Introduction
Modelli murini sono stati utilizzati estesamente nella ricerca sul cervello 1. Correlazioni genotipo-fenotipo sono stati studiati nel topo e ratto cervello studiando l'espressione genica a RNA e / o livelli di proteine da un lato, e fenotipi morfologici, funzionali, elettrofisiologiche e / o comportamentali dall'altro 2-6. Tuttavia, per comprendere completamente i meccanismi che collegano fenotipo al genotipo, è indispensabile studiare gli eventi molecolari a valle di espressione della proteina, cioè. il metabolismo dei substrati biochimici su cui agiscono gli enzimi 7. Questa esigenza ha portato, nel corso degli ultimi 10 o 15 anni, a una rinascita della ricerca metabolica in molti rami della biologia 8,9. Mentre studi metabolici classici si sono spesso concentrati su dettagli di specifici percorsi, il nuovo approccio metabolomica è orientata verso un'indagine onnicomprensiva del profilo metabolico globale del tessuto in esame.Una conseguenza di questo concetto è un evidente bisogno di strumenti analitici che riducono al minimo pregiudizio verso specifici percorsi e / o classi di composti metabolici. Tuttavia, un saggio biochimico classica è basata su una particolare reazione chimica di un analita che deve essere specificato prima di eseguire il test. Per contro, tecniche spettroscopiche come la risonanza magnetica (NMR) nucleare e la spettrometria di massa (MS) (i) sono basati su particolari (fisici) proprietà molecolari di composti biochimici, ciascuna delle quali dà luogo ad uno o più segnali distinti in uno spettro rilevato nel corso di un esperimento; e (ii) rilevare un gran numero di diversi composti per esperimento.
Così, ogni spettro contiene le informazioni combinate di tutta una serie di metaboliti. Per questo motivo, i metodi spettroscopici sono strumenti adeguati per la metabolomica, in quanto nessuna selezione preventiva deve essere fatta per quanto riguarda la natura dell'analita da misurare 8
Anche se la spettroscopia NMR e MS possono essere usati in modo intercambiabile per l'analisi di molti metaboliti, ogni metodo possiede vantaggi e gli svantaggi che sono stati recentemente recensito 10 specifici. In breve, la spettroscopia NMR di solito può essere eseguita da estratti grezzi e non richiede la separazione cromatografica di composti del campione prima dell'analisi. Al contrario, MS funziona con gas o cromatografia liquida (GC o LC) separazione, ad eccezione di particolari sviluppi recenti come l'imaging spettrometria di massa. In alcuni casi particolari, come l'analisi degli zuccheri, separazione LC può diventare una necessità per la spettroscopia NMR così, perché le linee di risonanza di zuccheri diversi si sovrappongono in modo significativo nel protone (1 H) spettri NMR. Tuttavia, spettroscopia 1 H NMR senza chrseparazione omatographic rimane il più popolare quasi universalmente applicata metodo NMR metabolomica,. In generale, la preparazione del campione è più lungo e complesso per MS di quanto lo sia per la spettroscopia NMR. Gravi problemi dovuti agli effetti della matrice sono molto meno comuni in spettroscopia NMR che in Stati membri in cui essi possono condurre a segnali notevolmente attenuati. Metabolita quantificazione può essere ottenuto con entrambi i metodi. Tuttavia, sono necessari più composti standard per la SM a causa di variazioni di effetti matrice e l'efficienza di ionizzazione tra metaboliti. Al contrario, è necessario un solo standard per ogni campione per l'analisi spettroscopica NMR perché in condizioni di misura adeguate, il secondo metodo è intrinsecamente quantitative grazie alla risposta NMR strettamente lineare dai nuclei osservati. Un grave inconveniente di NMR è la sua relativamente bassa sensibilità. MS, in particolare, LC-MS, è più sensibile NMR di diversi ordini di grandezza; per questo motivo, MS è da preferire NMR per laanalisi dei composti presenti a concentrazioni molto basse. D'altra parte, la natura non distruttiva dell'esperimento NMR è un chiaro vantaggio rispetto MS; in questo modo, NMR può essere eseguita più volte sullo stesso campione, ad esempio, per i diversi nuclei NMR attivo come 1 H, fosforo-31 (31 P), carbonio-13 (13 C), fluoro-19 (19 F) etc., in quanto nessun materiale viene consumato da NMR rispetto alle misurazioni MS.
Sia NMR e MS possono essere impiegati in modi differenti, ognuno dei quali è ottimale per la rivelazione di composti con particolari caratteristiche chimiche. Per esempio, 31 P NMR è spesso più adatto di 1 H NMR per l'analisi di composti fosforilati moderatamente concentrati, sebbene metaboliti fosforilati quasi tutti contengono anche protoni. Tuttavia, i loro segnali 1 H NMR possono essere oscurate da 1 H NMR i segnali provenienti da altri composti, non fosforilata, mentre il secondoovviamente non causano segnali di fondo in 31 P NMR. In una situazione analogico, analisi 19 F NMR è da preferire per i composti fluorurati, ad esempio, farmaci fluorurati (nessun segnale di fondo di metaboliti endogeni), mentre il caso speciale di 13 C NMR è di interesse quasi esclusivamente se il destino di 13 C deve essere seguita, a causa della estremamente bassa abbondanza naturale dell'isotopo 13 C (circa 1%) etichettati precursori metabolici esogeni. Molti spettrometri di massa operano in modalità ioni negativi o in modalità ioni positivi. Pertanto, è importante conoscere in anticipo l'analisi se gli ioni da osservare sono caricati negativamente o positivamente. Ci concentriamo qui su un protocollo per l'analisi del metabolome tessuto cerebrale da 1 H e 31 spettroscopia NMR P perché questo metodo produce un gran numero di importanti concentrazioni di metaboliti a basso costo, in termini di (i) il tempo necessario per la preparazione del campione unnd (ii) lo sforzo richiesto per metabolita quantificazione. Tutti gli esperimenti possono essere eseguiti utilizzando l'attrezzatura di un laboratorio standard di wet-chimica e una struttura di spettroscopia NMR ad alta risoluzione. Ulteriori requisiti sono descritti nella sezione Protocollo di seguito.
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Protocol
NOTA: ANIMAL DICHIARAZIONE ETICA
Gli studi sugli animali sui ratti hanno seguito le linee guida vigenti in Francia, e sono stati approvati dal Comitato Etico locale (# 40.04, Università di Aix-Marseille Medical School, Marsiglia, Francia).
1 raccolta e congelamento Rat Brain
- Preparare articoli richiesti: azoto liquido (N 2liq.) In Dewar che è grande abbastanza per mantenere un morsetto di congelamento (almeno 2-3 L di volume); anestetico (ad esempio, isoflurano, o ketamina / xilazina); camera di anestesia; strumenti di dissezione sterili: forbici chirurgiche, bisturi, pinze; salviette di tessuto e bottiglia con la pulizia alcol (etanolo); aghi (25 G); 1 ml e 10 ml siringhe. Fogli di alluminio Label (ca. 10 x 10 cm) con nastro adesivo. Usare i fogli per avvolgere i singoli cervelli di ratto freeze-bloccato.
NOTA: Indossare sempre guanti protettivi e occhiali di protezione degli occhi o maschera quando si maneggia l'azoto liquido! - Riempire Dewar con N 2liq. Ed inserire gratismorsetto zing in un Dewar. Assicurarsi che la quantità di N 2liq nel Dewar è sufficiente per ripetute procedure di congelamento-clamp (diversi litri, la quantità di N 2liq evaporazione durante ogni freeze-bloccaggio dipende dalle dimensioni della pinza).
