Introduction
Epitel-mezenkimal geçiş (EMT) Embriyogenesis sırasında organ morfogenetiğine ve doku yenileme sürücüler gelişimsel bir programdır. Anormal aktive edildiğinde, EMT tümör metastazı ve organ fibrozis 1,2 teşvik etmektedir. Zorlayıcı çalışmalar cobble- kaybıyla sonuçlanan adherens birleşme proteini E-kaderin ifadesini bastırmaktadır örneğin Twist, salyangoz ve Zeb gibi çeşitli transkripsiyon faktörleri, tarafından tanımlanan, EMT sürecinde transkripsiyon düzenlemesi önemini tarif etmişlerdir epitel morfolojisi ve iğ biçimli mezenkimal fenotip 3-8 kazancı gibi taş. RNA'lar genom analizi ile yapılan son çalışmalar yapıştırma desenler epitel veya mezenkimal fenotiplerle 9,10 ya ile ilişkili genlerin bir grup var olduğunu ortaya koymuştur. Laboratuarımızda çalışmak işlevsel alternatif eklemeler ve EMT bağlı. Hücre yüzey adezyon molekülü CD44 inceleyerek, CD44 altern gösterdiative yapıştırma sıkı EMT sırasında düzenlenir, ve daha da önemlisi, nedensel anahtarlama bu CD44 ekleme izoformdur 11 EMT katkıda bulunmaktadır.
Alternatif 12-14 raptedilmektedir insan çoklu-ekson genlerin% 95 kadar alternatif yapıştırma, gen regülasyonu bir yaygın ve korunmuş modelini temsil eder. Tek bir genin birden fazla protein ürünlerinin üretilmesi ile beraber, alternatif birleştirme insan genomuna karmaşıklık bir katman eklenerek protein çeşitliliği için önemli bir mekanizma oluşturur. Bu nedenle, alternatif uç uca eklenmesi düzensizliği, potansiyel olarak hastalığa neden olan insan derin biyolojik etkileri yol açabilir. Nitekim, hastalıklarda anormal alternatif yapıştırma spliceosom makine kodlayan genlerde mutasyonlar sık miyelodisplastik sendromlarda 26-28 bulunan son bulgular da dahil olmak üzere, bir yılda 15-25 rapor edilmiştir. Bu nedenle, alternatif olarak eklenmiş i tespiti için güvenilir yöntemler geliştirmeksoforms EMT de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlerin çalışmada büyük önem taşımaktadır.
Burada bir uyarılabilir EMT modeli kullanılarak alternatif ekleme değişiklikleri algılamak için bir protokol sağlar. Bağlantı izoformları PCR primerlerini tasarlama ve tespit edilmesi için yöntemler, EMT sırasında alternatif splicing çalışma için değil, aynı zamanda diğer biyolojik süreçlerde alternatif splicing çalışma için sadece uygundur. EMT sırasında alternatif eklemeler araştıran iyi böylece kanser metastazı tedavi etmek için etkili stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırmak, EMT ve tümör metastazı mekanizmalarını anlamak için zorunludur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
EMT İndüksiyon 1. Hücre Kültürü
Not: EMT TGFβ tedavisi veya epitel hücrelerinde transkripsiyon faktörleri Twist, salyangoz veya Zeb1 / 2 ektopik sentezlenmesi ile indüklenebilir. Ölümsüzleştirilmiş insan meme epitelyum hücreleri (HMLE / döndürme-ER, Dr. J. Yang bir hediye UCSD) 9,11,29 yılında Twist-ER, füzyon proteininin sentezlenmesi yoluyla uyarılabilir bir EMT sistemi bu protokolde tarif edilmektedir. 4-OH (TAM) İşleme üzerine, füzyon proteini Bükülme ER 12-14 gün 9,11,29 tam EMT geçiş transkripsiyon ve sonuçları elde etmek için çekirdeğe doğru yer değiştirir. Bu HMLE / Salyangoz-ER, HMLE / TGFβ ve MCF10A / TGFβ gibi ek EMT uyarılabilir sistemler, önceki yayınlarda 11,30 bulunabilir.
