Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الكشف عن البديل خلال الربط طلائي-الوسيطة الانتقالية

Published: October 9, 2014 doi: 10.3791/51845
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine
* These authors contributed equally

Introduction

الانتقال طلائي الوسيطة (EMT) هو برنامج التنموي الذي يدفع التشكل الجهاز وإعادة عرض الأنسجة أثناء مرحلة التطور الجنيني. عند تفعيلها بشكل غير طبيعي، EMT تعزز الانبثاث ورم وتليف الجهاز 1،2. وقد وصفت دراسات مقنعة على أهمية تنظيم النسخي خلال عملية EMT، التي تحددها عدة عوامل النسخ، مثل تويست، الحلزون، وZEB، الذي قمع التعبير عن الملتصقة بروتين تقاطع E-كادهيرين، مما أدى إلى فقدان cobble- حجر مثل مورفولوجيا الظهارية ومكاسب على شكل مغزل الوسيطة النمط الظاهري 3-8. وكشفت الدراسات الحديثة عن طريق تحليل الجينوم على نطاق من الرنا أن هناك مجموعة من الجينات التي ترتبط إما الظهارية أو الوسيطة الظواهر 9،10 أنماط الربط. العمل من مختبرنا توصيل ظيفيا الربط البديلة وEMT. من خلال دراسة سطح الخلية جزيء التصاق CD44، أثبتنا أن CD44 alternوينظم سالبة الربط بإحكام أثناء EMT، والأهم من ذلك، أن شكل الإسوي CD44 لصق التحول سببيا يسهم في EMT 11.

ويمثل الربط البديلة نموذج على نطاق واسع والحفظ من تنظيم الجينات، ما يصل إلى 95٪ من الجينات متعددة اكسون الإنسان وتقسم بدلا من 12-14. عن طريق توليد منتجات البروتين متعددة من جين واحد، يشكل الربط البديلة آلية أساسية للتنوع البروتين، مضيفا طبقة أخرى من التعقيد إلى الجينوم البشري. على هذا النحو، يمكن ديسريغولاتيون من الربط بديل يحتمل أن يؤدي إلى تأثيرات بيولوجية عميقة تسبب الأمراض التي تصيب الإنسان. في الواقع، وقد تم توثيق الربط البديلة الشاذة في أمراض لأكثر من عقد 15-25، بما في ذلك النتائج الأخيرة أن الطفرات في الجينات التي تشفر الآلات جسيم التضفير توجد عادة في متلازمات خلل التنسج النقوي 26-28. لذلك، وتطوير طرق موثوقة للكشف عن ط تقسم بدلا من ذلكsoforms هو من أهمية كبيرة في دراسة العمليات البيولوجية المختلفة بما في ذلك EMT.

هنا نقدم بروتوكول للكشف عن تغيرات في الربط البديلة باستخدام نموذج EMT محرض. أساليب لتصميم الاشعال PCR وكشف الإسوية لصق هي مناسبة ليس فقط لدراسة الربط البديلة خلال EMT، ولكن أيضا لدراسة الربط البديلة في العمليات البيولوجية الأخرى. التحقيق الربط البديلة خلال EMT الضروري من أجل فهم أفضل للآليات EMT وورم خبيث، مما يسهل وضع استراتيجيات فعالة لعلاج ورم خبيث السرطان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الثقافة خلية من EMT التعريفي

ملاحظة: EMT يمكن الناجم عن علاج TGFβ أو التعبير خارج الرحم من عوامل النسخ تويست، الحلزون، أو Zeb1 / 2 في الخلايا الظهارية. الموصوفة في هذا البروتوكول هو نظام EMT محرض عبر التعبير عن تويست-ER انصهار بروتين في الخلايا الثديية البشرية خلد الظهارية (HMLE / تويست-ER، هدية من الدكتور J يانغ، جامعة كاليفورنيا سان دييغو) 9،11،29. على 4 hydroxytamoxifen (TAM) العلاج، وانصهار بروتين تويست-ER translocates إلى النواة لدفع النسخ والنتائج في الانتقال EMT الكامل في 12-14 أيام 9،11،29. أنظمة محرض EMT إضافية، مثل HMLE / الحلزون-ER، HMLE / TGFβ، وMCF10A / TGFβ، يمكن العثور عليها في منشوراتنا السابقة 11،30.

