yderligere mindre resonanser kan være til stede ad banen fra PTDC. Forkortelser: PtdIP phosphatidylinositol phosphat; PtdIP 2 phosphatidylinositol diphosphat; PTDA, phosphatidinsyre; PtdG, phosphatidylglycerol; CL cardiolipin; PtdE .., summen af PtdE, PtdE plasm og AAPtdE; PtdI phosphatidylinositol. For yderligere forkortelser se legenden til figur 2. Genoptrykt med tilladelse fra Lutz NW et al. (2010) Multiparametric optimering af 31P NMR-spektroskopisk analyse af phospholipids i rå vævsekstrakter. 1. Kemisk skift og signal adskillelse. Anal Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Høst og Frysning Rat Brain | |||
| Dewar for N 2liq.; indefrysning klemme (fx hjemmelavet Wollenberger tænger, dommere 1 og 2, i bunden af tabellen.); anæstesi kammer; kirurgiske sakse; skalpel; 500 ml flaske med rengøring alkohol | 1 i hver | ||
| Tang | 2 | ||
| 1 ml sprøjte, 10 ml sprøjte | 1 i hver per dyr | ||
| 25 G nåle | 2 pr dyr | ||
| Prøve preparation | |||
| Typisk mængde af hjernevæv pr udvinding | 250-350 mg | ||
| MeOH volumen bruges i homogenisering 250-350 mg hjernevæv | 4 ml | ||
| 5 ml plastik pipette | 3 pr ekstrakt | ||
| 10 ml plastik pipette | 1 pr ekstrakt | ||
| Hætteglas (≥20 ml volumen) | 1 pr ekstrakt | ||
| Chloroform-resistente centrifugerør | 1 pr ekstrakt | ||
| Ventetid efter væv homogenisering i MeOH (blanding ved 4 ° C) | 15 min | ||
| Vand og CHCl3 volumen tilføjet til hjernevæv homogeniseres i 4 ml MeOH | 4 ml hver | ||
| Venter periode efter blanding homogeniseret væv med vand og CHCI3 (blanding ved -20 ° C) | natten over | ||
| Centrifugering til adskillelse of vandigt fra organiske ekstrakt fase (glas centrifugeglas) | 13.000 x g, i 40 min ved 4 ° C | ||
| Koncentration af CDTA opløsning (vandig fase af opløsningsmiddelblanding til opløsning ekstraherede lipider) | 200 mM | ||
| pH i vandige fase opløsningsmiddelblanding til opløsning ekstraherede lipider | 7.4 | ||
| Volumenforholdet i lipidopløsningsmidlet En brugt til 31P PL analyse (CDCl3: MeOH: CDTA opløsning) | 5: 4: 1 | ||
| Mængden af opløsningsmiddel A anvendes til at opløse lipider udvundet fra 250 til 350 mg hjernevæv | 700 ul | ||
| Centrifugering til spinding ned faste partikler i NMR-prøven (mikrocentrifugerør) | 11.000 xg i 30 min ved 4 ° C | ||
| pH NMR prøve indeholdende vandopløselige nedbrydningsprodukter | 7.3 | ||
| Prøvevolumen overført til NMR-rør, efter centrifugalugation | 600 pi | ||
| MDP-koncentrationen i koaksial indsætte stamceller til 31P-NMR | 20 mM | ||
| NMR Eksperimenter | |||
| Prøve temperatur under NMR-forsøg (kan tilpasses for at minimere top overlap) | 25 ° C | ||
| Spinning frekvens under NMR eksperiment | 15-20 Hz | ||
| 1 H-NMR Acquisition Parametre | |||
| Opløsningsmiddel tilvejebringe 2H låsesignalet | D2O | ||
| Excitation impulsbredde P1 | 11 mikrosekunder | ||
| Excitationspuls, forstærker dæmpning, PL1 | 0 dB | ||
| FID størrelse, TD | 32 k | ||
| FID erhvervelse time, AQ | 3.283 sek | ||
| Afslapning forsinkelse, D1 | 15 sek | ||
| Opløsningsmiddel undertrykkelse forsinkelse, D4 | 6 sek | ||
| Samlet gentagelse tid, TR | 24,3 sek | ||
| Spektralbredde i ppm, SWP | 12,47 ppm | ||
| Spektralbredde i Hz, SW | 4.990 Hz | ||
| Modtager gevinst, RG | 512 | ||
| Opløsningsmiddel undertrykkelse (kontinuerlig bølge) | CW | ||
| Opløsningsmiddel undertrykkelse, forstærker dæmpning, PL9 | 50 dB | ||
| Antallet af transienter, NS | 32 eller 64 | ||
| 31P NMR optagelsesparametre | |||
| Opløsningsmiddel tilvejebringe 2H låsesignalet | CDCI3 | ||
| Excitationspuls wiDTH, P1 | 9,5 mikrosekunder | ||
| Excitationspuls, forstærker dæmpning, PL1 | 4 dB | ||
| FID størrelse, TD | 16 k | ||
| FID erhvervelse tid, AQ | 2.019 sek | ||
| Afslapning forsinkelse, D1 | 15 sek | ||
| Samlet gentagelse tid, TR | 17 sek | ||
| Spektralbredde i ppm, SWP | 25 ppm | ||
| Spektralbredde i Hz, SW | 4.058 Hz | ||
| Modtager gevinst, RG (maksimum) | 16.384 | ||
| Protonafkobling (sammensat puls afkobling) | CPD | ||
| Proton afkobling, forstærker dæmpning, PL13 | 19 dB | ||
| Antallet af transienter, NS | 1.500 eller 2.000 | ||
| NMR Databehandling | 1H Resolution Enhancement, Gauss-Lorentz Lineshape Transformation | ||
| Samlet vurdering af frekvenser (hvis påkrævet, optimere særskilt for de enkelte spektrale regioner, anvendelse af 0,1 <DK <0,4, og -0.6 <LB <-0.2 Hz) | GB = 0,15, LB = -0.2 Hz | ||
| Meget svage signaler, fx, aromatiske syrer (alternativt til apodiseringen med LB ≥ 0,5 Hz) | GB = 0,015, LB = -0.3 Hz | ||
| Områder under toppe: brug lineshape passer til overlappende resonanser | |||
| 31P opløsning ekstraudstyr, Gauss-Lorentz lineshape forvandling | |||
| Samlet vurdering af frekvenser (optimere særskilt for de enkelte spektrale regioner, anvendelse af 0,05 <DK <0,2, og -3.0 <LB <60; -1.0 Hz) | GB = 0,05, LB = -1.0 Hz | ||
| Meget svage signaler, fx PtdIP 2, Ptda: apodiseringen | LB = 3 Hz | ||
| Områder under toppe: brug lineshape passer til overlappende resonanser | |||
| Referencer | |||
| 1. Palladino GW, Træ JJ, Proctor HJ. Modificeret fryse-clamp-teknikken til vævsassay. The Journal of kirurgisk forskning 289, 188-190 (1980). | |||
| 2. Wollenberger A, Ristau O, Schoffa G. [En simpel teknik til ekstremt hurtig nedfrysning af store stykker af væv]. Pflugers Archiv fur die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere 270, 399-412 (1960). | |||
Tabel 1. Eksperimentelle parametre for høj opløsning 1 time og 31 P-NMR-spektroskopi af hjernenvævsekstrakter Typiske værdier for volumenforholdene og koncentrationer af opløsningsmidler og reagenser, der anvendes i hjernevæv udvinding og NMR-prøveforberedelse. præsenteres. Yderligere anbefalede værdier vedrører prøve pH og temperatur måling, samt NMR erhvervelse og behandling parametre. Mindre justeringer kan være nødvendige, især hvis protokol gælder for de andre end hjernen væv. NMR-parametre er blevet optimeret til målinger ved 9,4 T og bør justeres efter behov for spektrometre opererer på forskellige magnetisk feltstyrke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NMR-spektroskopi er en effektiv metode til måling af koncentrationer af kemiske forbindelser i opløsning i en meget reproducerbar og nøjagtig måde. Men for at opnå data af høj kvalitet er det nødvendigt at overholde visse regler om forberedelse og analyse prøve. Ved opgørelsen af metabolitkoncentrationer ved NMR-spektroskopi, hverken generation eller modtagelse af NMR-signalet dominerer kvantificering fejl, medmindre intensiteten af en observeret signal nærmer detektionsgrænsen (især svagt signal). I alle andre tilfælde biologisk variation prøvefremstillingen teknik (udvinding effektivitet, fysiske og kemiske stabilitet af forbindelser, pipetteringsanordninger og vejer fejl etc.), og / eller valg af erhvervelse og behandling signal parametre vil bestemme præcision og nøjagtighed af resultater. Selvfølgelig vil enhver metaboliske ændringer, der opstår under væv høst også afspejles i metabolitkoncentrationer opnåred. Derfor er det meget vigtigt at fuldføre væv høst så hurtigt som muligt og at anvende særlige væv fryseteknik såsom tragt frysning hvis nøjagtige in vivo koncentrationer af hurtigt metaboliserende forbindelser er vigtige (navnlig glucose, lactat, ATP og dets katabolitter, ADP og AMP).
Selv ved den mellemliggende magnetiske feltstyrke (9,4 T) i en rutinemæssig høj opløsning NMR-spektrometer fremragende spektre kan opnås. For eksempel, i 1H-NMR-spektre af den vandige fase af rottehjerne ekstrakter, signaler, hvis forskel i kemiske skift, Δδ, udgør a ca 0,005 ppm (svarende til 2,0 Hz ved 400 MHz resonansfrekvens) kan skelnes og kvantificeres separat. Dette er illustreret ved den delvise adskillelse af (i) lactat og threonin dubletter, og (ii) alanin dublet fra de små toppe ved bunden (lactat 13C satellit dublet, figur 1,øverst). Spektrometre, der opererer ved højere områder (14.1 eller 18.8 T) vil øge opløsning og følsomhed yderligere, selv om disse instrumenter er mindre almindelige i NMR laboratorier grund af deres høje omkostninger til indkøb.
Brug 1H NMR-spektroskopi, kan en bred vifte af metabolitter analyseres samtidigt, altså i et enkelt køb. Følsomheden af forsøget kan forbedres ved at øge antallet af akkumulerede transienter, selv om dette valg øger måletid proportionalt. (Signal-til-støj-forholdet er proportionalt med kvadratroden af antallet af transienter.) Den maksimale samlede tid erhvervelse givet i ovennævnte protokol (20 - 30 min) skal være tilstrækkelig til næsten alle formål, medmindre mængden af tilgængeligt væv til ekstraktion er meget begrænset. Udover at gøre brug af de NMR-følsom kerne (proton), metabolomiske 1H NMR-spektroskopi har den fordel, omfattendedatabaser er til rådighed for forskellige feltstyrker og prøve pH-værdier 10. Desuden har software til automatisk eller halvautomatisk spektrum evaluering foreligger 10.
Mens 1H NMR spektre af vævsekstrakter kan godt løses uden tilsætning af chelateringsmidler, er dette ikke længere er tilfældet for 31P-NMR-spektre. Faktisk koncentrationen af chelatdanner bruges (fx EDTA eller CDTA) har en betydelig indflydelse på både linjebredde og kemisk skift af 31 P NMR-signaler stammer fra phosphorylerede metabolitter. Stigende CDTA koncentration i et ekstrakt falder 31 P NMR linjebredder, men denne fordel kan blive opvejet af mindre forskelle mellem kemiske skift, Δδ, i nabolandene toppe. Derfor er mængden af chelateringsmiddel anvendes, er at være optimeret til både linjebredde og kemiske skift sammen. I lipidekstrakter disse to spektrale parametre er significantly påvirket af den samlede prøve koncentration, dvs mængde væv udvundet, men også af pH-værdien og temperaturen af prøven under NMR-målingen. Derfor må enhver optimering af målebetingelser overveje de kombinerede virkninger af alle eksperimentelle parametre involverede nogle af disse ikke er additiv. Kompleksiteten af denne situation er illustreret ved adfærd PL 31P NMR-spektre i figur 2 viste. Selvom koncentrationen laveste væv (118 mg / ml), den laveste temperatur (277 K) og den højeste CDTA koncentration (1,000 mM) testet ville resultere i nederste linje bredde, den foreslåede protokol anbefaler brug af moderat koncentration væv (236 mg / ml), intermediære CDTA koncentration (200 mM) og stuetemperatur (297 K) for at undgå signal overlapning.
Selv om betingelserne for prøveforberedelse og erhvervelse spektret er af allerstørste betydning, atrolle af frekvenser procesparametre i at udvinde et maksimum af oplysninger fra de tilkøbte rådata bør ikke undervurderes. Et særligt sæt af procesparametre min være ideel til detektion og kvantificering af PL'er, som opstår ved lave koncentrationer; dog kan det samme sæt af parametre tilslører enkelte toppe i »overfyldte« spektrale regioner (Figur 3, øverst til højre). Omvendt ville procesparametre giver optimal opløsning forbedring i regioner stærkt overlappende resonanser (figur 3, nederst) gøre lavintensive toppe målbart. Den seneste udvikling, herunder også en omfattende PL 31P NMR-database 13,14, i høj grad lette analysen af NMR-spektre 13,14.