- % 5 CO2 içeren bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde, serumsuz meme epitelyal hücre büyüme ortamında (MEGM) olarak HMLE / Bükülme ER hücreleri korumak. Passage hücreler her 2-3 gün% 80 izdiham ulaştığınızda. % 5 buzağı serumu / DMEM ile tripsin inaktive daha sonra 5-10 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.15 tripsin ile inkübe hücreleri, vb. Hücreleri aşağı Spin ve MEGM onları tekrar süspansiyon. 1-4 arasında bir oranda yeni bir doku kültürü çanağı içinde plakası hücreleri.
- 200 uM çözelti yapmak için etanol içinde TAM çözülür. -20 ° C'de ışık ve mağaza TAM koruyun. 20 nM TAM bir son konsantrasyon yapmak için 10,000 seyreltmenin kullanımdan önce yeni bir 1 de MEGM ortamına TAM ekleyin.
- EMT uyarılması için, iki nüsha halinde 10 cm doku kültürü çanak içine 1,6 x 10 6 HMLE / Twist ER hücreleri plaka. 20 nM TAM-ihtiva eden ortam ile MEGM Kültür hücreleri.
- Nüsha halinde 10 cm çanak içine Plaka 1,6 x 10 6 HMLE / Twist ER hücreleri ve olmayan TAM muamele kontrol olarak% 0.01 etanol ile tedavi hücreleri.
- İki gün kuluçkadan sonra, hücrelerin morfolojik değişikliklerini kaydetmek için 10X büyütmede ışık mikroskobu altında fotoğraf çekmek.
- Kontrol veya TAM ile muamele edilmiş bir çanak ortamı basınçla emiliphücreler. RNA izolasyonu ve protein analizi için RIPA tamponunda diğer yarısı için RNA, liziz tamponu içinde plakanın yarısını hurdaya soğuk PBS ile hücreleri ve hasat hücreleri yıkayın.
- Nüsha halinde 10 cm çanak yeniden kaplama 1,6 x 10 6 hücre tarafından kontrol veya TAM-işlenmiş yemekler Passage hücreleri. Sürekli 20 nM TAM veya araç ile hücre tedavisi.
- Tekrar, araçla tedavi edilmiş kontrol hücreleri, parke taşı gibi epitel morfolojisi muhafaza ise, bu sürenin sonunda, TAM ile muamele edilmiş Bükülme ER hücreler bir iğ şeklinde mezenkimal morfolojisini, 14 gün kadar 5 kez her gün ila 7.
EMT 2. Karakterizasyonu
Not: EMT A tamamlanması ile gösterilir: bir iğ şeklinde fibroblastik gibi görünümü için bir Arnavut kaldırımı gibi epitel morfolojiden (1) Cep morfolojik değişimler; (2) hücre-hücre kavşaklarda e-kaderin lokalizasyon kaybı; kaybıyla tanımlanan EMT belirteçleri ve (3) açık ifadesi,epitel belirteçleri ve mezenkimal belirteçlerinin kazanç.
Hücre morfolojik değişiklikler bu bölümde anlatılan hücre kavşaklarda E-kaderin Bölüm 1. immüno-floresans algılama tarif EMT indüksiyon zamanı sırasında 10X büyütmede ışık mikroskobu tarafından yakalanır. EMT markerlerin ifadesi immünolojik işaretleme ile tespit edilir. Ortak epitelial yapıcıları E-kadherin, γ-katenin ve occludin, ve mezenkimal belirteçler, fibronektin, N-kaderin ve vimentin içerir. Imünoblotlarını genel prosedür Bölüm 4'te açıklanmıştır.