  1. الحفاظ على خلايا HMLE / تويست-ER في المصل خالية المتوسطة الثديية نمو الخلايا الظهارية (MEGM) في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. مرور الخلايا كل 2-3 أيام عندما تصل إلى 80٪ التقاء. احتضان الخلايا مع التربسين 0.15٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق، ثم تعطيل التربسين مع 5٪ مصل العجل / DMEM. تدور باستمرار خلايا و resuspend لهم في MEGM. لوحة خلايا في طبق زراعة الأنسجة جديد في نسبة 1-4.
  2. حل TAM في الإيثانول لجعل حل 200 ميكرومتر. حماية TAM عن الضوء وتخزينها في -20 درجة مئوية. قبل الاستخدام، حديثا إضافة إلى TAM MEGM سائل الاعلام في 1: 10،000 تخفيف لجعل تركيز النهائي من 20 نانومتر TAM.
  3. لتحريض EMT، لوحة خلايا 1.6 × 10 6 HMLE / تويست-ER في طبق زراعة الأنسجة 10 سم من نسختين. خلايا الثقافة مع وسائل الإعلام 20 نانومتر TAM التي تحتوي على MEGM.
  4. لوحة الخلايا 1.6 × 10 6 HMLE / تويست-ER في طبق 10 سم من نسختين وعلاج الخلايا مع 0.01٪ من الإيثانول كعنصر تحكم غير TAM-المعاملة.
  5. بعد يومين من الحضانة، والتقاط صور تحت المجهر الضوء في 10X التكبير لتسجيل التغيرات المورفولوجية من الخلايا.
  6. نضح المتوسطة من طبق واحد التحكم أو TAM المعاملةالخلايا. غسل الخلايا مع PBS الباردة، وخلايا الحصاد بالغاء نصف لوحة في RNA تحلل العازلة لعزل الحمض النووي الريبي، والنصف الآخر في المخزن المعهد الملكي للتحليل البروتين.
  7. خلايا المرور من السيطرة أو أطباق TAM المعاملة على أيدي إعادة الطلاء 1.6 × 10 6 خلايا في طبق 10 سم من نسختين. علاج مستمر الخلايا مع 20 نانومتر TAM أو مركبة.
  8. كرر الخطوات من 5 إلى 7 مرة واحدة كل يوم حتى يوم 14، في الوقت الذي تظهر خلايا تويست-ER TAM المعاملة والوسيطة التشكل على شكل مغزل، في حين أن الخلايا السيطرة المعالجة السيارة تحافظ على مورفولوجيا الظهارية مثل الحصوه.

2. توصيف EMT

ملاحظة: يشار إلى الانتهاء من EMT من (1) خلية تغيرات شكلية من التشكل مثل الحصوه الظهارية إلى مثل الأرومة الليفية ظهور المغزل على شكل؛ (2) فقدان التعريب E-كادهيرين في تقاطعات خلية خلية. و (3) التعبير تحولت من علامات EMT، الذي يعرف عن فقدانمن علامات الظهارية وكسب علامات الوسيطة.

يتم التقاط الخلايا تغيرات شكلية بواسطة المجهر الضوئي في 10X التكبير أثناء وقت EMT الاستقراء، وصفها في القسم 1. كشف المناعي ومضان من E-كادهيرين في الخلايا تقاطعات الموضح في هذا القسم. يتم الكشف عن التعبير عن علامات EMT بواسطة immunoblotting. علامات الظهارية شيوعا هي E-كادهيرين، γ-catenin، وoccludin، وتشمل علامات الوسيطة فبرونيكتين، N-كادهيرين وvimentin. ووصف الإجراءات العامة للimmunoblotting في القسم 4.

