Introduction
Die epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) ist ein Entwicklungsprogramm, das Organ Morphogenese und Gewebeumbau während der Embryogenese steuert. Wenn abnorm aktiviert, fördert die EMT Tumormetastasierung und Organfibrose 1,2. Zwingende Studien haben die Bedeutung der transkriptionellen Regulierung während des Prozesses der EMT beschrieben, durch mehrere Transkriptionsfaktoren, wie Verdrehen, Schnecke, und ZEB, die die Expression des Zonula-junction-Protein E-Cadherin-Repression, was zum Verlust eines Pflaster definiert Stein wie epitheliale Morphologie und Verstärkung eines spindelförmigen mesenchymalen Phänotyp 3-8. Jüngste Studien durch genomweiten Analyse von RNAs aufgedeckt, daß es eine Gruppe von Genen, deren Klebemuster entweder mit epithelialen oder mesenchymalen Phänotypen 9,10 zugeordnet. Arbeiten aus unserem Labor alternatives Spleißen und EMT funktionell verbunden. Durch das Studium der Zelloberfläche Adhäsionsmolekül CD44 wir gezeigt, dass CD44 alterntiven Spleißen dicht bei EMT geregelt, und noch wichtiger, dass CD44 Spleiß-Isoform Schalt kausal trägt EMT 11.
Alternatives Spleißen ist ein weit verbreitet und konservierten Modell der Genregulation, wie bis zu 95% der menschlichen Multi-Exon-Gene sind alternativ gespleißte 12-14. Durch die Erzeugung von mehreren Protein-Produkte von einem einzigen Gen, stellt alternative Spleißen einen wesentlichen Mechanismus für die Proteinvielfalt, indem eine weitere Schicht von Komplexität des menschlichen Genoms. Als solche könnte eine Fehlregulation von alternativem Spleißen möglicherweise tiefgreifende biologische Wirkungen verursachen Erkrankungen des Menschen führen. Tatsächlich hat abweichende alternative Spleißen in Krankheiten, für mehr als ein Jahrzehnt 15-25 dokumentiert, einschließlich der jüngsten Erkenntnisse, die Mutationen in Genen die Spleißosom Maschinen codieren, werden häufig in myelodysplastischen Syndromen 26-28 gefunden. Daher ist die Entwicklung zuverlässiger Verfahren zum Nachweis von alternativ gespleißten isoforms ist von großer Bedeutung in der Erforschung der vielfältigen biologischen Prozesse, einschließlich EMT.
Hier bieten wir ein Protokoll, um Veränderungen in alternative Spleißen unter Verwendung eines induzierbaren EMT-Modell zu erkennen. Die Verfahren zum Entwerfen von PCR-Primern und das Nachweisen Spleiß-Isoformen sind nicht nur für die Untersuchung von alternativem Spleißen während EMT, sondern auch zur Untersuchung des alternativen Spleißens in anderen biologischen Prozessen. Untersuchung alternatives Spleißen während EMT ist zwingend notwendig, um ein besseres Verständnis der Mechanismen der EMT und Metastasierung von Tumoren, so die Entwicklung von Strategien, um die Krebsmetastasen zu behandeln.
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Protocol
1. Zellkultur von EMT Induktions
Hinweis: EMT kann durch die Behandlung von TGFß oder ektopische Expression von Transkriptionsfaktoren Twist, Schnecke, oder ZEB1 / 2 in Epithelzellen induziert werden. In diesem Protokoll beschrieben ist eine induzierbare EMT-System über die Expression des Twist-ER-Fusionsprotein in verewigt menschlichen Brust Epithelzellen (HMLE / Twist-ER, ein Geschenk von Dr. J Yang, UCSD) 9,11,29. Auf 4-Hydroxytamoxifen (TAM) Behandlung transloziert das Fusionsprotein Twist-ER in den Kern, um die Transkription und führt zu einer vollständigen EMT Übergang in 12-14 Tagen 9,11,29 fahren. Zusätzliche EMT induzierbare Systeme, wie HMLE / Snail-ER, HMLE / TGFß und MCF10A / TGFß, finden Sie in unseren früheren Veröffentlichungen 11,30 gefunden werden.