- Anestetizzare animale (ad esempio, da isoflurano, oppure mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina / xilazina). Procedere a eutanasia mediante puntura cardiaca per prevenire le emorragie durante cuoio capelluto viene rimosso e il cranio è aperto. Passi 1,4-1,7 sotto descrivono la procedura standard.
NOTA: Nei protocolli speciali che richiedono la massima conservazione del glucosio e ad alta energia metaboliti, il sacrificio ratto-imbuto congelamento del cervello dell'animale anestetizzato con N 2liq 11, dopo un ritorno del cuoio capelluto. Poi, sezionare il cervello dal cranio sotto intermittente N 2liq per minimizzare post mortem metabolismo 12. - Inumidire testa di ratto con alcol per pulizia. Usare le forbici chirurgiche a (i) remove cuoio capelluto, e (ii) il cranio aperto lungo suture craniche.
- Usare pinze per aprire ulteriormente il cranio, e di togliere tutto il cervello da sotto il cranio aperto, posizionando la testa a testa in giù. Rimuovere subito eventuali tracce visibili di sangue utilizzando salviette di tessuto. Se emisferi cerebrali sono metabolicamente e morfologicamente simmetrica, è conveniente utilizzare uno degli emisferi per l'analisi metabolica dopo la separazione dalla emisfero mediante incisione con il bisturi. Se necessario, utilizzare l'emisfero rimanente per altri studi del cervello come istologia.
- Rapidamente rimuovere congelamento morsetto da N 2liq -filled Dewar, posizionare intero o metà cervello di ratto su una superficie interna, morsetto e inserire subito il congelamento morsetto in N 2liq -filled Dewar tenendo morsetto saldamente compressa. Assicurarsi che i punti 1.3-1.6 non durare più di 60 sec.
- Dopo 1-2 minuti togliere il congelamento morsetto dal Dewar, pinza aperta, allentare il tessuto cerebrale congelato dalla pinza, e avvolgeretessuti congelati in lamiera di alluminio opportunamente etichettati (vedi 1.1 sopra). Assicurarsi che l'etichetta sia leggibile e rimane saldamente in posizione dopo che il campione è avvolto. Introdurre rapidamente campione avvolto in N 2liq. Eseguire l'intera procedura il più rapidamente possibile per evitare lo scongelamento del tessuto cerebrale congelato.
- Conservare campione congelato in N 2liq o in un congelatore a -80 ° C fino al momento dell'estrazione metabolita.
NOTA: Ogni volta che un campione biologico deve essere conservato per più di un anno, la conservazione a temperatura 2liq N è da preferire -80 ° C. Ciò vale anche per il resto di questo protocollo.
2 Preparazione del metabolita Estrazione procedura
- Preparare omogeneizzatore tessuto e provette corrispondenti (ad esempio, 10 mm di diametro interno, a seconda del diametro dell'albero omogeneizzatore, di solito in plastica). Utilizzare omogeneizzatori elettrici piuttosto che omogeneizzatori guidati manualmente (smerigliatrici tessuto). Prepare vortex e bilancia da laboratorio.
- Preparare secchio pieno di ghiaccio tritato. Tenere quantitites sufficiente di metanolo, cloroformio e acqua sul ghiaccio (4 ml ciascuno a 250-350 mg di tessuto cerebrale congelato).
- Preparare pipette di trasferimento e fiale.
- Preparare flaconcini di vetro (≥20 di volume ml) con tappo a vite e posto sul ghiaccio (una fiala ogni estratto di tessuto). Fit Tappi a vite con un resistente al cloroformio setti Teflon.
- Preparare 5 ml pipette di plastica per l'erogazione di metanolo e acqua, e pipette in vetro o siringhe Hamilton per l'erogazione cloroformio. Preparare pipette di plastica supplementari (5 o 10 ml di volume) per trasferire le miscele di tessuto omogenato e metanolo.
- Assicurarsi che tutta la vetreria è accuratamente risciacquato con acqua distillata e asciugato accuratamente prima dell'uso per rimuovere le tracce di impurità, in particolare formiato NMR-rilevabile e acetato.
- Riempire mortaio di porcellana con N 2liq, posto porcellana pestello nel mortaio e riempire con N 2liq. Azoto evapora fino a temperatura di mortaio e pestello è sufficientemente bassa. Tenere piccola quantità di N 2liq in mortaio.
3 Estrazione di metaboliti
- Rimuovere campione di tessuto cerebrale congelato dalla memoria (N serbatoio 2liq o -80 ° C freezer). Poi, trasferire immediatamente campione di tessuto per malta parzialmente riempiti con N 2liq.
- Utilizzare il N 2liq pestello -cold a rompere il tessuto cerebrale congelato in pezzi più piccoli che si adattano facilmente nelle provette utilizzate per la omogeneizzazione dei tessuti. Per evitare che pezzi di tessuto congelato venga proiettata fuori della malta nel processo, rompere il tessuto pur essendo avvolto in foglio di alluminio. Non macinare tessuti congelati in polvere in quanto ciò renderebbe il trasferimento al provetta più difficile (aumento del rischio di formazione di condensa). IMPORTANTE: Durante l'intera procedura, aggiungere N 2liq alla malta come necessario per mantenere il campione surgelati.
- Mix spezzi centro commerciale di tessuto cerebrale congelato a fondo, pesare 250-350 mg e trasferire in una provetta riempito di ghiaccio-freddo metanolo (4 ml per il tessuto cerebrale 250-350 mg). Ogni volta che pezzi di tessuto congelato si aggiungono, omogeneizzare questi immediatamente con l'omogeneizzatore tessuto.
NOTA: Completare questa intera procedura rapidamente per evitare (i) significativa formazione di condensa sul campione che porterebbe ad una sovrastima del peso del campione, e (ii) il riscaldamento e scongelamento del campione. Pezzi di tessuto individuali devono essere in uno stato congelato all'inizio del processo di omogeneizzazione. - Dopo l'ultimo pezzo del campione di cervello di ratto congelato è stato aggiunto alla provetta ed omogeneizzato, trasferire l'omogeneizzato in un flacone di vetro di volume ≥20 ml, vicino tappo a vite e lasciare riposare in ghiaccio per 15 min. Se il volume della provetta non è sufficientemente grande per ≥4 ml di metanolo, utilizzare un volume più piccolo metanolo per omogeneizzare una parte del tessuto cerebrale congelato, trasferire la miscela alfiala di vetro e continuare omogeneizzando i pezzi di tessuto residuo con metanolo fresco. Assicurarsi che il volume totale metanolo è di 4 ml per 250-350 mg di tessuto cerebrale.
- Aggiungere lo stesso volume di ghiaccio-freddo cloroformio (cioè, 4 ml per 250-350 mg di tessuto cerebrale) di omogenato, vortice accuratamente e lasciare riposare in ghiaccio per 15 min.
NOTA: utilizzare sempre cappa chimica ventilato durante la manipolazione solventi volatili, in particolare il cloroformio! - Aggiungere lo stesso volume di acqua (ad esempio, 4 ml per 250-350 mg di tessuto cerebrale) a omogenato, vortice accuratamente e lasciare riposare a -20 ° C per una notte.
4 Preparazione di separazione delle fasi ed evaporazione del solvente
- Preparare centrifuga a freddo (4 ° C, 13.000 xg al massimo raggio) e provette da centrifuga. Assicurarsi che questi ultimi sono ≥20 volume di ml, resistente al cloroformio, e in grado di sopportare forze centrifughe di 13.000 x g. Utilizzare provette di vetro dedicati ma risciacquare (come tutti articoli di vetro) con acqua distillata essereuso anteriore (vedi 2.3).