  1. في اليوم 12 من العلاج TAM، البذور 1 × 10 5 الخلايا على كوب 12 ملم ساترة دائرية توضع في بئر من 24 لوحة جيدا.
  2. 48 ساعة بعد زرع الخلايا والمتوسطة نضح ويغسل مع برنامج تلفزيوني قبل تحسنت.
  3. إصلاح الخلايا مع قبل تحسنت بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 15 دقيقة.
  4. غسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  5. احتضان الخلايا مع 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 15دقيقة في RT.
  6. غسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  7. احتضان الخلايا في 5٪ BSA / برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة على RT لمنع غير محددة وملزمة.
  8. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية E-كادهيرين في 1:50 التخفيف في 1٪ BSA / PBS في غرفة يا مرطب / N عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: النطاق لتخفيف الأجسام المضادة الأولية عادة بين 01:50 و 1: 200، وينبغي تحديد التخفيف الأمثل لكل الأجسام المضادة تجريبيا.
  9. صب الأجسام المضادة الأولية ويغسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  10. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية فلوري المسمى في 1: 500 التخفيف لمدة 1 ساعة على RT. من هذه الخطوة على، وحماية الخلايا من الضوء.
  11. صب الضد الثانوية ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  12. خلايا صمة عار مع 0.1-1 جم / مل دابي أو هويشت لمدة 10 دقيقة.
  13. شطف الخلايا مع PBS ثلاث مرات.
  14. جبل coverslips مع قطرة من تصاعد المتوسطة، وcoverslips ختم بطلاء الأظافر.
  15. مراقبة الخلايا واتخاذصور تحت المجهر الفلورسنت 63X.

تلطيخ مع الأجسام المضادة إضافية يمكن القيام بها لتأكيد النمط الظاهري EMT. على سبيل المثال، N-كادهيرين والأكتين العضلات α السلس يمكن ملطخة ل29،31،32 الوسيطة النمط الظاهري. إعادة تنظيم هيكل هيكل الخلية يمكن رصدها من خلال تلطيخ الخلايا مع phalloidin لأكتين F-11. بالإضافة إلى ذلك، المقايسات لحركية الخلية ومقاومة خلايا الموت لا يمكن أن يؤديها لدراسة خصائص EMT 11.

