Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.
Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and γ-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.
상피 – 간엽 전환 (EMT)의 배 발생시 기관의 형태 형성 및 조직 리모델링을 구동하는 발달 프로그램입니다. 비정상적으로 활성화되면, EMT는 종양 전이 및 장기 섬유화 1,2를 촉진한다. 강제적 인 연구 cobble-의 유실있는 adherens 접합 단백질 E-카드 헤린의 발현을 억제 그러한 트위스트, 달팽이 및 ZEB 여러 전사 인자,,,로 정의, EMT 과정에서 전사 조절의 중요성을 설명 하였다 상피 형태와 스핀들 모양의 중간 엽 표현형 3-8의 이득과 같은 돌. RNA를 게놈 차원의 분석을 통해 최근의 연구 접합 패턴 상피 또는 중간 엽 표현형 9, 10 중 하나와 관련된 유전자의 그룹이 존재하는 것으로 나타났습니다. 우리가 실험실에서 작업 기능적 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)와 EMT 연결. 세포 표면 부착 분자 CD44을 연구함으로써 CD44의 altern 시연극상의 접합이 긴밀하게 EMT 동안 규제하고, 더 중요한 것은, 인과 적으로 전환하는 CD44 스플 라이스 이소 11 EMT에 기여한다.
대안 12-14을 접합하는 인간의 다중 엑손 유전자의 95 %까지로 대체 접합은 유전자 조절의 광범위하고 보존 모델을 나타냅니다. 단일 유전자로부터 다중 단백질 제품을 생성함으로써, 대안적인 스 플라이 싱은 인간 게놈에 또 다른 층의 복잡성을 추가 단백질 다양성 필수기구를 구성한다. 따라서, 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 조절 이상이 잠재적으로 인간의 질병을 일으키는 원인이 심오한 생물학적 효과가 발생할 수 있습니다. 사실, 질병에서 벗어난 대안으로 연결할 수는 spliceosome 기계를 코딩하는 유전자의 돌연변이는 일반적으로 골수 형성 이상 증후군 26 ~ 28에서 발견되는 최근의 연구 결과를 포함, 10 년 이상 15 ~ 25에 설명되어 있습니다. 따라서, 다르게 스 플라이 싱 된 난의 검출을위한 신뢰성있는 방법을 개발soforms는 EMT 등 다양한 생물학적 과정의 연구에 매우 중요하다.
여기서 우리는 유도 EMT 모델을 사용하여 대체 스 플라이 싱의 변화를 검출하는 프로토콜을 제공한다. 스플 라이스 이소 폼을 PCR 프라이머를 설계 및 검출하기위한 방법이 EMT 대체 스 플라이 싱 동안의 연구뿐만 아니라 다른 생물학적 과정에서 대체 스 플라이 싱의 연구뿐만 아니라 적합하다. EMT 동안 대체 스 플라이 싱을 더 조사하면, 따라서 암 전이를 치료하기위한 효과적인 전략의 개발을 촉진 EMT 및 종양 전이의 메커니즘을 이해하기 위해 필수적이다.
여기에 설명 된 절차를 유도 EMT 모델에서 스 플라이 싱의 검출을 가능하게한다. 스플 라이스 이소 형의 발현의 이러한 동적 변화가 EMT의 시간 경과에 걸쳐 캡처 할 수있다. UN 관련 세포주 구별 유전 배경 부당 대체 스 플라이 싱에 영향을 미칠 수 있기 때문에이 방법은 다른 스 플라이 싱의 비교를위한 상이한 epithelial- 또는 간엽-나타내는 세포주의 사용에 이점을 갖는다. 그러나, EMT의 성공적인 유…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge Wensheng Liu for invaluable help with cell imaging. This work was supported by grants from the US National Institutes of Health (R01 CA182467), American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), Lynn Sage Foundation, and A Sister’s Hope Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
4-hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | Make stock solution by dissolving in ethanol to 200μM, and keep at -20℃ protected from light. |
E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit | Omega Bio-Tek | R6731 | Total RNA isolation kit |
GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5001 | Reagent for qRT-PCR assay |
GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6002 | Reagent for qRT-PCR assay |
LightCycler 480 Real-Time PCR System | Roche | Equipment for qRT-PCR assay | |
CD44 antibody | R&D Systems | BBA10 | 1:1000 dilution |
E-cadherin antibody | Cell Signaling Technology | 4065 | 1:2500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence |
γ-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2309 | 1:1000 dilution |
occludin antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-5562 | 1:500 dilution |
fibronectin antibody | BD Transduction Laboratories | 610077 | 1:5000 dilution |
N-cadherin antibody | BD Transduction Laboratories | 610920 | 1:2000 dilution |
vimentin antibody | NeoMarkers | MS-129-p1 | 1:500 dilution |
GAPDH antibody | Millipore Corporation | MAB374 | 1:10000 dilution |
Amasham ECL Western blotting detection reagent | GE Health Life Science | RPN2209 | Chemiluminescence system |