- Preparare accuratamente sciacquati pipette Pasteur in vetro e un propipettor appropriata (bulbo, pompa manuale pipetta, pipetta automatica aiuto / pipetta, ecc.).
- Preparare due ulteriori provette accuratamente sciacquati (≥15 di volume ml) per campione cervello, di cui uno ha bisogno di essere resistente al cloroformio (in vetro o teflon), l'altro a metanolo (fatta di resistente al metanolo, o vetro plastica).
- Preparare apparato evaporazione del solvente (disponibile in commercio o autocostruito). Assicurarsi che il dispositivo fornisce un flusso finemente controllata di gas di azoto secco che viene convogliata sulla superficie di una soluzione di estratto contenente solventi volatili (metanolo, cloroformio).
- Preparare due vassoi o secchi aggiuntivi pieni di ghiaccio: uno per il trasporto del campione sul ghiaccio, e un altro per mantenere i campioni a freddo durante il processo di evaporazione.
- Preparare liofilizzatore (freeze-asciugatrice) e materiali necessari per liofilizzazione: (i) una 50ml provetta da centrifuga o vuoto pallone basso per estratto, e (ii) N 2liq di congelare la fase acquosa di campioni (≤0.3 L per campione). Se si utilizza il tubo da centrifuga, preparare anche a livello di collo di bottiglia filtro vuoto adatto per liofilizzatore.
5. fase di separazione e di evaporazione del solvente
- Per la separazione di fase completa, trasferire il tessuto omogenato metanolo / cloroformio / acqua / cervello (vedi 3.6) in una provetta da centrifuga cloroformio-resistente (volume ≥20 ml) e centrifugare a 13.000 xg e 4 ° C per 40 min.
NOTA: Due fasi formeranno, separati da uno strato di proteina precipitata. La fase inferiore (più pesante) è costituito da metanolo, cloroformio e lipidi disciolti, mentre la fase superiore (accenditore) è costituito da acqua, metanolo e metaboliti idrosolubili disciolti. - Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire la fase superiore ad un appropriato tubo ml ≥15 (resistente al metanolo plastica o vetro). Tenere su ice.
- Utilizzare una pipetta Pasteur fresco per trasferire la fase inferiore ad un appropriato tubo ≥15 ml (vetro o Teflon). Tenere su ghiaccio.
- Conservare il livello di proteina precipitata a -80 ° C se deve essere utilizzato per la determinazione delle proteine totali; oppure scartare.
- Mantenere il tubo con la fase acqua / metanolo (vedi 5.2) su ghiaccio e si evapora il metanolo dirigendo un flusso di azoto secco sulla superficie della soluzione di estratto. In alternativa, delicatamente bolla azoto attraverso la soluzione di estratto. Terminare il processo di evaporazione quando gorgogliare azoto non causa più la riduzione del volume della soluzione di estratto. In questo momento, continuare con liofilizzazione (vedere 5.7), o congelare e mantenere campione a -80 ° C con il tubo chiuso (tappo a vite o Parafilm) fino al momento liofilizzazione.
- Posizionare il tubo con la fase di metanolo / cloroformio (vedi 5.3) sul ghiaccio e far evaporare il metanolo dirigendo un flusso di azoto secco sul surfaccia della soluzione d'estrazione. Quando tutto il solvente viene evaporato, terminare il processo e mantenere il campione a -80 ° C con il tubo chiuso (tappo a vite o Parafilm) fino al momento analisi NMR.
- Preparare fase acquosa per Liofilizzazione
- Dopo la fine del processo di evaporazione del metanolo (vedi 5.5), trasferire il campione ad un risciacquato tubo da centrifuga da 50 ml (se il campione è congelato, scongelare prima del trasferimento). In alternativa, trasferire in un pallone a fondo tondo vuoto.
- Congelare soluzione di estratto ruotando tubo da centrifuga (o pallone a fondo tondo) parzialmente inserito nel N 2liq tale che la superficie interna del tubo o pallone viene progressivamente coperto da liquido congelato. Assicurarsi che nessun N 2liq. Può entrare nel recipiente.
- Quando tutto il liquido è congelato, coprire il tubo con un coperchio forato o tappo a vite per permettere al vapore di fuoriuscire, e porre il tubo in una bottiglia filtro a depressione a livello del collo.
- Inizia liofilizzazione dopo Attaching il pallone o flacone per il liofilizzatore.
- Terminare il processo di liofilizzazione quando il campione è completamente asciutto. Mantenere il campione a -80 ° C in un tubo chiuso (con un tappo a tenuta!) Finché utilizzata per l'analisi NMR.
NOTA: Di solito non più di 24 ore sono necessarie per liofilizzazione. Diversi campioni possono essere liofilizzate contemporaneamente, a seconda del design del liofilizzatore, e se vengono utilizzate provette da centrifuga in bottiglie a collo largo o palloni a fondo tondo.
6 Preparazione di campioni NMR
- Conservare secchi e gli estratti liofilizzati a temperatura molto bassa (≤-80 ° C). Ridisciogliere liofilizzati per la preparazione dei campioni NMR immediatamente prima dell'esperimento NMR.
NOTA: Memorizzazione di campioni in soluzione e / o temperatura ambiente può causare la degradazione del campione! - Preparare una soluzione acquosa 200 mM dell'agente chelante, l'acido trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic (CDTA), come segue:
- Aggiungere acqua pura (ad esempio, 20 ml) in una provetta provetta o centrifuga, e aggiungere la quantità di CDTA polvere necessaria per generare una soluzione 200 mM.
NOTA: Una parte sostanziale di CDTA non sarà solubile, perché il pH è molto basso in quanto la forma acida della CDTA è stato utilizzato, piuttosto che un sale CDTA. - Aggiungere con cautela, passo dopo passo, aumentando quantità di polvere CsOH alla soluzione CDTA, e vortex accuratamente dopo ogni aggiunta.
NOTA: La frazione solubile CDTA aumenterà con l'aumento del contenuto CsOH nella soluzione acquosa. Evitare "overtitration", vale a dire a meno di aggiungere la quantità stechiometrica di CsOH alla soluzione CDTA. - Quando quasi tutta la polvere CDTA viene sciolta, iniziare a misurare il pH dopo ogni aggiunta CsOH e vortex approfondita. Terminare CsOH Inoltre quando il pH finale viene raggiunta (Tabella 1).
NOTA: In questo momento, tutto il CDTA sarà sciolto. L'uso di Cs + come controione di CDTA è generalleato preferito su Na + o K +. Cs + è un acido di Lewis morbido grazie alla sua grande raggio ionico, al contrario di Na + e K +, che hanno minore raggi ionici e sono acidi forti. Di conseguenza, Cs + forma complessi con fosfati (basi dure) meno facilmente di quanto non facciano Na + e K +. Questo è vantaggioso per 31 P spettroscopia NMR di metaboliti fosforilati perché complessazione tende ad aumentare larghezze di riga NMR, in particolare in condizioni di lenti a scambio ionico intermedio.
- Aggiungere acqua pura (ad esempio, 20 ml) in una provetta provetta o centrifuga, e aggiungere la quantità di CDTA polvere necessaria per generare una soluzione 200 mM.
- Per 31 P NMR analisi dei fosfolipidi (PL), dissolvono lipidi essiccati (vedi 5.6) in 700 ml di una miscela solvente costituita da cloroformio deuterato (CDCl 3), metanolo e la soluzione CDTA preparato come descritto al punto 6.2 (5: 4: 1 rapporto in volume). Trasferire il campione in una provetta. Usa-spostamento diretto (o volumetrica) micropipetta con cloroformio-resisteresuggerimenti formica in entrambe le fasi.