3. الكشف عن طريق لصق الأشكال الإسوية QRT-PCR فحوصات

  1. التصميم التمهيدي
    ملاحظة: أزواج التمهيدي يجب أن تصمم بعناية لتضخيم الإسوية لصق متميزة. اكسون تخطي، الحدث الربط البديلة لوحظ الأكثر شيوعا، ويظهر هنا كمثال لتوضيح استراتيجية التصميم التمهيدي. يصور الشكل 1A أربعة اكسون مسبقا مرنا، مع اكسون الثالث باعتباره اكسون متغير. إدراج اكسون 3 نتيجة فيإنتاج ولصق شكل الإسوي أطول، في حين تخطي من اكسون 3 يولد أقصر لصق شكل الإسوي. الاشعال تحتاج إلى أن تكون مصممة لتمييز شكل الإسوي شملت اكسون-3-واكسون 3 تخطي شكل الإسوي، واكتشاف نص شامل لهذه مرنا.
    1. للكشف عن اكسون إدراج، تصميم بعناية التمهيدي إلى الأمام داخل اكسون متغير 3، والتمهيدي العكسي داخل اكسون التأسيسي قريب 4، والسماح لالتضخيم محددة من تضمين اكسون شكل الإسوي متغير. تأكد من عدم تصميم كل من الأمام وعكس الاشعال داخل نفس اكسون متغير من أجل تجنب المنتجات PCR تضخيمها من الحمض النووي الجيني أو ما قبل مرنا.
    2. لتضخيم تحديدا اكسون تخطي الأحداث، تصميم واحد من الاشعال تمتد تقاطع اكسون التأسيسي 2 و 4 اكسون التي لولاها يتم تدميرها عندما يتم تضمين اكسون متغير 3. تصميم التمهيدي آخر داخل اكسون التأسيسي 4. على هذا النحو، يتم إنشاء منتجات PCR فقط عندما يكون اكسون متغير 3 هو excludإد والتأسيسي وانضم اكسون 2 و 4 لاحقا اكسون معا.
    3. للكشف عن مجموع النصوص من الجين، وتصميم الاشعال في غضون سنتين الإكسونات التأسيسية 1 و 2. وهكذا، وتتضخم المنتجات PCR من جميع الأشكال الإسوية.
    4. تأكد من أن درجة حرارة انصهار (TM) لجميع الاشعال حوالي 55 ° C، وطول كل التمهيدي هو حوالي 18-22 النيوكليوتيدات، وحجم المنتجات PCR ما بين 80 و 150 زوج قاعدي.
  2. استخراج الحمض النووي الريبي: استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام إجمالي عدة عزل الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
    1. جمع الخلايا في 350 ميكرولتر عازلة RNA تحلل.
    2. إضافة 350 ميكرولتر من الايثانول 70٪ إلى المحللة وتخلط جيدا.
    3. نقل العينة إلى العمود تنقية الحمض النووي الريبي.
    4. الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 1 دقيقة وتجاهل التدفق من خلال.
    5. غسل العمود مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من غسل RNA عازلة الأول ومرتين مع RNA غسل عازلة الثاني.
    6. إزالة المتبقي غسل العازلة RNAالثاني من العمود بواسطة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 2 دقيقة.
    7. نقل عمود جديد في أنبوب 1.5 مل، وإضافة 50 ميكرولتر nuclease خالية من المياه في وسط مصفوفة العمود وأزل RNA بواسطة الطرد المركزي في أقصى سرعة.
  3. توليف [كدنا الأولى حبلا
    1. تحديد تركيز ونوعية RNA بواسطة قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية. ملاحظة: يجب أن يكون جيد RNA نوعية في 260 نانومتر / 280 نانومتر نسبة امتصاص حوالي 2.0.
    2. انشاء الناسخ العكسي (RT) ردود الفعل التي تحتوي على 250 نانوغرام RNA الكلي، 0.05 ميكروغرام الاشعال مسدوس العشوائي، 50 بمول MgCl 2، 10 بمول dNTP، 2 ميكرولتر 5 × GoScript العازلة، و1 ميكرولتر RT انزيم في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر.
    3. إجراء التفاعلات RT في 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، تليها الحضانة عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإبطال نشاط إنزيم RT.
  4. في الوقت الحقيقي PCR
    1. انشاء 20 ميكرولتر ردود الفعل التي تتكون من 10 ميكرولتر مزيج الرئيسي SYBR الأخضر،0،1-1،0 قالب [كدنا] ميكرولتر و 5 بمول إلى الأمام وعكس الاشعال.
    2. تشغيل في الوقت الحقيقي PCR مع 40 دورة من الخطوات التالية: 95 ° C تمسخ لمدة 10 ثانية، 58 ° C الصلب لمدة 10 ثانية، و 60 درجة مئوية تمديد لمدة 30 ثانية. إجراء التفاعلات PCR في ثلاث نسخ.
    3. تحقق منحنيات التفكك وتأكد من أن ذروة واحدة لوحظ لكل مجموعة التمهيدي.
    4. الحصول على القيم دورة الكمي (الكلوروكوين) عن طريق حساب القيم المشتقة الثانية من منحنيات التضخيم.
    5. حساب كمية النسبية (RQ) من المستهدف في عينات من mRNAs يسببها بالمقارنة مع عينة uninduced باستخدام "دلتا دلتا الكلوروكوين (ΔΔCq)" الطريقة كما هو موضح بالمعادلة التالية. استخدام الجينات التدبير المنزلي، مثل GAPDH أو TBP، كمرجع.

المعادلة 1
لحساب أكثر دقة القيم النسبية من الأشكال الإسوية لصق، رانه استخدام الجينات مرجعية متعددة ينبغي النظر فيها. نتائج يمكن تحليلها باستخدام طريقة القيمة المطلقة الكمي تعديل صفها Pfaffl آخرون 33،34.