- TAM işlemden geçirilmesi, tohumların, bir 24-yuvalı plakanın bir çukuruna yerleştirilmiş bir 12 mm'lik dairesel bir örtücü cam üzerine 1 x 10 5 hücre bölgesinin 12. günde.
- Önceden ısıtılmış PBS ile tohumlama, aspirat orta ve yıkama hücrelerin 48 saat sonra.
- 15 dakika boyunca ön ısıtılmış% 4 paraformaldehid, hücreler.
- PBS ile hücreler üç kez yıkayın.
- 15 için PBS içinde% 0.2 Triton X-100 ile inkübe hücrelerioda sıcaklığında Min.
- PBS ile hücreler üç kez yıkayın.
- Spesifik olmayan bağlanmayı bloke etmek için oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 5 BSA / PBS içinde hücreleri inkübe edin.
- 4 ° C'de 1:50 seyreltme,% 1 BSA / nemli bir oda O PBS / H de birincil antikor E-kaderin hücreleri inkübe edin. Not: Primer antikor seyreltmesi için aralık 1:50 ile 1 arasında, normal olarak: 200, ve her bir antikor için optimal dilüsyon deneysel olarak tespit edilmelidir.
- Birincil antikor süzün ve PBS ile hücreler üç kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 500 oranında seyreltilmiş bir 1: floresan-etiketli sekonder antikor ile inkübe hücreleri. Bu aşama, ışıktan hücreleri korumak.
- İkincil antikor süzün ve üç kez PBS ile yıkayın.
- 10 dakika boyunca 0.1-1 ug / ml DAPI veya Hoechst ile Leke hücreleri.
- PBS ile üç kez hücreleri durulayın.
- Dağı oje ile bir montaj orta damla ve mühür lamelleri ile lamelleri.
- Hücreleri gözlemlemek ve almak63X floresan mikroskop altında görüntüler.
Ek antikorlar ile lekeleme EMT fenotipi teyit etmek için yapılabilir. Örneğin, N-kaderin ve α-düz kas aktini mezenkimal fenotip 29,31,32 için boyanmış olabilir. Iskelet yapısı yeniden düzenlenmesi, F-aktin için 11 falloidinle hücrelerin boyanması ile izlenebilir. Buna ek olarak, hücre motilitesi ve hücre ölümü direnç için deneyler, EMT 11 özelliklerini incelemek için gerçekleştirilebilir.
Mah-PCR Tahliller kullanma Algılama Splice izoformlannın 3.
- Primer Tasarım
Not: Primer çiftleri dikkatlice nokta bağlantı izoformları amplifiye etmek için tasarlanmış olmalıdır. Atlama ekson, en sık görülen alternatif bağlama olayı, birincil tasarım stratejisini açıklamak için bir örnek olarak gösterilmektedir. Şekil 1A değişken ekson olarak üçüncü ekson, bir dört-ekson ön-mRNA göstermektedir. Ekson İçerme 3 sonuçlarıekson 3'ün atlama ise daha uzun bir bağlantı izoformunun üretimi, daha kısa bir bağlantı izoformunu oluşturur. Primerler, ekson-3 dahil olmak üzere iki izoformu ve ekson-3-atlanan izoformunu ayırt etmek ve bu mRNA'nın toplam transkript tespit etmek için tasarlanmış olması gerekir.- Ekson dahil belirlenmesi için, dikkatli bir şekilde değişken ekson dahil izoformunun spesifik amplifikasyonu sağlayan, değişken ekson 3 ve ekson 4 yakın kurucu içinde bir ters primer içinde bir ileri primer tasarımı. Hem ileri hem de tasarım ve genomik DNA veya ön-mRNA 'dan çoğaltılmış PCR ürünleri önlemek amacıyla aynı değişken ekson içinde ters primerlerli değil emin olun.