- Aufrechterhaltung HMLE / Twist-ER Zellen in serumfreiem Brustepithelzellen Zellwachstumsmedium (MEGM) in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2. Durchgang die Zellen alle 2-3 Tage, wenn sie 80% Konfluenz erreichen. Zellen mit 0,15% Trypsin bei 37 ° C für 5-10 min, und anschließend mit Trypsin zu inaktivieren, 5% Kälberserum / DMEM. Spin-down-Zellen und resuspendieren sie in MEGM. Plattenzellen in einer neuen Gewebekulturschale in einem Verhältnis von 1 bis 4 ist.
- TAM in Ethanol auflösen, um eine 200 uM Lösung. TAM schützen vor Licht und bei -20 ° C. Vor Gebrauch frisch TAM in MEGM Medien Hinzufügen bei einer 1: 10.000 Verdünnung auf eine Endkonzentration von 20 nM TAM machen.
- Für die Induktion der EMT, Platte 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER-Zellen in einer 10 cm Gewebekulturschale in zweifacher Ausfertigung. Kulturzellen mit 20 nM TAM haltigen MEGM Medien.
- Platte 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER-Zellen in einer 10 cm-Schale in zweifacher Ausfertigung und Behandlung Zellen mit 0,01% Ethanol als nicht-TAM-behandelten Kontroll.
- Zwei Tage nach der Inkubation, machen Sie Fotos unter einem Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung zu morphologischen Veränderungen der Zellen zu erfassen.
- Saugen Sie das Medium aus einem Gericht der Kontrolle oder TAM-behandeltZellen. Waschen Sie die Zellen mit kaltem PBS und Ernte von Zellen Verschrottung Hälfte der Platte in der RNA-Lyse-Puffer für RNA-Isolierung und die andere Hälfte in RIPA-Puffer für die Proteinanalyse.
- Passage-Zellen aus der Steuerung oder TAM-behandelten Gerichten, die von Re-Plattierung 1,6 x 10 6 Zellen in einer 10 cm-Schale in zweifacher Ausfertigung. Kontinuierlich behandeln die Zellen mit 20 nM TAM oder Fahrzeug.
- Wiederholen Sie die Schritte 5 bis 7 einmal jeden zweiten Tag bis zum 14. Tag, zu welcher Zeit, TAM-behandelten Twist-ER-Zellen zeigen eine spindelförmige Morphologie mesenchymalen, während Vehikel-behandelten Kontrollzellen pflegen die Kopfsteinpflaster-wie epitheliale Morphologie.
2. Charakterisierung EMT
Hinweis: Ein Abschluss der EMT wird angezeigt durch: (1) Handy morphologische Veränderungen von einem pflastersteinartigen epithelialen Morphologie zu einer spindelförmigen Fibroblasten-ähnliche Aussehen; (2) Der Verlust der E-Cadherin-Lokalisation an Zell-Zell-Verbindungen; und (3) Der Schalt Expression von EMT-Marker, die durch den Verlust definiertepithelialen Marker und Verstärkung von mesenchymalen Marker.
Zelle morphologische Veränderungen durch Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung im Zeitverlauf der Induktion EMT erfasst, in Abschnitt 1. Immuno-Fluoreszenz-Detektion von E-Cadherin bei Zellen-Übergängen beschrieben, ist in diesem Abschnitt beschrieben. Die Expression von EMT-Marker wird durch Immunoblotting nachgewiesen. Gemeinsamen epithelialen Marker E-Cadherin, γ-Catenin und Occludin und mesenchymalen Marker umfassen Fibronektin, N-Cadherin und Vimentin. Allgemeine Vorgänge der Immunoblot werden in Abschnitt 4 beschrieben.
- Am Tag 12 der Behandlung TAM, Samen 1 x 10 5 Zellen auf einer 12 mm Glaskreisdeckglas in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte gelegt.
- 48 Stunden nach dem Aussäen absaugen mittel-und Wasch Zellen mit vorgewärmter PBS.
- Fix Zellen mit vorgewärmten 4% Paraformaldehyd für 15 min.
- Mit PBS waschen Zellen dreimal.
- Zellen mit 0,2% Triton X-100 in PBS Inkubieren für 15min bei RT.