4. فحص لصق الأشكال الإسوية على مستوى البروتين

  1. جمع الخلايا في 100 ميكرولتر عازلة RIPA الجليد الباردة.
  2. تعيين لست] على الجليد لمدة حوالي 10 دقيقة.
  3. الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، وجمع طاف.
  4. قياس تركيز البروتين عن طريق فحوصات برادفورد.
  5. تمييع عينات البروتين في SDS العازلة تحميل وتحميل 20-40 ميكروغرام من البروتينات إلى 10٪ الهلام SDS-PAGE.
  6. تشغيل المواد الهلامية SDS-PAGE عند 20 أمبير مقابل 1.5 ساعة.
  7. نقل البروتينات إلى غشاء PVDF في نظام نقل الرطب في 4 درجة مئوية لمدة 3 ساعة في 85 V. ضبط الوقت نقل وفقا للوزن الجزيئي للبروتينات الهدف.
  8. غشاء كتلة في 5٪ الحليب الخالي من الدسم لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة على RT.
  9. احتضان واي الغشاء[ث على الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات CO / N. النطاق لتخفيف الأجسام المضادة الأولية عادة بين 1: 200 و 1: 5،000، تحديد التخفيف الأمثل لكل الأجسام المضادة تجريبيا. التخفيف من الأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول يمكن العثور عليها في "جدول الكواشف ومعدات معينة".
    1. للكشف عن الأشكال الإسوية لصق، استخدام الأجسام المضادة المحددة التي تعترف شكل الإسوي معين. بدلا من ذلك، استخدام الأجسام المضادة التي تعترف حاتمة في المنطقة التأسيسية الترميز اكسون وكشف الإسوية لصق في وقت واحد على أساس أحجام البروتين المختلفة.
    2. في نفس الوقت، من خلال مراقبة EMT immunoblotting لعلامات EMT. استخدام E-كادهيرين، γ-catenin، وoccludin كعلامات الظهارية، وفبرونيكتين، N-كادهيرين وvimentin كعلامات الوسيطة.
  10. يغسل الغشاء ثلاث مرات مع TBS-T (50 ملي تريس، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.05٪ توين 20، ودرجة الحموضة 7.4) في فترة 5 دقيقة.
  11. احتضان الغشاء مع نملة الثانوي HRP-مترافقibody في 1: 10،000 تخفيف مدة 1 ساعة على RT.
  12. يغسل الغشاء ثلاث مرات مع TBS-T في فاصل 5 دقيقة.
  13. تصور البروتين مع نظام الكشف عن معان كيميائي وفضح غشاء لفيلم تصوير الإشعاع الذاتي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الإجراءات المذكورة أعلاه توفر وسيلة قوية للكشف عن الربط البديلة خلال EMT. وتعطى نتائج ممثلة من CD44 لصق شكل الإسوي التبديل خلال الناجم تويست EMT أدناه كمثال.

تميزت EMT الناجم عن تطور في الخلايا HMLE / تويست-ER من الانتقال من رصف حجر مثل النمط الظاهري الظهارية إلى النمط الظاهري أرومي ليفي ممدود (الشكل 2A)، وغياب علامات الظهارية E-كادهيرين، γ-catenin وoccludin و upregulation من علامات الوسيطة فبرونيكتين، N-كادهيرين، وvimentin (الشكل 2B). وعلاوة على ذلك، تم تقييم EMT عن فقدان E-كادهيرين التعريب في تقاطعات خلية خلية (الشكل 2C).