- Özellikle ekson atlama olayları, tasarım amplifiye etmek için, değişken ekson 3 dahil edildiğinde, aksi imha edilecek kurucu ekson 2 ve ekson 4 birleşim yerini kapsayarak tek primer. Bu nedenle yapısal ekson 4'ün içine, diğer birincil tasarım, PCR ürünleri değişken ekson 3 exclud olduğu zaman oluşturulacaked ve ekson 2 ve ekson 4 sonradan birleştirilir kurucu.
- , Genin toplam transkriptlerini algılamak iki kurucu ekson 1 ve 2 içinde primerler Böylece tasarlamak için, PCR ürünleri tüm izoformları amplifiye edilmiştir.
- Emin, tüm primerler için erime sıcaklığı (Tm) yaklaşık olarak 55 ° C arasında, her bir primer uzunluğu yaklaşık 18-22 nükleotid olduğunu olun ve PCR ürünlerinin boyutunu 80 ile 150 baz çiftidir.
- RNA ekstraksiyonu: (Malzeme Tabloya bakınız), toplam RNA izolasyon kiti kullanılarak RNA ekstrakte edin.
- 350 ul RNA lizis tampon hücreleri toplayın.
- Lizat% 70 etanol içinde 350 ul ekleyin ve iyice karıştırın.
- RNA saflaştırma Numuneyi kolona aktarın.
- 1 dakika ve atma flow-through için 10.000 x g'de santrifüj.
- RNA, yıkama tamponu II ile bir kez RNA, yıkama tamponu I 500 ul ile ve iki kez de sütun yıkayın.
- RNA, kalıntı yıkama tamponunu çıkarın2 dakika süreyle maksimum hızda santrifüj ile kolondan II.
- , Yeni bir 1.5 ml'lik bir tüp içine transfer sütun sütun matrisine merkezinde 50 ul nükleaz içermeyen su ilave edin ve en yüksek hızda santrifüj ile RNA aynlır.
- Birinci-şerit cDNA sentezi
- UV absorpsiyon ölçümü ile konsantrasyon ve RNA kalitesini belirler. NOT: Kaliteli RNA yaklaşık 2,0 260 nm / 280 nm absorbans oranı olmalıdır.
- 20 ul nihai hacim içinde 250 ng toplam RNA, 0.05 ug tesadüfi heksamer öncüllerin, 50 pmol MgCl2, 10 pmol dNTP, 2 ul 5 x GoScript tamponu ve 1 ul RT enzimi ters transkriptaz (RT) reaksiyon ayarlayın.
- RT enzimin inaktivasyonu için 5 dakika boyunca 70 ° C 'de inkübasyon, ardından 1 saat için 42 ° C RT reaksiyonları gerçekleştirmek.
- Gerçek zamanlı PCR
- 10 ul SYBR yeşil ana karışımı oluşur 20 ul reaksiyonları kurmak,0.1-1.0 ul cDNA şablon ve 5 ileri pmol ve geri primerler.
- Aşağıdaki adımlardan 40 döngü ile gerçek-zamanlı PCR çalıştırın: 95 ° C'de 10 saniye denatürasyon, 10 saniye için 58 ° C tavlama, 30 saniye için 60 ° C uzatma. PCR reaksiyonları, üç kopya halinde gerçekleştirin.
- Ayrışma eğrileri kontrol edin ve bir tek tepe her astar kümesi için gözlenen emin olun.
- Amplifikasyon eğrileri ikinci türev değerleri hesaplanarak ölçüm döngüsü (Cq) değerlerini elde edin.
- "Delta Cq (ΔΔCq '), aşağıdaki formül ile gösterildiği gibi, yöntem kullanılarak indüklenmemiş numunesine kıyasla neden örneklerdeki hedef mRNA nispi miktarı (RQ) hesaplayın. Bir referans olarak, örneğin GAPDH veya TBP olarak temizlik genleri kullanın.
Daha doğru bağlantı izoformlannın göreli değerlerini hesaplamak için to dikkate alınmalıdır çoklu referans gen kullanır. Sonuçlar Pfaffl ve ark 33,34 tarafından tarif edilen modifiye mutlak değeri, ölçüm yöntemi kullanılarak analiz edilebilir.