NOTA: Tenere presente che la modifica dei seguenti parametri influenzerà l'aspetto (chemical shift e la larghezza delle linee) di PL 31 P NMR 13-17:
(I) rapporto volume CDCl 3: soluzione CDTA: MeOH
(Ii) il volume di solvente totale utilizzata
(Iii) il pH della componente acquosa del solvente
(Iv) concentrazione CDTA della componente acquosa del solvente.
NOTA: In generale, la messa a punto di questi parametri del campione (Tabella 1) non è necessaria, e deve essere effettuata con estrema cura, se desiderato, in casi particolari. Modifica del volume tra solventi facilmente provoca la formazione di un sistema costituito da due fasi invece di una fase omogenea! Il sistema monofase è risultato essere più pratico rispetto al sistema a due fasi nella maggior parte delle applicazioni 13,14. - Per analisi 1 H NMR di metaboliti idrosolubili, sciogliere liofilizzato (vedi 5.8) in 700 microlitri ossido di deuterio (D 2 O) contenente 3 (trimetilsilil)-propionico 2,2,3,3-d4 sale sodico (TSPD 4) nell'intervallo millimolare (D 2 O contenente 0,05% TSPD 4 è disponibile in commercio) . Trasferire il campione in una provetta.
- Regolare il pH della soluzione risultante estratto acquoso di 7.3 con l'aggiunta di piccole quantità (circa 2 ml) di cloruro di deuterio (DCL) e soluzioni deuterossido sodio (INCD). In primo luogo, iniziare con 0,02 N soluzioni DCL o INCD. Se 2 o 3 integrazioni successive non provocano sufficiente il cambiamento di pH, continuare con 0,2 N soluzioni DCL o INCD. Fare attenzione a non overtitrate.
NOTA: L'importo complessivo di soluzione di DCL o INCD necessaria dipende dalla quantità di tessuto cerebrale estratto; notare che questo valore per una precisa quantificazione metabolita. Nella maggior parte dei casi i volumi combinati delle aggiunte soluzioni DCL e INCD dovrebbero essere praticamente trascurabile (quasi l'1% del volume del campione NMR).
- Per ottenere i migliori risultati, utilizzare un spettrometro NMR multinucleare ad alta risoluzione (≥9.4 Tesla di campo, corrispondente a 162 MHz 31 P, o 400 MHz 1 frequenze di risonanza H). Oltre la bobina 31 P, assicurarsi che la sonda 31 P NMR possiede una bobina 1 H per protone disaccoppiamento. Impostare la regolazione della temperatura della sonda NMR di valore nominale desiderato (di solito 25 ° C).
NOTA: la temperatura della sonda potrebbe essere necessario 10-20 minuti per stabilizzare! - Soluzione Centrifuga PL estratto in provetta (vedi 6.3) a 4 ° C e 11.000 xg per 30 min a girare giù residui solidi nel campione. Trasferire 600 ml di surnatante in un tubo NMR di alta qualità (diametro esterno 5 mm).
- Preparare appropriato gambo inserto coassiale riempito con un methylenediphosphonate acquosa 20 mM di soluzione (MDP) a pH 7.0 per chimico-shift riferimentoe quantificazione. Mettere questo inserto nel tubo NMR riempito con soluzione di estratto di PL.
- Montare il tubo NMR con l'ogiva e il trasferimento opportuno magnete NMR. Ora ruotare il campione a 15-20 Hz e attendere fino a quando il campione si è adattato alla temperatura impostata (ca. 10 min).
- Minimizzare cura disomogeneità di campo magnetico attraverso campione regolando in asse e fuori asse correnti bobina spessore 18.
- Impostare NMR parametri di acquisizione dello spettro di valori ottimali, che possono variare in funzione di intensità di campo magnetico (per un sistema 9.4 T, si veda la Tabella 1 per i valori dei parametri raccomandati).
- Impostare il numero di transitori per esperimento (= NS).
- Impostare NS a circa 80 (durata totale dell'acquisizione dati circa 20 minuti) se solo i PL più diffuse devono essere quantificato con precisione (fosfatidilcolina (PtdCho), fosfatidiletanolamina (PtdEtn), etanolammina plasmalogen).
- Impostare NS a circa 100-200 (durata totale dacquisizione ata 1-2 ore) se PLs meno concentrati sono da quantificato (alchil-acil-fosfatidilcolina, fosfatidilinositolo, fosfatidilserina, acido fosfatidico).
- Impostare NS a circa 1.500-2.000 (durata totale dell'acquisizione dati 7-10 h; esperimento durante la notte) se PLs molto-basso-concentrazione devono essere quantificato, ad esempio mono fosfatidilinositolo e difosfati (PtdIP e PtdIP 2), cardiolipina, liso-PL , alchil-acil-fosfatidiletanolamina, e occasionalmente altri.
- Dopo la fine della acquisizione dello spettro, processo di decadimento di induzione libera (FID) con parametri ottimizzati. I valori di questi parametri variano in funzione della forza di campo magnetico, qualità spessore, e il segnale PL da quantificare.
- Per ottenere i migliori risultati per l'intera gamma di PL, ripetere l'elaborazione utilizzando multipla (almeno due) diverse procedure di filtraggio. Utilizzare forte miglioramento della risoluzione per i segnali fortemente sovrapposti, ad es., Per PtdCho e PtdEtnregioni.
- Utilizzare forte filtraggio (debole o nessun miglioramento della risoluzione) per i segnali deboli.
- Filtro segnali molto deboli e larghe, senza significative sovrapposizioni da apodizzazione (ad esempio, LB = 3 Hz) per aumentare segnale-rumore, ad esempio PtdIP e PtdIP 2. Vedere la Tabella 1 per i parametri di elaborazione caratteristici.
- Quantificare l'area di ogni segnale PL rispetto alla zona sotto il segnale del composto di riferimento (MDP) nello stesso spettro.
- Calibrare il segnale del composto di riferimento (MDP) in un esperimento separato, utilizzando un tubo NMR 5 millimetri riempito con (i) un composto di fosforo di concentrazione nota, e (ii) l'inserto stesso stelo coassiale utilizzato in esperimenti PL 31 P NMR ( vedi 7.3 e 7.9).
- Calcola concentrazione singola PL basato sulle aree relative dei segnali PL da un lato (vedi 7.9), e il valore di calibrazione ottenute per MDP daInserto coassiale dall'altro (vedi 7.10). Si tenga conto che il numero di nuclei di fosforo contribuiscono ad un particolare segnale NMR 31 P può variare in funzione dell'origine molecolare di tale segnale.
NOTA: Il segnale phosphonate MDP (di solito riferito a 19.39 ppm) rappresenta due nuclei di fosforo, così come il segnale cardiolipina fosfato. Tutti gli altri segnali NMR PL 31 P rilevati in estratti cerebrali rappresentano un nucleo fosforo ciascuno. - Utilizzare un software di statistiche come necessario per confrontare i livelli di PL cerebrali tra i gruppi di animali.
8 svolgimento dell'esperimento 1 H NMR per l'analisi di acqua-solubile metaboliti cerebrali
- Impostare la regolazione della temperatura della sonda 1 H NMR al valore nominale desiderato (di solito 25 ° C). Osservazioni Vedere anche 7.1.
- Centrifugare la soluzione di estratto acquoso in provetta (vedi 6.5) a 4 ° C e 11.000xg per 30 min a spin down residui solidi nel campione. Trasferire 600 ml di surnatante in un tubo NMR di alta qualità (diametro esterno 5 mm).