تم فحص التعبير تحولت من CD44 الإسوية لصق خلال EMT بواسطة QRT-PCR وimmunoblotting. ويتكون الجين البشري CD44 تسعة الإكسونات المتغيرة. الربط بديل للCD44 يسمح للخلايا الموالية لالمتغيرات ديوس CD44 (CD44v) التي تشمل اكسون متغير واحد على الأقل، ومعيار CD44 (CD44s) أن يخلو من كل الإكسونات المتغيرة. يصور الشكل 3A استراتيجية التصميم التمهيدي للكشف عن مختلف الأشكال الإسوية لصق CD44. للكشف عن CD44s منتج اكسون تخطي، ويقع التمهيدي إلى الأمام في اكسون التأسيسي 5، في حين يمتد التمهيدي العكسي عبر تقاطع بين الإكسونات التأسيسية 5 و6. للكشف عن CD44v الإسوية لصق تحتوي على V5 و V6 متغير تم تصميم الإكسونات، وإلى الأمام وعكس الاشعال داخل V5 وV6، على التوالي. الاشعال للكشف عن الأخرى CD44 الإسوية التي تحتوي على اكسون متغير يمكن تصميمها باستخدام نفس الاستراتيجية. بالإضافة إلى ذلك، تم الكشف عن نسخة إجمالي CD44 باستخدام الأمام والاشعال تقع في التأسيسي اكسون 2 واكسون 3، على التوالي (الشكل 3A) عكس. كما هو مبين في الشكل 3B، QRT-PCR التحليلات باستخدام هذه المجموعات التمهيدي أشارت إلى حدوث انخفاض كبير في CD44V مرنا وزيادة في CD44s مرنا بعد 14 يوما من العلاج TAM في الخلايا HMLE التعبير تويست-ER. على النقيض من ذلك، ظل النص الكلي للCD44 دون تغيير خلال EMT (الشكل 3C). تتفق مع نتائج QRT-PCR، ومستوى البروتين من CD44v انخفض بشكل ملحوظ، في حين أن التعبير عن بروتين CD44s كان upregulated كثيرا (الشكل 3D). ولذلك، كان تحول شكل الإسوي كبير من CD44 من CD44v إلى CD44s أثناء عملية EMT.

الشكل 1
تصميم الشكل 1. التمهيدي. المخططات تخطيطي يوضح موقع الاشعال للكشف عن الأشكال الإسوية الربط في نموذج تخطي اكسون. وتمثل المربعات الرمادية الإكسونات التأسيسية، تمثل صناديق البرتقال الإكسونات متغيرة، وخطوط رقيقة صناديق ربط دلالة الإنترونات. المواقع التمهيدي هي indicatإد من السهام: تشير السهام السوداء مجموعات التمهيدي للكشف عن مجموع مرنا، الأسهم البرتقالية تشير مجموعات التمهيدي لتضخيم الإسوية تضمين اكسون، وتشير الأسهم الزرقاء مجموعات التمهيدي للكشف عن الأشكال الإسوية-تخطي اكسون.

الشكل 2
2. الرقم التعريفي للEMT. (A) وصور المرحلة النقيض (10X) توضح تغيرات شكلية في الخلايا HMLE / تويست-ER قبل (غير المعالجة) وبعد 14 يوما من العلاج TAM. (B) تحليل طخة مناعية من علامات EMT في الخلايا HMLE / تويست-ER قبل (غير المعالجة) وبعد 14 يوما من العلاج TAM. على TAM العلاج، علامات الظهارية-E كادهيرين، γ-catenin، وoccludin تم downregulated، والوسيطة علامات فبرونيكتين، N-كادهيرين، وvimentin تم upregulated. (C) الصور مضان المناعية (63X) تشير إلى فقدان E-كادهيرينالتعريب في تقاطعات خلية خلية بعد 14 يوما من العلاج TAM. تلطيخ الأخضر يشير E-كادهيرين، وتلطيخ دابي (الأزرق) إلى نوى. شريط النطاق = 10 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. التبديل من الأشكال الإسوية لصق CD44 خلال EMT. (A) تصميم التمهيدي للكشف عن الأشكال الإسوية لصق CD44. وتمثل المربعات الرمادية الإكسونات التأسيسية، تمثل صناديق البرتقال الإكسونات متغيرة، وخطوط رقيقة صناديق ربط دلالة الإنترونات. يشار إلى المواقع التمهيدي من السهام: تشير السهام السوداء مجموعات التمهيدي للكشف عن CD44 إجمالي مرنا، الأسهم البرتقالية تشير مجموعات التمهيدي لتضخيم CD44v5-6، وتشير الأسهم الزرقاء مجموعات التمهيدي لكشف CD44s. (B، C) تحليل QRT-PCR لمستويات الإسوية CD44 خلال EMT باستخدام بادئات التي تكشف على وجه التحديد CD44v تحتوي الإكسونات V5 المتغيرة وV6 (V5 / 6) وCD44s (B)، وCD44 مرنا الكلي (C) . مستويات التعبير النسبية للمرنا في يوم 14 تم تطبيع الخلايا ليوم المقابلة 0 الخلايا في TAM تعامل والجماعات غير المعالجة. أشرطة الخطأ تشير SEM. ن = 3. (D) تحليل طخة مناعية من الأشكال الإسوية CD44 خلال EMT TAM التي يسببها في خلايا HMLE / تويست-ER. تم رصد مستويات E-كادهيرين وN-كادهيرين لتحديد الوضع EMT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الإجراء الموضح هنا يمكن الكشف عن الربط البديلة في نموذج EMT محرض. على هذا النحو، التغيرات الديناميكية للصق شكل الإسوي التعبير يمكن التقاط طوال الوقت من EMT. هذا الأسلوب له مزايا على استخدام epithelial- مختلفة أو خطوط الخلايا التي تمثل الوسيطة للمقارنة بين الربط البديلة لخلفيات وراثية مختلفة عن خطوط الخلايا ذات الصلة للأمم المتحدة يمكن أن تؤثر على نحو غير ملائم الربط البديلة. ومع ذلك، فإن الحث الناجح لEMT يجب أكدت بعناية باستخدام مختلف علامات EMT قبل أي استنتاجات بشأن التغييرات في الربط البديلة التي يمكن استخلاصها. وعلاوة على ذلك، بالإضافة إلى نظام EMT تويست ER-محرض وصفها هنا، ينصح EMT أنظمة أخرى مثل تلك الناجمة عن الحلزون-ER أو TGFβ للتأكد من صحة النتائج التجريبية 11،30.