Protein Düzeyinde Splice izoformlannın 4. incelenmesi
- 100 ul buz gibi soğuk RIPA tampon maddesi içinde hücreler toplanır.
- Yaklaşık 10 dakika boyunca buz üzerinde lizatları ayarlayın.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 14,000 x g'de santrifüje ve süpernatan toplamak.
- Bradford protein konsantrasyonu tahlilleri ile ölçülür.
- SDS yükleme tamponu içinde protein örnekleri seyreltin ve 10% SDS-PAGE jelleri içine proteinlerin 20-40 ug yükleyin.
- 1.5 saat için 20 mA'da SDS-PAGE jelleri çalıştırın.
- 85 V, 3 saat boyunca 4 ° C'de nemli bir transfer sistemi olarak PVDF membranlarına transfer proteinleri hedef proteinlerin moleküler ağırlığa göre transfer süresi ayarlayın.
- 30 dakika oda sıcaklığında 1 saat için% 5 yağsız süt içinde Blok membran.
- Membran wi inkübe4 ° CO / K bir birincil antikor th. 200 ve 1: 5000, deneysel olarak her bir antikor için optimum seyreltme oranını belirleyen birincil antikor seyreltmesi için aralık normalde 1 arasındadır. Bu protokolde kullanılan antikorların seyreltme "özel reaktifler ve ekipman Tablo" bulunabilir.
- Bağlantı izoform tespit etmek için, belirli bir izoformunu tanıyan spesifik antikorlar kullanılır. Seçenek olarak ise, kurucu ekson kodlama bölgesi epitopunu tanıyan bir antikorun kullanılması ve bunların, protein farklı boyutlarına göre eş zamanlı olarak bağlantı izoform algılar.
- Aynı zamanda, EMT belirteçleri için immüno-lekeleme EMT izler. Mezenkimal belirteçler olarak e-kaderin, γ-katenin ve epitel belirteç olarak occludin ve fibronektin, N-kaderin ve vimentin.
- 5 dakikalık bir aralıkla TBS-T (50 mM Tris, 150 mM NaCI,% 0.05 Tween 20, pH 7.4) ile yıkayın zar üç kez.
- HRP-konjuge sekonder ant ile membran inkübeoda sıcaklığında 1 saat için 10,000 seyreltmede bir 1: ibody.
- 5 dk aralıklarla TBS-T ile yıkayın membran üç kez.
- Bir kimyasal ışıldama tespit sistemi ile proteinin görsel ve otoradyografi filmine maruz membran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda tarif edilen prosedürler sırasında EMT alternatif eklemeler tespit etmek için güçlü bir yöntem sağlar. Twist kaynaklı EMT sırasında CD44 ekleme izoformu anahtarlama Temsilcisi sonuçları bir örnek olarak aşağıda verilmiştir.
HMLE / Büküm-ER hücrelerinde Bükülme kaynaklı EMT uzatılmış bir fibroblastik fenotipe epitel fenotip gibi çakıl taşı bir geçiş (Şekil 2A), epitelyal işaretleri E-kadherin, γ-katenin ve occludin ve yokluğu ile karakterize edilir mezenkimal belirteçler, fibronektin, N-kadherin, ve vimentin (Şekil 2B) üst ayarlanması. Ayrıca, EMT, hücre-hücre birleşme (Şekil 2C) E-kadherin lokalizasyon kaybı ile değerlendirildi.
EMT sırasında CD44 bağlayıcı izoform ifadesi açık QRT-PCR ile bağışıklık-beneklemesi ile incelenmiştir. İnsan CD44 gen dokuz değişken eksondan oluşmaktadır. CD44 pro alternatif birleştirme hücreleri sağlaren az bir değişken ekson ve tüm değişken ekson yoksun olan CD44 ile standart (CD44'ün) gibi CD44 ile üretirler bu varyantlar (CD44v). Şekil 3A ise, çeşitli CD44-izoform bağlantı saptanması için, primer tasarım stratejisini göstermektedir. Ters primer V5 ve V6 değişkeni içeren CD44v bağlantı izoformlarının saptanması için kurucu ekson 5 ve 6 arasındaki birleşme boyunca kaplarken eksonla atlanan ürün CD44s tespit edilmesi için, ileri primer, kurucu ekson 5 bulunur ekson, düz ve ters primerler sırasıyla V5 ve V6 içinde tasarlanmıştır. Diğer CD44 değişken ekson ihtiva izoform tespiti için primerler ile aynı strateji kullanılarak tasarlanabilir. Buna ek olarak, tüm CD44 transkript ileri kullanım ve kurucu ekson 2 ve ekzon 3, sırasıyla, (Şekil 3A) bulunur ters primerleri tespit edilir. Şekil 3B'de gösterildiği gibi, QRT-PCR, bu primer setleri kullanılarak CD önemli bir azalmaya işaret etmiştir44v, mRNA ve Bükülme-ER-eksprese eden hücrelerde HMLE TAM 14 günlük muameleden sonra CD44'ün mRNA artış. Buna karşılık, CD44 toplam transkript EMT (Şekil 3C) esnasında değişmeden aynı kalmıştır. CD44'ün proteinin ekspresyonu büyük ölçüde (Şekil 3B) yukarı regüle edilmiştir, oysa QRT-PCR sonuçları ile uyumlu olarak, CD44v protein düzeyi belirgin bir şekilde azalmıştır. Bu nedenle, CD44 büyük izoformu EMT işlemi sırasında CD44s için CD44v kaymıştır.
Şekil 1. Primer tasarımı. Eksonla atlama modelinde birleştirme izoformlarının belirlenmesine yönelik primerler konumunu gösteren şematik diyagramlardır. Gri kutular turuncu kutular değişken eksonları temsil, kurucu eksonları temsil ve kutuları bağlayan ince çizgiler intronlan göstermektedir. Astar yerleri vardır ölçümüneoklarla ed: siyah oklar toplam mRNA tespiti için primer setleri gösterir, turuncu oklar ekson-dahil izoformlarını büyütülmesi için primer setleri gösterir ve mavi oklar ekson atlaması izoformlarını tespit için primer setleri gösterir.
EMT 2. indüksiyon Şekil. (A) Faz kontrast görüntüleri (10X) önce (işlenmemiş) HMLE / Büküm-ER hücrelerde morfolojik değişiklikler gösteren ve TAM tedavi 14 gün sonra. (B) İmmünoblot önce HMLE / Twist ER hücrelerinde EMT belirteçlerin analizi (işlenmemiş) ve TAM tedavi 14 gün sonra. TAM tedavisi azalma olmamıştır epitel belirteçleri E-kaderin, γ-katenin ve occludin ve mezenkimal belirteçler fibronektin, N-kaderin ve vimentin üzerine regüle edildi. (C) Bağışıklık floresan görüntüleri (63X) E-kaderin kaybı gösterenTAM 14 günlük muameleden sonra hücre-hücre kavşaklarda lokalizasyonu. Yeşil boyama E-kaderin gösterir ve DAPI boyama (mavi) çekirdekleri gösterir. Ölçek çubuğu = 10 mikron. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
EMT sırasında CD44 ekleme izoformlannın Şekil 3. Anahtarı. (A), CD44-izoform ekleme tespiti için geliştirilmiş primer tasarımı. Gri kutular turuncu kutular değişken eksonları temsil, kurucu eksonları temsil ve kutuları bağlayan ince çizgiler intronlan göstermektedir. Astar konumları oklarla gösterilmiştir: Siyah oklar, CD44 ile, mRNA'nın bulgulanması için, primer kümeleri gösterir, turuncu ok CD44v5-6 yükseltmek için primer setleri gösterir ve mavi oklar için primer setleri göstermektedirCD44'ün saptanması. (B, C) özel