- Trasferimento tubo NMR a magnete NMR, spessore e impostare spettro NMR parametri di acquisizione a valori ottimali come spiegato in 7,4-7,6. Per i valori dei parametri raccomandati Vedi anche Tabella 1.
- Impostare il numero di transitori per esperimento a circa NS = 32 (durata totale dell'acquisizione dati ca. 13 min). Per ottenere buoni rapporti segnale-rumore per segnali molto deboli, in particolare nella regione aromatica, utilizzare NS = 64 (durata totale dell'acquisizione dati ca. 26 min) o più.
- Dopo la fine della acquisizione dello spettro, processo di decadimento di induzione libera (FID) con parametri ottimizzati. I valori di questi parametri variano leggermente in funzione di forza del campo magnetico, la qualità spessore, e il segnale metabolita da quantificare.
NOTA: Nella maggior parte dei casi, è sufficiente per trattare ogni spettro una volta, Impiegando un insieme di parametri di lavorazione che presentano un buon compromesso per tutti i segnali di metaboliti. Vedere la Tabella 1 per i parametri di elaborazione caratteristici. - Quantificare l'area di ogni segnale metabolita (spesso un multipletto, talvolta sovrapposizioni con altre singlets o multipletti derivanti da differenti molecole) rispetto alla zona sotto il segnale del composto di riferimento (TSP-d 4) nello stesso spettro.
- Calcolare le concentrazioni del metabolita individuali basate su TSP-d 4 concentrazione (vedi 6.4). Si tenga conto che il numero di protoni che contribuiscono ad un particolare segnale NMR 1 H, possono variare in funzione della provenienza molecolare di tale segnale. Il segnale TSP-d 4 trimetil (riferiti a 0,0 ppm) rappresenta nove protoni.
- Utilizzare un software di statistiche come necessario per confrontare i livelli di metaboliti cerebrali tra i gruppi di animali.
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Representative Results
Per ottenere la migliore risoluzione in metabolica spettri NMR di cervello e di altri estratti tissutali, è stato a lungo una pratica comune per rimuovere o ioni metallici (maschera più importante: ioni paramagnetici) presenti nelle soluzioni di estratto. Ciò è stato ottenuto mediante aggiunta di un agente chelante come EDTA o CDTA all'estratto 19, o facendo passare l'estratto attraverso una resina a scambio ionico, come Chelex-100 20. I risultati presentati in Figura 1, dimostrano che questo passo non è necessario per 1 H NMR analisi spettroscopica se estratti cerebrali sono accuratamente preparati secondo il protocollo sopra. Qui, le linee spettrali estremamente sottili sono stati ottenuti per tutte le regioni spettrali analizzati. Anche in regioni molto affollate, ad esempio, per glutammina / glutammato e myo -inositol / glicina, picchi a distanza di <0.01 ppm sono quasi completamente separabili a 400 MHz (figura 1, in basso). Di conseguenza, qualitativa,e l'analisi quantitativa dei numerosi piccoli, ma attualmente non assegnati, picchi visibili nei pannelli centrali e inferiore della figura 1 può essere previsto in futuro.
Figura 1: Bacini di un tipico spettro 1 H NMR (400 MHz) della fase acquosa di un estratto di tessuto cerebrale da una femmina Lewis ratto. Tutte e tre pannelli dimostrano estremamente alta risoluzione ottenibile utilizzando il protocollo presentato in questo documento. Né agente chelante né resina a scambio ionico è stato utilizzato durante la preparazione del campione. Centro e pannelli inferiori mostrano l'esistenza di molti picchi a bassa intensità non assegnati che lasciano intravedere l'enorme gamma dinamica coperto da ad alta risoluzione spettroscopia 1 H NMR di estratti di tessuto se effettuata utilizzando parametri sperimentali ottimizzati. Questi debole ma bensegnali rilevabili possono potenzialmente essere identificati e quantificati in futuro. Diversi metaboliti individuati sono specifici del tessuto cerebrale, ad esempio, la NAA marcatore neurone o il neurotrasmettitore GABA.; Tuttavia, la maggior parte dei composti sono coinvolti in un ampio spettro di vie metaboliche che sono comuni a cellule di mammifero, come amminoacido, a catena ramificata acido organico, poliolo, (fosfo) lipidica e metabolismo energetico, nonché nella glicolisi e glutaminolysis, in funzioni come osmoregolazione, la crescita e la proliferazione cellulare. L'asterisco indica la risonanza metile derivante da una impurità metanolo. Abbreviazioni: ala, alanina; lac, lattato; treo, treonina; BHB, β-idrossibutirrato; val, valina; ile, isoleucina; leu, leucina; AAB, α-aminobutyrate; AHB, α-idrossibutirrato; tau, taurina, scy -ins, scillo -inositol; myo -ins, Myo -inositol; GPC, glicerofosforilcolina; PC, phosphocholine; cho, colina; CRN, creatinina; Cr, creatina; GABA,47; -aminobutyrate; asp, aspartato; NAA, N -acetylaspartate; GLN, glutammina; glu, glutammato; SUC, succinato; NANA, N -acetylneuraminate; ac, acetato; Gly, glicina. I piccoli picchi alla base dello stelo ala doppietto del lattato doppietto satellite 13 C (pannello superiore). Ristampato sotto la licenza Creative Commons Attribuzione (CCAL) termini di Lutz NW et al (2013) Cerebral vie biochimiche in encefalomielite autoimmune e l'artrite adiuvante sperimentale:. Uno studio comparativo metabolomica. PLoS ONE 8 (2):. E56101 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
In 31 P spettroscopia NMR, mascherare o rimuovere cationi paramagnetici (principalmente ferro) è senza dubbio una necessità, perché fosfati facilmente formano complessi con ioni bivalenti e trivalenti. Aggiunta di CDTA agli estratti di influenza sia riga spettrale larghezza did turni chimici; confrontare Figura 2, in alto e in basso a sinistra. Linea restringimento scegliendo 1.000 mm (in basso a sinistra) invece di 200 mm (in alto a sinistra) CDTA è stata voluta, ma ha determinato sovrapposizione di segnali PL che dovrebbero essere quantificati separatamente (in alto a sinistra). Pertanto, CDTA 200 mM è raccomandato per la componente acquosa del solvente PL, tutti parità di altre condizioni. Inoltre, la temperatura del campione durante la misura incide la larghezza delle linee spettrali e spostamenti chimici; confrontare Figura 2, in alto e in basso a destra. Linea restringimento scegliendo 277 K (in basso a destra) invece di 297 K (in alto a destra) è stata voluta, ma ha determinato sovrapposizione di segnali PL che dovrebbero essere quantificati separatamente (in alto a destra). Pertanto, 297 K è raccomandato come misura di temperatura, tutti parità di altre condizioni. Confronto tra i due pannelli superiori mostrano che una diminuzione della concentrazione CDTA da 200 mm (in alto a sinistra) a 50 mm (in alto a destra) si traduce solo inun modesto incremento in linea larghezza, e in quasi nessun cambiamento in turni chimici. Si noti tuttavia che la concentrazione tissutale nell'estratto 50 CDTA mM è la metà alto come è nell'estratto 200 CDTA mM, spiegando le linee relativamente strette nella parte superiore del pannello a destra 13.
Figura 2 fosfatidiletanolamina (PtdE) regioni di fosfolipidi 31 P NMR (162 MHz) di estratti di tessuti cerebrali di ratti Lewis femmine (pannello in alto a sinistra) la concentrazione del tessuto cerebrale, 236 mg / ml.; CDTA concentrazione e pH della componente acquosa del solvente, 200 mM e 7,33, rispettivamente; temperatura di misura, segnali plasma e SM 297 K. PtdE sono ben risolti (a sinistra in basso) la concentrazione del tessuto cerebrale, 236 mg / ml.; CDTA concentration e pH della componente acquosa del solvente, 1,000 mM e 7,36, rispettivamente; temperatura di misura, segnali plasma e SM 297 K. PtdE sovrappongono del tutto; essi non possono essere risolti nonostante la larghezza della linea ridotta, rispetto allo spettro alto a sinistra (in alto a destra) concentrazione tissutale cerebrale, 118 mg / ml.; CDTA concentrazione e pH della componente acquosa del solvente, 50 mM e 7,14, rispettivamente; temperatura di misurazione, 297 segnali K. PtdE e SM sono ben risolti concentrazione (in basso a destra) del tessuto cerebrale, 118 mg / ml.; CDTA concentrazione e pH della componente acquosa del solvente, 50 mM e 7,14, rispettivamente; temperatura di misurazione, 277 segnali K. PtdE e SM si sovrappongono del tutto; che non possono essere risolti, nonostante ridotta larghezza della linea rispetto allo spettro in alto a destra. Abbreviazioni: PtdE plasma, plasmalogen etanolammina; PtdE, fosfatidiletanolammina; SM, sfingomielina; PTDS, phosphatidylserine; PTDC, fosfatidilcolina. Ristampato con il permesso di Lutz NW et al. (2010) ottimizzazione Multiparametrica di 31 P analisi spettroscopica NMR di fosfolipidi in estratti di tessuto greggio. 1. Chemical shift e la separazione del segnale. Anal Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Utilizzando il protocollo sopra (sistema monofase 14, Figura 3, in alto a sinistra), sono stati rilevati numerosi PLs quantificabili (Figura 3, in alto a destra), che copre una considerevole gamma di concentrazione (nota segnali ad alta intensità troncati). Alcuni di questi segnali sono ancora assegnati (U1, U2, U6). Se la preparazione del campione, la misurazione e l'elaborazione dello spettro NMR vengono eseguite come indicato nel presente protocollo, risoluzione spettrale è ancora sufficiente a D di routineetect scissione parziale di alcuni picchi (PTDS, PtdE, PtdE plasma, AAPtdE, in basso a sinistra). . Di conseguenza, qualitativa e l'analisi quantitativa di ulteriori sottogruppi PL possono essere previste in futuro Figura 3, in basso a destra, illustra il potere di parametri di elaborazione giudiziosamente scelti per parzialmente segnali separati di composti a bassa concentrazione (qui: PtdC1u, un PL derivati da PTDC che non è completamente identificato, e PTDC plasma) di risonanza vicino a segnali molto forti (qui: PTDC).
Figura 3 Phospholipid spettroscopia 31 P NMR (162 MHz) di estratti di tessuto cerebrale di ratti Lewis femminili. (Pannello in alto a sinistra) Un sistema monofase (a sinistra) è stato preferito un sistema a due fasi (a destra). Il sistema comunemente usato in due fasi ostacola correttoPL quantificazione perché la maggior parte della fase superiore si trova al di fuori del volume sensibile della bobina. (Pannello in alto a destra): Completa 31 P NMR PL spettro di cervello di ratto. Per una migliore visibilità dei segnali deboli (PtdIP, PtdG), linea di allargamento esponenziale (LB = 3 Hz) è stato applicato. In questa rappresentazione, diversi segnali PL non sono ben risolti-, in particolare nelle regioni PTDC e PtdE. Per PLs che generano più di un segnale 31 P NMR, i nuclei osservati sono sottolineate (P TDIP, PtdI P, P TDIP 2, PtdI P 2). Attualmente i segnali non assegnati sono indicati con "U n" (dove n = 1, 2, ...). (Pannello in basso a sinistra) PtdE e PTDS regioni di uno stesso spettro. Per una migliore risoluzione dei picchi, Lorentzian-gaussiana trasformazione forma linea è stato applicato (LB = -1 Hz, GB = 0.3). A causa di questi parametri di elaborazione, molti segnali PL molto deboli sono difficili da rilevare. Tuttavia, almeno due picchi puòessere individuate per ogni PtdE, PtdE plasma, AAPtdE, e PTDS. (in basso pannello di destra) regione PTDC ottenuto con gli stessi parametri di lavorazione come la regione PtdE. Diversi segnali alla base della dominante PTDC risonanza sono stati rilevati in modo inequivocabile, mentre non possono essere individuate nello spettro superiore generato con esponenziale linea allargamento (AAPtdC, PTDC plasma, PtdC1u). Oltre al momento non assegnato analogico PTDC, PtdC1u, ulteriori risonanze minori possono essere presenti campi alti da PTDC. Abbreviazioni: PtdIP, fosfatidilinositolo fosfato; PtdIP 2, fosfatidilinositolo difosfato; PTDA, acido fosfatidico; PtdG, fosfatidilglicerolo; CL, cardiolipina; PtdE .., somma di PtdE, PtdE plasma e AAPtdE; PtdI, fosfatidilinositolo. Per ulteriori abbreviazioni vedi legenda alla Figura 2. Ristampato con permesso da NW Lutz et al. (2010) ottimizzazione Multiparametrica di 31 P analisi spettroscopica NMR di phospholipids in estratti di tessuto grezzo. 1. Chemical shift e la separazione del segnale. Anal Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Raccolta e congelamento Rat Brain | |||
| Dewar per N 2liq.; congelamento morsetto (ad esempio, pinze Wollenberger fatti in casa, refs 1 e 2, fondo di tavolo.); camera di anestesia; forbici chirurgiche; bisturi; Flacone da 500 ml con alcool pulizia | 1 di ciascun | ||
| Forcipe | 2 | ||
| Siringa da 1 ml, siringa da 10 ml | 1 di ciascuna per animale | ||
| 25 aghi G | 2 per animale | ||
| Campione Preparzione | |||
| Tipico quantità di tessuto cerebrale per estrazione | 250-350 mg | ||
| Volume di MeOH utilizzato in omogeneizzazione 250 - tessuto cerebrale 350 mg | 4 ml | ||
| 5 ml pipetta di plastica | 3 per estratto | ||
| 10 ml pipetta di plastica | 1 per estratto | ||
| Fiala di vetro (≥20 volume di ml) | 1 per estratto | ||
| Provetta da centrifuga Cloroformio-resistente | 1 per estratto | ||
| Periodo di attesa dopo omogeneizzazione del tessuto in MeOH (miscela a 4 ° C) | 15 min | ||
| Acqua e CHCl 3 del volume aggiunto al tessuto cerebrale omogeneizzato in 4 ml di MeOH | 4 ml ciascuno | ||
| Periodo di attesa dopo la miscelazione tessuto omogeneizzato con acqua e CHCl3 (miscela a -20 ° C) | per una notte | ||
| Centrifugazione per la separazione of acquosa dalla fase estratto organico (provetta da centrifuga di vetro) | 13.000 xg per 40 min a 4 ° C | ||
| Concentrazione della soluzione CDTA (fase acquosa della miscela solventi per sciogliere i lipidi estratti) | 200 mm | ||
| pH della fase acquosa della miscela solvente per sciogliere i lipidi estratti | 7.4 | ||
| Rapporto di Volume in lipidi solvente A utilizzato per l'analisi 31 P PL (CDCl 3: MeOH: soluzione CDTA) | 5: 4: 1 | ||
| Quantità di solvente A usato per sciogliere i lipidi estratti da 250 - 350 mg di tessuto cerebrale | 700 ml | ||
| Centrifugazione per la filatura le particelle solide del campione NMR (provetta) | 11.000 xg per 30 min a 4 ° C | ||
| pH del campione NMR contenente metaboliti idrosolubili | 7.3 | ||
| Volume del campione trasferito a tubo NMR, dopo centrifugation | 600 microlitri | ||
| Concentrazione MDP a stelo inserto coassiale per 31 P NMR | 20 mM | ||
| Esperimenti NMR | |||
| La temperatura del campione durante l'esperimento NMR (da regolare per ridurre al minimo la sovrapposizione di picco) | 25 ° C | ||
| Spinning frequenza durante l'esperimento NMR | 15-20 Hz | ||
| 1 Parametri H NMR di acquisizione | |||
| Solvente fornendo 2 segnale di blocco H | D 2 O | ||
| Larghezza di impulso di eccitazione, P1 | 11 msec | ||
| Impulso di eccitazione, attenuazione amplificatore, PL1 | 0 dB | ||
| Dimensioni FID, TD | 32 k | ||
| FID acquisizione time, AQ | 3,283 sec | ||
| Ritardo Rilassamento, D1 | 15 sec | ||
| Ritardo soppressione solvente, D4 | 6 sec | ||
| Tempo di ripetizione totale, TR | 24.3 sec | ||
| Larghezza spettrale in ppm, SWP | 12.47 ppm | ||
| Larghezza spettrale in Hz, SW | 4.990 Hz | ||
| Guadagno del ricevitore, RG | 512 | ||
| Soppressione del solvente (onda continua) | CW | ||
| Soppressione del solvente, attenuazione amplificatore, PL9 | 50 dB | ||
| Numero di transitori, NS | 32 o 64 | ||
| 31 Parametri P NMR acquisizione | |||
| Solvente fornendo 2 segnale di blocco H | CDCl 3 | ||
| Eccitazione impulso width, P1 | 9.5 msec | ||
| Impulso di eccitazione, attenuazione amplificatore, PL1 | 4 dB | ||
| Dimensioni FID, TD | 16 k | ||
| FID tempo di acquisizione, AQ | 2.019 sec | ||
| Ritardo Rilassamento, D1 | 15 sec | ||
| Tempo di ripetizione totale, TR | 17 sec | ||
| Larghezza spettrale in ppm, SWP | 25 ppm | ||
| Larghezza spettrale in Hz, SW | 4.058 Hz | ||
| Guadagno del ricevitore, RG (massimo) | 16.384 | ||
| Proton disaccoppiamento (decoupling impulso composito) | CPD | ||
| Proton disaccoppiamento, attenuazione amplificatore, PL13 | 19 dB | ||
| Numero di transitori, NS | 1.500 o 2.000 | ||
| NMR Elaborazione Dati | 1 H Resolution Enhancement, Gaussian-Lorentziana LineShape Trasformazione | ||
| Valutazione complessiva dello spettro (se necessario, ottimizzare separatamente per le singole regioni spettrali, utilizzando 0,1 <I <0.4 e -0.6 <LB <-0.2 Hz) | GB = 0.15, LB = -0.2 Hz | ||
| Segnali molto deboli, per esempio, acidi aromatici (in alternativa a apodizzazione con LB ≥ 0,5 Hz) | GB = 0,015, LB = -0.3 Hz | ||
| Zone soggette a picchi: uso LineShape adatta per risonanze sovrapposizione | |||
| 31 P miglioramento della risoluzione, gaussiana Lorentzian-forma di riga trasformazione | |||
| Valutazione complessiva dello spettro (ottimizzare separatamente per le singole regioni spettrali, utilizzando 0,05 <I <0.2 e -3.0 <LB <60; -1.0 Hz) | GB = 0.05, LB = -1.0 Hz | ||
| Segnali molto deboli, per esempio, PtdIP 2, Ptda: apodizzazione | LB = 3 Hz | ||
| Zone soggette a picchi: uso LineShape adatta per risonanze sovrapposizione | |||
| Riferimenti | |||
| 1 Palladino GW, Legno JJ, Proctor HJ. Modificato clamp freeze per il dosaggio dei tessuti. Il Journal of Surgical Research 289, 188-190 (1980). | |||
| 2 Wollenberger A, Ristau O, Schoffa G. [Una semplice tecnica per estremamente rapido congelamento di grandi pezzi di tessuto]. Pflugers Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere 270, 399-412 (1960). | |||
Tabella 1 Parametri sperimentali per alta risoluzione 1 H e 31 P spettroscopia NMR del cervelloestratti di tessuto. Valori tipici per i rapporti di volumi e concentrazioni di solventi e reagenti utilizzati per l'estrazione del tessuto cerebrale e la preparazione dei campioni NMR sono presentati. Ulteriori valori consigliati si riferiscono al campione pH e la temperatura di misurazione, così come NMR parametri di acquisizione ed elaborazione. Rettifiche minori possono essere necessarie, in particolare se il protocollo è applicato a tessuti diversi dal cervello. Parametri NMR sono stati ottimizzati per misurazioni a 9,4 T, e devono essere regolati come necessario per spettrometri operanti a diversi punti di forza del campo magnetico.
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Discussion
Spettroscopia NMR è un metodo efficiente per la misurazione delle concentrazioni di composti chimici in soluzione in modo molto accurato e riproducibile. Tuttavia, per ottenere dati di alta qualità, è necessario rispettare alcune norme in materia di preparazione e analisi del campione. Nella determinazione di concentrazioni di metaboliti mediante spettroscopia NMR, né la generazione né la ricezione del segnale NMR domina l'errore di quantificazione, a meno che l'intensità di un segnale osservato avvicina alla soglia di rilevamento (segnale particolarmente debole). In tutti gli altri casi di variabilità biologica, la tecnica di preparazione del campione (efficienza di estrazione, stabilità fisica e chimica dei composti, pipettaggio e pesatura errori, ecc), e / o la scelta dei parametri di acquisizione e di elaborazione del segnale determinerà la precisione e l'accuratezza dei risultati. Ovviamente, eventuali cambiamenti metabolici che si verificano durante la raccolta di tessuto saranno riflessi nel metabolita concentrazioni ottengonoed. Pertanto, è molto importante per completare la raccolta dei tessuti più velocemente possibile, e di applicare particolari tecniche di congelamento del tessuto come imbuto congelamento se accurata delle concentrazioni in vivo di composti rapidamente metabolizzare sono importanti (in particolare glucosio, lattato, ATP e la sua cataboliti, ADP e AMP).
Anche alla forza del campo magnetico intermedio (9.4 T) di una ad alta risoluzione spettrometro NMR eccellente spettri di routine può essere ottenuto. Per esempio, in 1 H NMR della fase acquosa di estratti di cervello di ratto, segnali la cui differenza di chemical shift, Δδ, pari a circa 0.005 ppm (corrispondente a 2,0 Hz MHz frequenza di risonanza 400) possono distinguere e quantificato separatamente. Ciò è illustrato dalla separazione parziale di (i) il lattato e doppietti treonina, e (ii) il doppietto alanina dai piccoli picchi alla sua base (lattato 13 C doppietto satellitare; la figura 1,superiore). Spettrometri operanti a campi alti (14.1 o 18.8 T) aumenterebbe risoluzione e sensibilità maggiori, anche se questi strumenti sono meno comuni nei laboratori NMR a causa del loro costo elevato di acquisto.
Uso spettroscopia 1 H NMR, una vasta gamma di metaboliti può essere analizzato contemporaneamente, cioè in una singola acquisizione. La sensibilità di questo esperimento può essere migliorata aumentando il numero di transienti accumulati, anche se questa scelta aumenta il tempo di misura proporzionalmente. (Il rapporto segnale-rumore è proporzionale alla radice quadrata del numero dei transitori.) Tuttavia, il tempo di acquisizione complessivo massimo indicato nel protocollo di cui sopra (20 - 30 min) dovrebbe essere sufficiente per quasi tutti gli scopi, a meno che l'importo di tessuto disponibili per l'estrazione è molto limitato. Oltre a fare uso del nucleo più NMR sensibili (protoni), metabolomica spettroscopia 1 H NMR ha il vantaggio di globalebanche dati essendo disponibile per diverse intensità di campo e valori pH del campione 10. Inoltre, il software per la valutazione automatica o semi-automatica spettro è diventato disponibile 10.
Mentre spettri 1 H NMR di estratti di tessuto può essere ben risolto senza aggiunta di agenti chelanti, ciò non è più vero per 31 P NMR. Infatti, la concentrazione dell'agente chelante utilizzato (ad esempio, EDTA o CDTA) ha una notevole influenza sia la larghezza della linea e chemical shift di 31 segnali P NMR derivanti da metaboliti fosforilati. Aumentando la concentrazione CDTA in un estratto diminuisce la larghezza delle linee 31 P NMR, ma questo vantaggio può essere controbilanciato da minori differenze tra chemical shift, Δδ, di cime vicine. Pertanto, la quantità di agente chelante usato deve essere ottimizzato sia per la larghezza della linea e chemical shift insieme. In estratti di lipidi, questi due parametri spettrali sono significante me nte influenzato dalla concentrazione complessiva del campione, cioè la quantità di tessuto estratto, ma anche dal valore pH e la temperatura del campione durante la misura NMR. Di conseguenza, qualsiasi ottimizzazione delle condizioni di misura deve considerare gli effetti combinati di tutti i parametri sperimentali coinvolti, alcuni di questi non essere additivi. La complessità di questa situazione è illustrata dal comportamento di spettri PL 31 P NMR mostrato in Figura 2. Sebbene la concentrazione tissutale più basso (118 mg / ml), la temperatura più bassa (277 K) e la più alta concentrazione CDTA (1,000 mM) testati si tradurrebbe in basso spessore della linea, il protocollo suggerito raccomanda l'uso della concentrazione moderato tessuto (236 mg / ml), la concentrazione CDTA intermedio (200 mm) e la temperatura ambiente (297 K) per evitare la sovrapposizione di segnali.
Sebbene le condizioni di preparazione del campione e acquisizione spettro sono della massima importanza, laruolo dei parametri di elaborazione dello spettro ad estrarre un massimo di informazioni dai dati grezzi acquisiti non deve essere sottovalutata. Un particolare insieme di parametri di elaborazione il mio essere ideale per il rilevamento e la quantificazione PL che si verificano a basse concentrazioni; tuttavia, lo stesso set di parametri può oscurare picchi individuali in regioni spettrali "affollati" (Figura 3, in alto a destra). Al contrario, i parametri di elaborazione che forniscono ottimale miglioramento della risoluzione in regioni di risonanze fortemente sovrapposti (Figura 3, in basso) renderebbero picchi di bassa intensità non rilevabile. I recenti sviluppi, tra cui anche una PL 31 P database completo NMR 13,14, facilitano notevolmente l'analisi di spettri NMR 13,14.
In definitiva, gli obiettivi dell'applicazione sottostante devono definire i criteri per l'ottimizzazione, cioè l'equilibrio desiderato di risoluzione spettrale, la sensibilità, la precisione del metabolita quantificazione, velocità, e di altri fattori. Per esempio, il sistema monofase raccomandato per analisi PL permessi quantificazione PL più affidabile ed efficiente di sistemi bifasici (Figura 3, in alto a sinistra), e fornisce alta risoluzione spettrale e sensibilità sufficiente per la quantificazione di PLs meno abbondanti . Tuttavia, nei casi in cui migliore separazione del segnale è di priorità molto superiore quantificazione efficiente e preciso, l'uso di una percentuale elevata di cloroformio-d nella miscela solvente può essere tentato, anche se questo porta facilmente a separazione di fase nel campione. Se questo è il caso, il volume della fase inferiore deve essere determinato per ottenere assoluti importi PL (mg PL, per g di tessuto o proteine totali mg).
In eteronucleari esperimenti NMR protone-disaccoppiati, intensità di segnale possono essere modificate da effetti nucleari Overhauser (NOE), oltre a saturazione a causa di sistemi di acquisizione rapida. Se non corretto questi effetti si traducono in metabolita quaerrori ntitation. Ci sono due strategie alternative per affrontare questa sfida. Nel primo approccio, singoli transienti di un'acquisizione sono separati da lunghi ritardi. Questo metodo evita qualsiasi saturazione o NOE ma comporta relativamente lunghi esperimenti; esso deve essere utilizzato se sono necessari risultati precisi e accurati. In alcuni casi, la priorità potrebbe essere data all'acquisizione spettro veloce, in particolare per i campioni molto diluiti che possono essere misurati solo con un elevato numero di transienti. In tali casi, l'aggiunta di agenti paramagnetici rilassamento al campione permetterebbe di acquisizione dati rapida senza saturazione o NOE. In alternativa, l'acquisizione veloce di dati, senza aggiunta di agenti paramagnetici può essere impiegato. Il secondo metodo richiede la correzione delle aree di segnale per mezzo di fattori di correzione che devono essere determinate per ogni risonanza NMR, mentre la presenza di agenti di rilassamento provoca alcuni allargamento dei segnali NMR che può ridurre la precisione del metabolita quantificazione perregioni spettrali affollate. Generalmente, la scelta ottimale delle condizioni sperimentali non solo è dettata dal tipo di campione, ma anche dalle informazioni per essere estratto da un esperimento 13. Se la massima priorità deve essere data alla analisi veloce dei metaboliti piuttosto abbondanti, senza la necessità di elevata precisione ed accuratezza, può essere sufficiente per misurare campioni altamente concentrati ed impiegare tempi di ripetizione brevi, possibilmente con l'agente di rilassamento paramagnetico aggiunto al campione. Per contro, se quantificazione accurata di un gran numero di metaboliti è più importante della velocità, è preferibile utilizzare estratti meno concentrati ed accettare lunghi tempi di acquisizione NMR, come dimostrato dal protocollo qui presentato. Inoltre, se un particolare progetto di ricerca sottolinea metaboliti specifici, le condizioni sperimentali possono essere regolati per ottenere una risoluzione spettrale ottimale per le regioni spettrali in questione. Il protocollo e la discussione presentato qui possono servire come guida per l'optimization di analisi metabolomica di estratti di tessuto greggio mediante spettroscopia NMR.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
| Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
| Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
| Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
| Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
| Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
| Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
| Electronic scale | Sartorius | n/a | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
| Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15 ml, 30 ml tube |
| Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
| Polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10 ml volumes |
| Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96% deuterated |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96% deuterated |
| Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20% in deuterium oxide |
| Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30% in deuterium oxide |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
| Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
| pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
| NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
| NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| Pipettes | Eppendorf | Research | With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl |
| Pipet-Aid | Drummond | XP | |
| NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
| NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
| Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
| Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity |
| Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
| TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |
References
- Manger, P. R., et al. Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction. Front Neuroanat. 2, 5 (2008).
- Buxbaum, J. D., et al. Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features. Mol Autism. 3, 1 (2012).
- Papaioannou, V., Behringer, R. R. Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).
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