- Mit PBS waschen Zellen dreimal.
- Zellen in 5% BSA / PBS-Inkubation für 1 h bei RT zu blockieren nichtspezifische Bindung.
- Zellen, die mit dem primären Antikörper E-Cadherin Inkubieren bei 1:50 Verdünnung in 1% BSA / PBS in einer befeuchteten Kammer O / N bei 4 ° C ist. HINWEIS: Der Bereich für primäre Antikörper Verdünnung ist normalerweise zwischen 1:50 und 1: 200, und die optimale Verdünnung für jeden Antikörper sollte experimentell bestimmt werden.
- Dekantiert man die primären Antikörper und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
- Zellen mit fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper inkubieren in einer 1: 500-Verdünnung für 1 h bei RT. Von diesem Schritt auf, schützen die Zellen vor Licht.
- Dekantiert man die sekundären Antikörper und dreimal mit PBS.
- Fleck Zellen mit 0,1-1 g / ml DAPI oder Hoechst für 10 min.
- Spülen Zellen dreimal mit PBS.
- Berg Deckgläschen mit einem Tropfen Eindeckmedium und Deckgläschen Dichtung mit Nagellack.
- Beachten Zellen und nehmenBilder unter einem Fluoreszenzmikroskop 63X.
Färbung mit zusätzlichen Antikörpern kann durchgeführt werden, um die EMT-Phänotyp zu bestätigen. Zum Beispiel können N-Cadherin und α-Aktin des glatten Muskels bei einer mesenchymalen Phänotyp 29,31,32 gefärbt werden. Reorganisation des Zytoskeletts Struktur kann durch Anfärben der Zellen mit Phalloidin für F-Actin-11 überwacht werden. Darüber hinaus können Assays auf Zellbeweglichkeit und Zelltod Widerstand durchgeführt werden, um die Eigenschaften des EMT 11 zu prüfen.
3. Nachweis der Splice-Isoformen Mit qRT-PCR-Assays
- Primer-Design
HINWEIS: Primerpaare sollten sorgfältig geplant werden, um unterschiedliche Spleiß-Isoformen zu verstärken. Exon-Skipping, das am häufigsten beobachteten alternatives Spleißen Fall wird hier als Beispiel für die Strategie der Primer-Design veranschaulichen. 1A zeigt einen Vier-Exon-pre-mRNA, wobei das dritte Exon als variable Exon. Einbeziehung von Exon 3 Ergebnisse indie Herstellung eines mehr Spleiß-Isoform, wobei das Exon 3 erzeugt einen kürzeren Spleiß-Isoform. Primer müssen entwickelt, um die Exon-3-Isoform enthalten und Exon-3-Isoform unterscheiden sprungen, und die Gesamt Transkript dieser mRNA zu detektieren.- Für den Nachweis von Exons Aufnahme sorgfältig Design eine Vorwärtsprimer innerhalb des variablen Exon 3 und einem Reverse-Primer in der Nähe konstitutive Exon 4, so dass für die spezifische Amplifikation der variablen Exon-Isoform enthalten. Achten Sie darauf, sowohl vorwärts als auch entwerfen und Reverse-Primer innerhalb der gleichen variable Exon, um PCR-Produkte aus genomischer DNA oder pre-mRNA verstärkt zu vermeiden.
- Zur spezifischen Amplifizierung Exon-Skipping-Ereignisse, Design einer der Primer überspannt den Übergang des konstitutiven Exon 2 und Exon 4, die auf andere Weise zerstört würde, wenn variable Exon 3 enthalten sein. Entwerfen der andere Primer in dem konstitutiven Exon 4. Daher werden PCR-Produkte erzeugt, nur wenn der variable Exon 3 excludEd und die konstitutive Exon 2 und Exon 4 werden anschließend miteinander verbunden.
- Um die Gesamt Transkripte des Gens zu erkennen, entwerfen die Primer innerhalb von zwei konstitutiven Exons 1 und 2. So werden PCR-Produkte aus allen Isoformen verstärkt.
- Sicherzustellen, dass die Schmelztemperatur (Tm) für alle Primer in etwa 55 ° C, wobei die Länge jedes Primers etwa 18-22 Nukleotide, und die Größe der PCR-Produkte liegt zwischen 80 und 150 Basenpaaren.