olarak bir değişken CD44v ekzon V5 ve V6 (V5 / 6) ve CD44'ün (B) ve CD44, mRNA'nın tespit EMT içeren primerler kullanarak sırasında CD44-izoform seviyelerinin QRT-PCR analizi (C) . Gün mRNA göreli ekspresyon seviyeleri hücre 14 TAM 0 hücreleri tedavi güne karşılık gelen ve muamele edilmemiş gruplar için normalize edildi. Hata çubukları, SEM göstermektedir; n = HMLE / Bükülme-ER hücrelerinde TAM kaynaklı EMT sırasında CD44-izoform 3 (D) Bağışıklık beneklenme analizi. E-kaderin ve N-kaderin Seviyeleri EMT durumunu belirlemek için izlenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif edilen prosedür, bir uyarılabilir EMT modelinde alternatif bağlantısının belirlenmesini sağlar. Bağlantı izoform ekspresyon örneğin dinamik değişiklik EMT zaman süreci boyunca yakalanabilir gibi. Un-bağlı hücre hatlarının farklı genetik temel gereksiz alternatif eklemeler etkileyebilir, çünkü bu yöntem alternatif splicing karşılaştırılması için farklı epithelial- da mezenkimal-temsil eden hücre çizgilerinin kullanımı üzerinde avantajlara sahiptir. Ancak, EMT başarılı indüksiyon dikkatle alternatif ekleme değişikliklere herhangi bir sonuca varmadan önce çeşitli EMT belirteçler çizilebilir kullanılarak teyit edilmesi gerekir. Bundan başka, burada açıklanan Bükülme-ER-indüklenebilir EMT sistemine ek olarak, böyle bir salyangoz-ER veya TGFβ tarafından oluşturulanlar gibi diğer sistemler EMT deneysel bulguları 11,30 doğrulanması için tavsiye edilir.
EMT sırasında bağlantı izoform sviçleme hem RNA ve protein seviyelerinde tespit edilebilir. Splice isobir şekilde-spesifik antikorlar, protein analizi için tercih edilir. Izoform özgü antikorlar olarak mevcut olmadığında, ek izoform protein düzeyleri bağışıklık-beneklemesi ile SDS-PAGE üzerinde molekül ağırlığına dayalı olarak belirlenebilir. Her izoformun RNA düzeyi izoformu-özel tetikleyiciler kullanılarak tayin edilebilir. QRT-PCR analizlerini kullanarak, her bir izoform kat değişiklik hassas ve kesin olarak belirlenebilir. Deney malzemeleri, klinik örneklerde belirli bir ek yeri izoform ekspresyonunu analiz etmek, kısıtlı olduğu durumlarda, özellikle, QRT-PCR analizi, immünohistokimya için izoformu özgü antikorların eksikliğini telafi edecek bir nicel ölçü sağlar.
Burada belirtilen yöntem, EMT sırasında bilinen bağlantı izoformunun değişikliklerin saptanması için uygundur. Buna ek olarak, bu yöntem, genom alternatif splicing çalışma ve EMT sırasında yeni uç uca eklenen izoform anahtarlama tanımlanması için genişletilebilir. Bunu gerçekleştirmek için,RNA derin ayırma veya yapıştırma hassas mikrodizi platformları gibi büyük ölçekli teknik, kullanımı, yukarıda tarif edilen, indüklenebilir EMT modeli izole RNA'lar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, izoformu değişikliklerin Mah-PCR doğrulama büyük ölçekli herhangi bir analiz takip gereklidir.
Sonuç olarak, bir alternatif birleştirme, dinamik EMT, embriyo gelişimi ve tümör metastazı için kritiktir bir işlemi sırasında kontrol edilir. Insan genomundaki alternatif birleştirmenin yüksek frekans göz önüne alındığında, bu alternatif splicing düzenlenmesi, hücre farklılaşması, doku gelişimi, ve de programlanmış hücre ölümü 35-41 de dahil olmak üzere diğer biyolojik ve patolojik süreçlerde önemli bir rol oynar olasıdır. Izoformlan bağlantı saptanması için bu tarifnamede tarif edilen protokol de bu sistemler için de geçerli olacaktır.