ويمكن الكشف عن التحول من الأشكال الإسوية لصق خلال EMT في كل مستويات RNA والبروتين. لصق ISOويفضل تكوين أجسام مضادة محددة لتحليل البروتين. عندما الأجسام المضادة شكل الإسوي محددة ليست متوفرة، يمكن تحديد مستويات البروتين من الأشكال الإسوية لصق على أساس الوزن الجزيئي على SDS-PAGE بواسطة immunoblotting. يمكن قياس مستوى RNA من كل شكل الإسوي من قبل الاشعال شكل الإسوي محددة. استخدام المقايسات QRT-PCR، التغيير أضعاف من كل شكل الإسوي يمكن تحديد بحساسية ودقة. على وجه الخصوص، عندما المواد التجريبية محدودة، مثل تحليل تعبير عن شكل الإسوي لصق معين في العينات السريرية، يتيح تحليل QRT-PCR مقياس كمي التي من شأنها أن تعوض عن عدم وجود الأجسام المضادة شكل الإسوي محددة لالمناعية.

الطريقة المذكورة هنا هي مناسبة للكشف عن التغييرات لصق شكل الإسوي المعروف خلال EMT. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة يمكن توسيع لدراسة الجينوم على نطاق الربط البديلة وللتعرف على الرواية لصق شكل الإسوي التبديل خلال EMT. لتحقيق ذلك،استخدام تقنية على نطاق واسع، مثل RNA العميقة التسلسل أو الربط منصات ميكروأري حساسة، يمكن أن يؤديها باستخدام الرنا معزولة عن نموذج EMT محرض المذكورة أعلاه. ومع ذلك، مطلوب التحقق من صحة QRT-PCR للتغيرات شكل الإسوي التالية أي تحليل على نطاق واسع.

في الختام، وينظم الربط البديلة ديناميكيا اثناء EMT، وهي العملية التي أمر بالغ الأهمية لتحقيق التنمية الجنينية وورم خبيث. النظر في وتيرة عالية من الربط البديلة في الجينوم البشري، فمن المرجح أن تنظيم الربط البديلة تلعب دورا هاما في العديد من العمليات البيولوجية والمرضية الأخرى بما في ذلك تمايز الخلايا، وتطوير الأنسجة، وموت الخلايا المبرمجة 35-41. سوف بروتوكول الموصوفة هنا للكشف عن الأشكال الإسوية لصق تكون قابلة للتطبيق لهذه الأنظمة الأخرى كذلك.