- RNA-Extraktion: Auszug RNA mit einer Gesamt-RNA Isolation Kit (siehe Tabelle der Materialien).
- Sammeln Zellen in 350 ul RNA Lyse-Puffer.
- Fügen Sie 350 ul 70% Ethanol zum Lysat und gründlich mischen.
- Übertragung der Probe auf die Säule zur Reinigung von RNA.
- Zentrifuge bei 10.000 g für 1 min und Durchfluss verwerfen.
- Einmal mit 500 ul Waschpuffer I RNA und RNA zweimal mit Waschpuffer II Die Säule.
- Reste von RNA-WaschpufferII von der Säule durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 2 Minuten.
- Übertragen die Säule in ein neues 1,5-ml-Röhrchen werden 50 ul Nuklease-freies Wasser in der Mitte des Säulenmatrix und Eluieren RNA durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit.
- Synthese von Erststrang-cDNA
- Bestimmung der Konzentration und Qualität der RNA durch UV-Absorptionsmessung. HINWEIS: Gute Qualität RNA sollte eine 260 nm / 280 nm Absorptionsverhältnis von etwa 2,0.
- Der reverse Transkriptase (RT)-Reaktionen, die 250 ng Gesamt-RNA, 0,05 ug Zufalls-Hexamer-Primer, 50 pmol MgCl2, 10 pmol dNTP, 2 ul 5 · GoScript Puffer und 1 ul RT-Enzym in einem Endvolumen von 20 ul enthalten eingestellt.
- Führen RT-Reaktionen bei 42 ° C für 1 h, gefolgt von einer Inkubation bei 70 ° C für 5 min, um die RT-Enzym zu inaktivieren.
- Echtzeit-PCR
- Bis 20 ul Reaktionen, die von 10 ul SYBR Green Master Mix bestehen eingestellt,0,1-1,0 ul cDNA-Vorlage, und 5 pmol Vorwärts und Rückwärts-Primer.
- Führen Echtzeit-PCR mit 40 Zyklen der folgenden Schritte: 95 ° C Denaturierung für 10 Sekunden bei 58 ° C Annealing für 10 sec und 60 ° C Extension für 30 Sekunden. Führen PCR-Reaktionen in dreifacher Ausfertigung.
- Überprüfen Dissoziationskurven und stellen Sie sicher, dass ein einzelner Peak ist für jedes Primerpaar beobachtet.
- Erhalten die Werte Quantifizierung Zyklus (CQ) durch die Berechnung der zweiten Ableitung Werte der Verstärkungskurven.
- Berechnen der relativen Menge (RQ) des Ziel-mRNAs in induzierten Proben im Vergleich zu der nicht-induzierten Probe unter Verwendung des 'Delta-Delta-Cq (ΔΔCq) "-Methode, wie durch die folgende Formel gezeigt. Verwenden Housekeeping-Gene, wie GAPDH oder TBP, als Referenz.
Um genauer zu berechnen relativen Werte von Spleiß-Isoformen, ter von mehreren Referenzgenen verwenden sollten berücksichtigt werden. Die Ergebnisse können unter Verwendung eines von Pfaffl et al 33,34 beschriebenen modifizierten Absolutwert Quantifizierungsmethode analysiert werden.
4. Prüfung der Splice-Isoformen auf Proteinebene
- Sammeln Zellen in 100 ul eiskaltem RIPA-Puffer.
- Stellen Lysate auf Eis für etwa 10 min.
- Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min bei 4 ° C und Sammeln des Überstandes.
- Messung der Proteinkonzentration durch Bradford-Assays.
- Verdünnte Proteinproben in SDS-Beladungspuffer geladen 20-40 ug Proteine in 10% SDS-PAGE-Gelen.
- Führen SDS-PAGE-Gelen bei 20 mA für 1,5 Stunden.
- Transfer-Proteine auf PVDF-Membranen in einer Nasstransfersystem bei 4 ° C für 3 h bei 85 V. Einstellen der Übertragungszeit nach dem Molekulargewicht des Zielproteins.
- Block Membran in 5% fettfreier Milch 30 min bis 1 h bei RT.