Böyle yapıştırma muhabiri minigen tahlilleri gibi ek deneysel yöntemleri, b yapabilirsinizE bölümü bundan başka sis-etkimeli elemanları ve alternatif bağlantı kontrol 30,42,43, trans-etkiyen faktörler düzenleyici mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca, EMT boyunca belirli bir ek yeri izoformunun işlevsel rolü susturma veya ektopik ifade belirli izoformunu ve tarif edilen EMT indüklenebilir sistem 11 EMT indüksiyon izlenerek araştırılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 μM. Keep the solution at -20 °C protected from light. |
| E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit | Omega Bio-Tek | R6731 | Total RNA isolation kit |
| GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5001 | Reagent for qRT-PCR assay |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6002 | Reagent for qRT-PCR assay |
| LightCycler 480 Real-Time PCR System | Roche | Equipment for qRT-PCR assay | |
| CD44 antibody | R&D Systems | BBA10 | 1:1,000 dilution |
| E-cadherin antibody | Cell Signaling Technology | 4065 | 1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence |
| γ-Catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2309 | 1:1,000 dilution |
| Occludin antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-5562 | 1:500 dilution |
| Fibronectin antibody | BD Transduction Laboratories | 610077 | 1:5,000 dilution |
| N-cadherin antibody | BD Transduction Laboratories | 610920 | 1:2,000 dilution |
| Vimentin antibody | NeoMarkers | MS-129-p1 | 1:500 dilution |
| GAPDH antibody | Millipore Corporation | MAB374 | 1:10,000 dilution |
| Amasham ECL Western blotting detection reagent | GE Health Life Science | RPN2209 | Chemiluminescence system |
References
- Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
- Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 14, 818-829 (2008).
- Yang, J., et al. a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 117, 927-939 (2004).
- Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).
- Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).
- Comijn, J., et al. The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion. Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).
- Bolos, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).
- Eger, A., et al. DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells. Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).
- Shapiro, I. M., et al. An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype. PLoS Genet. 7, e1002218 (2011).
- Warzecha, C. C., et al. An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition. EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).
- Brown, R. L., et al. CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression. J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
- Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).
- Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene. Cell. 47, 277-284 (1986).
- Krangel, M. S. Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway. J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).
- Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse. Nature. 306, 756-760 (1983).
- Barbaux, S., et al. Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome. Nat Genet. 17, 467-470 (1997).
- Charlet, B. N., et al. Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol Cell. 10, 45-53 (2002).
- Hutton, M., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature. 393, 702-705 (1998).
- Kohsaka, T., et al. Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome. Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).
- Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy. Science. 280, 737-741 (1998).
- Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet. 29, 40-47 (2001).
- Spillantini, M. G., et al. Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).
- Wang, J., et al. Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation. Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).
- Graubert, T. A., et al. Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 44, 53-57 (2012).
- Papaemmanuil, E., et al. Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts. N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).
- Yoshida, K., et al. Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia. Nature. 478, 64-69 (2011).
- Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, 704-715 (2008).
- Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition. J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).
- Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).
- Zavadil, J., Bottinger, E. P. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions. Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).
- Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biol. 8, R19 (2007).
- Boutz, P. L., et al. A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons. Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).
- Salomonis, N., et al. Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).
- Calarco, J. A., et al. Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein. Cell. 138, 898-910 (2009).
- Grabowski, P. Alternative splicing takes shape during neuronal development. Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).
- Seol, D. W., Billiar, T. R. A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis. J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).
- Srinivasula, S. M., et al. Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis. Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications. Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).
- Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37, 331-340 (2005).
- Cheng, C., Sharp, P. A. Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion. Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).