I sidste ende, skal målene med den tilgrundliggende ansøgning definere kriterierne for optimering, dvs den ønskede balance af spektral opløsning, følsomhed, præcision metabolit quantifgement, hastighed og andre faktorer. For eksempel den anbefalede fase system til PL analyse tillader mere pålidelig og effektiv PL kvantificering end tofasesystemer (Figur 3, øverst til venstre), og giver høj spektral opløsning samt tilstrækkelig følsomhed til kvantificering af mindre rigelige PL'er . Men i tilfælde, hvor bedste signal adskillelse er meget højere prioritet end effektiv og præcis kvantificering anvendelse af en højere procentdel af chloroform-d i opløsningsmiddelblandingen kan forsøges, selvom dette let fører til faseseparation i prøven. Hvis dette er tilfældet, skal bestemmes volumenet af den nedre fase for at opnå absolutte PL mængder (mg PL pr g væv eller mg totalt protein).
I proton-afkoblet heteronukleare NMR eksperimenter kan signalintensiteter ændres af nukleare Overhauser effekter (NOE), i tillæg til mætning på grund af hurtige ordninger erhvervelse. Hvis ukorrigeret disse effekter resulterer i metabolit quantitation fejl. Der er to alternative strategier til at håndtere denne udfordring. I den første metode, der individuelle transienter af en overtagelse adskilt af lange forsinkelser. Denne metode undgår enhver mætning eller NOE men resulterer i relativt lange eksperimenter; det skal bruges, hvis der er behov for præcise og nøjagtige resultater. I nogle tilfælde kan prioritet skal gives til hurtig spektrum erhvervelse, navnlig for meget fortyndede prøver, som kun kan måles ved et højt antal af transienter. I sådanne tilfælde vil tilsætning af paramagnetiske afslapning agenter til prøven tillade erhvervelse hurtig data uden mætning eller NOE. Alternativt kan anvendes hurtigt datafangst uden tilsætning af paramagnetiske midler. Sidstnævnte metode kræver Korrektion af signalet områder ved hjælp af korrektionsfaktorer, der skal bestemmes for hver NMR-resonans, mens tilstedeværelsen af afslapning agenter medfører en vis udvidelse af NMR-signaler, der kan reducere præcisionen af metabolit kvantificering foroverfyldte spektrale regioner. Generelt er det optimale valg af eksperimentelle betingelser ikke blot dikteret af prøvetypen, men også ved oplysninger, der udtrækkes fra et eksperiment 13. Hvis høj prioritet skal gives til hurtig analyse af forholdsvis rigelige metabolitter, uden behov for høj præcision og nøjagtighed, kan det være passende at måle meget koncentrerede prøver og beskæftiger korte gentagelse gange, eventuelt med paramagnetiske afslapning middel til prøven. Hvis derimod nøjagtig kvantificering af et stort antal metabolitter er vigtigere end hastighed, foretrækkes det at anvende mindre koncentrerede ekstrakter og acceptere lange NMR erhvervelsestider som påvist ved protokollen fremlagt her. Desuden, hvis et bestemt forskningsprojekt fremhæver bestemte metabolitter, eksperimentelle betingelser kan justeres for at opnå optimal spektral opløsning for de spektrale pågældende regioner. Protokollen og diskussion præsenteres her kan tjene som vejledning for optimization af metabolomiske analyse af rå vævsekstrakter ved NMR-spektroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
| Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
| Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
| Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
| Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
| Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
| Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
| Electronic scale | Sartorius | n/a | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
| Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15 ml, 30 ml tube |
| Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
| Polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10 ml volumes |
| Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96% deuterated |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96% deuterated |
| Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20% in deuterium oxide |
| Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30% in deuterium oxide |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
| Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
| pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
| NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
| NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| Pipettes | Eppendorf | Research | With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl |
| Pipet-Aid | Drummond | XP | |
| NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
| NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
| Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
| Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity |
| Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
| TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |
References
- Manger, P. R., et al. Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction. Front Neuroanat. 2, 5 (2008).
- Buxbaum, J. D., et al. Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features. Mol Autism. 3, 1 (2012).
- Papaioannou, V., Behringer, R. R. Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).
- Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).
- Mallolas, J., et al. A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke. The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).
- Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).
- Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model. PLoS ONE. 2, e157 (2007).
- Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. Methodologies for Metabolomics. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E.
- Wishart, D. S. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats. Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).
- Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel. NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution. Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation. Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Methodologies for Metabolomics. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study. PLoS ONE. 8, e56101 (2013).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy. Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).
- Pearson, G. A. Shimming an NMR magnet. , University of Iowa. Iowa City. (1991).
- Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. Biophysical tools for biologists. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).
- Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats. Stroke. 20, 633-640 (1989).