- Inkubieren Membran witen einen primären Antikörper bei 4 ° CO / N. Der Bereich für die Primärantikörperverdünnung in der Regel zwischen 1: 200 und 1: 5.000, bestimmen die optimale Verdünnung für jeden Antikörper experimentell. Die Verdünnung der Antikörper in diesem Protokoll verwendet werden, können in "Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte" zu finden.
- Um Spleiß-Isoformen erkennt, verwenden Sie spezifische Antikörper, die eine bestimmte Isoform zu erkennen. Alternativ können einen Antikörper, der das Epitop im konstitutiven Exon codierenden Region erkennt und erfassen Spleiß-Isoformen gleichzeitig aufgrund ihrer unterschiedlichen Proteingrößen.
- Zur gleichen Zeit, zu überwachen EMT durch Immunoblotting EMT-Marker. Sie können den E-Cadherin, γ-Catenin und Occludin als epithelialer Marker und Fibronektin, N-Cadherin und Vimentin als mesenchymalen Marker.
- Waschen der Membran dreimal mit TBS-T (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) in einem 5-Minuten-Intervall.
- Inkubieren Membran mit einem HRP-konjugierten sekundären Ameisenibody in einer 1: 10.000-Verdünnung für 1 h bei RT.
- Waschen der Membran dreimal mit TBS-T bei einer 5-min-Intervall.
- Visualisieren Protein mit einem Chemilumineszenz-Detektionssystem und setzen die Membran auf eine Autoradiographiefilm.
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Representative Results
Die oben beschriebenen Verfahren stellen eine robuste Methode zur alternatives Spleißen während EMT erfassen. Repräsentative Ergebnisse der CD44 splice Isoform Schalt bei Twist-induzierte EMT sind nachfolgend als Beispiel angegeben.
Twist-induzierte EMT in HMLE / Twist-ER-Zellen wurde durch einen Übergang von einem Kopfstein wie epitheliale Phänotyp zu einem länglichen Fibroblasten-Phänotyp (2A), das Fehlen von epithelialen Marker E-Cadherin, γ-Catenin und Occludin und die dadurch Hochregulation von mesenchymalen Marker Fibronektin, N-Cadherin und Vimentin (2B). Weiterhin wurde EMT durch den Verlust der E-Cadherin-Lokalisierung an Zell-Zell-Verbindungen (2C) beurteilt.
Die Expression von CD44 schaltet Spleiß-Isoformen während EMT wurde von qRT-PCR und Immunoblot untersucht. Das menschliche CD44-Gen wird von neun variablen Exons besteht. Alternatives Spleißen von CD44 ermöglicht Zellen proDuce CD44-Varianten (CD44v), die mindestens eine variable Exon, und CD44-Standard (CD44s), die frei von allen variablen Exons umfassen. 3A zeigt die Strategie der Primer-Design für den Nachweis von CD44 verschiedenen Spleiß-Isoformen. Für den Nachweis der Exon-übersprungenen Produkt CD44s wird der Vorwärtsprimer in den konstitutiven Exon 5 liegt, während der Rückwärtsprimer überspannt der Verbindung zwischen konstitutive Exons 5 und 6. Für den Nachweis von CD44v Spleiß-Isoformen, die die V5 und V6 variablen Exons, die Vorwärts und Rückwärtsprimer innerhalb des V5 und V6 ausgelegt sind. Primer für den Nachweis von anderen CD44 variable Exon-enthaltenden Isoformen unter Verwendung der gleichen Strategie entworfen werden. Zusätzlich wird die Gesamt CD44 Transkript unter Verwendung von Vorwärts und Rückwärts-Primern, die in der konstitutiven Exon 2 und Exon 3, bzw. (3A) befindet, erfasst wird. Wie in 3B gezeigt, qRT-PCR-Analysen unter Verwendung dieser Primersätze zeigten eine signifikante Abnahme der CD44v-mRNA und der Erhöhung der CD44s mRNA nach 14 Tagen der TAM Behandlung in den Twist-ER-exprimierenden Zellen HMLE. Dagegen ist der Gesamt Transkript von CD44 blieb während EMT (3C) unverändert. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der qRT-PCR, der Proteingehalt von CD44v sank deutlich, während die Expression des Proteins wurde CD44s stark hochreguliert (Abbildung 3D). Daher ist die große Isoform von CD44 wurde von CD44v zu CD44s während der EMT-Prozess verschoben.
Abbildung 1. Primer-Design. Schematische Darstellungen, die Lage der Primer zur Detektion Spleißen Isoformen in einem Exon-Skipping-Modell. Die grauen Kästen stellen konstitutive Exons, die orangefarbenen Kästen stellen variablen Exons, und die dünnen Linien, Kästchen bezeichnen Introns. Die Primer-Standorte sind INDICATed durch Pfeile: schwarze Pfeile deuten Primer-Sets zum Nachweis von Gesamt-mRNA, orange Pfeile zeigen Primer-Sets zur Verstärkung Exon-Isoformen enthalten, und blaue Pfeile zeigen Primer-Sets zum Nachweis von Exon-Skipping-Isoformen.
Abbildung 2. Die Induktion der EMT. (A) Phasenkontrastaufnahmen (10x) darstellt morphologischen Veränderungen HMLE / Twist-ER Zellen vor (unbehandelt) und nach 14 Tagen der Behandlung TAM. (B) Immunoblot-Analyse der EMT-Marker in HMLE / Twist-ER Zellen vor (unbehandelt) und nach 14 Tagen der TAM-Behandlung. Nach TAM Behandlung epithelialen Marker E-Cadherin, γ-Catenin und Occludin wurden herunterreguliert, und mesenchymalen Marker Fibronektin, N-Cadherin und Vimentin wurden hochreguliert. (C) Immunfluoreszenzbilder (63X), die den Verlust der E-CadherinLokalisierung an Zell-Zell-Verbindungen nach 14 Tagen der Behandlung TAM. Grüne Färbung zeigt an E-Cadherin-und DAPI-Färbung (blau) zeigt Kernen. Maßstab = 10 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Schalten von CD44 Spleiß-Isoformen während EMT. (A) Primer-Design für den Nachweis von CD44-Spleiß-Isoformen. Die grauen Kästen stellen konstitutive Exons, die orangefarbenen Kästen stellen variablen Exons, und die dünnen Linien, Kästchen bezeichnen Introns. Die Primer-Stellen sind durch Pfeile angegeben: schwarzen Pfeile zeigen Primer-Sets zum Nachweis CD44 Gesamt-mRNA, orange Pfeile zeigen Primersätze zum Amplifizieren CD44v5-6 und blaue Pfeile zeigen Primersätze fürErfassen CD44s. (B, C) qRT-PCR-Analyse der Ebenen von CD44-Isoformen in EMT Verwendung von Primern, die spezifisch nachzuweisen CD44v die variable Exon v5 und v6 (v5 / 6) und CD44s (B) und CD44 gesamte mRNA (C) . Relative Expression von mRNA in Tag 14 wurden die Zellen zur entsprechenden Tag 0 Zellen in TAM behandelten und nicht behandelten Gruppen normalisiert. Fehlerbalken zeigen SEM; n = 3. (D) Immunoblot-Analyse von CD44-Isoformen während TAM-induzierten EMT in HMLE / Twist-ER-Zellen. Stufen von E-Cadherin und N-Cadherin wurden überwacht, um den Status EMT identifizieren.
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Discussion
Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht den Nachweis des alternativen Spleißens in einem induzierbaren EMT-Modell. Als solche dynamische Veränderungen der Spleiß-Isoform-Expression im gesamten zeitlichen Verlauf der EMT erfasst werden. Diese Methode hat Vorteile gegenüber der Verwendung von unterschiedlichen epithelial- oder mesenchymalen-Zelllinien, die für den Vergleich von alternativen Spleißen, weil verschiedene genetische Hintergründe aus un-verwandten Zelllinien konnte mäßig beeinflussen alternative Spleißen. Allerdings muss die erfolgreiche Induktion der EMT sorgfältig bestätigt mit verschiedenen EMT-Marker vor jeder Rückschlüsse auf Veränderungen in alternative Spleißen gezogen werden können. Ferner kann zusätzlich zu dem hier beschriebenen Twist-ER-induzierbare System EMT, EMT andere Systeme wie die von Snail-ER oder TGF induziert werden zur Validierung von experimentellen Befunden 11,30 empfohlen.
Das Schalten der Spleiß-Isoformen bei EMT in beiden RNA-und Proteinebene erfasst werden. Splice isoForm-spezifische Antikörper für die Proteinanalyse bevorzugt. Wenn Isoform-spezifischen Antikörper nicht verfügbar sind, können Proteinspiegel von Spleiß-Isoformen auf der Grundlage ihres Molekulargewichts auf SDS-PAGE durch Immunoblotting bestimmt werden. RNA-Ebene von jeder Isoform durch Isoform-spezifischen Primern quantifiziert werden. Mit qRT-PCR-Assays kann die Falte Änderung jeder Isoform sein feinfühlig und präzise bestimmt. Insbesondere wenn experimentellen Materialien beschränkt, wie die Analyse der Expression eines bestimmten Spleiß-Isoform in klinischen Proben liefert qRT-PCR-Analyse, die ein quantitatives Maß für das Fehlen von Isoform-spezifischen Antikörper für die Immunhistochemie kompensieren würde.
Das hier beschriebene Verfahren eignet sich zum Nachweis von bekannten Spleiß-Isoform Änderungen während EMT. Darüber hinaus kann dieses Verfahren für die Untersuchung der genomweiten alternativen Spleißen und zur Identifizierung neuer Spleiß-Isoform Schalt während EMT erweitert werden. Um dies zu erreichen,Verwendung eines Großtechnik, wie RNA-Sequenzierung oder tief Spleißen empfindlichen Mikroarray Plattformen könnten unter Verwendung von RNAs, die von der oben beschriebenen induzierbaren EMT Modell isoliert werden. Dennoch ist qRT-PCR Validierung Isoform Veränderungen nach jeder großen Analyse.
Zusammenfassend ist das alternative Spleißen dynamisch während EMT, ein Verfahren, die für die embryonale Entwicklung und Tumormetastasierung ist geregelt. In Anbetracht der hohen Frequenz des alternativen Spleißens im menschlichen Genom, ist es wahrscheinlich, dass die Regulierung des alternativen Spleißens spielt eine wichtige Rolle in vielen biologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich der Zelldifferenzierung, Gewebeentwicklung und den programmierten Zelltod 35-41. Die hierin für den Nachweis von Spleiß-Isoformen beschriebenen Protokoll werden für andere Systeme als auch.
Zusätzliche experimentelle Modalitäten wie Spleißen Reporter Minigens Assays, BE verwendet werden, um weiter zu untersuchen, die regulatorischen Mechanismen der cis-wirkende Elemente und trans-wirkende Faktoren, die alternative Spleißen 30,42,43 steuern. Weiterhin kann die funktionelle Rolle eines bestimmten Spleiß-Isoform in EMT durch Silencing oder ektopisch die spezifische Isoform exprimieren und Überwachungs EMT Induktion in der beschriebenen EMT-induzierbare System 11 untersucht werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 μM. Keep the solution at -20 °C protected from light. |
| E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit | Omega Bio-Tek | R6731 | Total RNA isolation kit |
| GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5001 | Reagent for qRT-PCR assay |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6002 | Reagent for qRT-PCR assay |
| LightCycler 480 Real-Time PCR System | Roche | Equipment for qRT-PCR assay | |
| CD44 antibody | R&D Systems | BBA10 | 1:1,000 dilution |
| E-cadherin antibody | Cell Signaling Technology | 4065 | 1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence |
| γ-Catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2309 | 1:1,000 dilution |
| Occludin antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-5562 | 1:500 dilution |
| Fibronectin antibody | BD Transduction Laboratories | 610077 | 1:5,000 dilution |
| N-cadherin antibody | BD Transduction Laboratories | 610920 | 1:2,000 dilution |
| Vimentin antibody | NeoMarkers | MS-129-p1 | 1:500 dilution |
| GAPDH antibody | Millipore Corporation | MAB374 | 1:10,000 dilution |
| Amasham ECL Western blotting detection reagent | GE Health Life Science | RPN2209 | Chemiluminescence system |
References
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