طرائق تجريبية إضافية، مثل المقايسات مراسل الربط minigene، يمكن بالبريد تستخدم لمواصلة التحقيق في الآليات التنظيمية من العناصر المفعول رابطة الدول المستقلة والعوامل التي تعمل العابرة التي تتحكم الربط البديلة 30،42،43. وعلاوة على ذلك، فإن الدور الوظيفي للشكل الإسوي لصق خاص خلال EMT يمكن التحقيق من قبل إسكات أو ectopically معربا عن شكل الإسوي محددة ومراقبة EMT الحث في نظام EMT-محرض وصفه 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxytamoxifen Sigma H7904 Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 μM. Keep the solution at -20 °C protected from light.
E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit Omega Bio-Tek R6731 Total RNA isolation kit
GoScript Reverse Transcription System Promega A5001 Reagent for qRT-PCR assay
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6002 Reagent for qRT-PCR assay
LightCycler 480 Real-Time PCR System Roche Equipment for qRT-PCR assay
CD44 antibody R&D Systems BBA10 1:1,000 dilution
E-cadherin antibody Cell Signaling Technology 4065 1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence
γ-Catenin antibody Cell Signaling Technology 2309 1:1,000 dilution
Occludin antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-5562 1:500 dilution
Fibronectin antibody BD Transduction Laboratories 610077 1:5,000 dilution
N-cadherin antibody BD Transduction Laboratories 610920 1:2,000 dilution
Vimentin antibody NeoMarkers MS-129-p1 1:500 dilution
GAPDH antibody Millipore Corporation MAB374 1:10,000 dilution
Amasham ECL Western blotting detection reagent GE Health Life Science RPN2209 Chemiluminescence system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
  2. Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 14, 818-829 (2008).
  3. Yang, J., et al. a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 117, 927-939 (2004).
  4. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).
  5. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).
  6. Comijn, J., et al. The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion. Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).
  7. Bolos, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).
  8. Eger, A., et al. DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells. Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).
  9. Shapiro, I. M., et al. An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype. PLoS Genet. 7, e1002218 (2011).
  10. Warzecha, C. C., et al. An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition. EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).
  11. Brown, R. L., et al. CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression. J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).
  12. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  13. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  14. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).
  15. Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene. Cell. 47, 277-284 (1986).
  16. Krangel, M. S. Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway. J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).
  17. Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse. Nature. 306, 756-760 (1983).
  18. Barbaux, S., et al. Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome. Nat Genet. 17, 467-470 (1997).
  19. Charlet, B. N., et al. Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol Cell. 10, 45-53 (2002).
  20. Hutton, M., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature. 393, 702-705 (1998).
  21. Kohsaka, T., et al. Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome. Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).
  22. Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy. Science. 280, 737-741 (1998).
  23. Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet. 29, 40-47 (2001).
  24. Spillantini, M. G., et al. Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).
  25. Wang, J., et al. Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation. Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).
  26. Graubert, T. A., et al. Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 44, 53-57 (2012).
  27. Papaemmanuil, E., et al. Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts. N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).
  28. Yoshida, K., et al. Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia. Nature. 478, 64-69 (2011).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, 704-715 (2008).
  30. Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition. J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).
  31. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).
  32. Zavadil, J., Bottinger, E. P. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions. Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).
  33. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).
  34. Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biol. 8, R19 (2007).
  35. Boutz, P. L., et al. A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons. Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).
  36. Salomonis, N., et al. Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).
  37. Calarco, J. A., et al. Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein. Cell. 138, 898-910 (2009).
  38. Grabowski, P. Alternative splicing takes shape during neuronal development. Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).
  39. Seol, D. W., Billiar, T. R. A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis. J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).
  40. Srinivasula, S. M., et al. Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis. Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).
  41. Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications. Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).
  42. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37, 331-340 (2005).
  43. Cheng, C., Sharp, P. A. Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion. Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 92، الربط البديلة، EMT، RNA، والتصميم التمهيدي، في الوقت الحقيقي PCR، الإسوية لصق
الكشف عن البديل خلال الربط طلائي-الوسيطة الانتقالية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, H., Xu, Y., Cheng, C.… More

Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition. J. Vis. Exp. (92), e51845, doi:10.3791/51845 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter