Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

Published: October 9, 2014 doi: 10.3791/51845
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine
* These authors contributed equally

Introduction

מעבר אפיתל-mesenchymal (EMT) הוא תכנית התפתחותית שמניעה המורפוגנזה איבר ושיפוץ רקמות במהלך embryogenesis. כאשר מופעלים באופן חריג, EMT מקדם גרורות סרטני ואיבר סיסטיק 1,2. מחקרים משכנעים שתיארו את החשיבות של רגולציה תעתיק במהלך התהליך של EMT, שהוגדרו על ידי כמה גורמי שעתוק, כגון טוויסט, חילזון, וZeb, שמדחיקים את הביטוי של חלבון צומת E-cadherin adherens, וכתוצאה מכך האובדן של cobble- אבן כמו מורפולוגיה ורווח של פנוטיפ mesenchymal דמוי כישור 3-8 אפיתל. מחקרים שנעשה לאחרונה באמצעות ניתוח הגנום של RNAs חשפו כי קיים קבוצה של גני שחבור שדפוסים קשורים גם עם פנוטיפים אפיתל או mesenchymal 9,10. עבודה מהמעבדה שלנו מבחינה תפקודית מחוברת שחבור חלופי וEMT. על ידי לימוד CD44 מולקולת הידבקות פני תא, הראינו כי altern CD44שחבור יצירתי מוסדר בחוזקה במהלך EMT, ויותר מכך, שאיזופורם אחוי CD44 מיתוג סיבתי תורם לEMT 11.

שחבור חלופי מהווה מודל נפוץ ומשומר של ויסות הגנים, כעד 95% מהגנים רב אקסון אדם שחבור 12-14 לחלופין. על ידי יצירת מוצרי חלבון מרובים מגן יחיד, שחבור חלופי מהווה מנגנון חיוני לגיוון חלבון, הוספת שכבה נוספת של מורכבות לגנום האנושי. ככזה, חוסר ויסות של שחבור חלופי שעלול להוביל להשפעות ביולוגיות עמוקות גורמות למחלות בבני אדם. ואכן, שחבור חלופי חריג במחלות תועד במשך למעלה מעשור 15-25, כולל אחרונים ממצאים שמוטציות בגני מקודדי מכונות הספלייסוזום נמצאות בדרך כלל בתסמונות myelodysplastic 26-28. לכן, פיתוח שיטות אמינות לזיהוי של i שחבור החלופיsoforms הוא בעלת חשיבות רבה בחקר תהליכים ביולוגיים המגוונים כולל EMT.

כאן אנו מספקים פרוטוקול כדי לזהות שינויים בשחבור חלופי באמצעות מודל EMT מושרה. השיטות לעיצוב פריימרים PCR וגילוי isoforms אחוי הן מתאימות לא רק למחקר של שחבור חלופי במהלך EMT, אלא גם למחקר של שחבור חלופי בתהליכים ביולוגיים אחרים. חוקר שחבור חלופי במהלך EMT הוא הכרחי על מנת להבין טוב יותר את המנגנונים של EMT וגרורות סרטניים, ובכך להקל את הפיתוח של אסטרטגיות יעילות לטיפול בגרורות סרטן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

.1 תרבית תאים של EMT אינדוקציה

הערה: EMT יכול להיגרם על ידי טיפול בTGFβ או ביטוי חוץ רחמי של טוויסט גורמי שעתוק, חילזון, או Zeb1 / 2 בתאי האפיתל. שתואר בפרוטוקול זה הוא מערכת EMT מושרה באמצעות ביטוי של חלבון היתוך טוויסט-ER בתאים הונצחו אנושיים החלב אפיתל (HMLE / טוויסט-ER, מתנתו של ד"ר J יאנג, UCSD) 9,11,29. עם 4 hydroxytamoxifen טיפול (TAM), טוויסט-ER חלבון היתוך translocates לגרעין לנהוג שעתוק ותוצאות במעבר EMT מלא ב12-14 ימים 9,11,29. מערכות נוספות EMT מושרה, כגון HMLE / החילזון-ER, HMLE / TGFβ, וMCF10A / TGFβ, ניתן למצוא בפרסומים הקודמים שלנו 11,30.

  1. שמור על תאי HMLE / טוויסט-ER במדיום גידול של תאי אפיתל החלב סרום ללא (MEGM) ב37 מעלות צלזיוס חממה עם 5% CO 2. מעבר התאים כל 2-3 ימים שבם מגיעים למפגש 80%. דגירה תאים עם טריפסין 0.15% ב37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות, ולאחר מכן להשבית טריפסין עם עגל בסרום 5% / DMEM. ספין למטה תאי resuspend אותם בMEGM. פלייט תאים בצלחת תרבית רקמה חדשה ביחס של 1 עד 4.
  2. לפזר TAM באתנול כדי להפוך את פתרון 200 מיקרומטר. הגן על TAM מהאור והחנות ב -20 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, טרי להוסיף TAM לתקשורת MEGM בדילול 1: 10,000 כדי להפוך את הריכוז סופי של 20 ננומטר TAM.
  3. לאינדוקציה של EMT, תאי צלחת 1.6 x 10 6 HMLE / טוויסט-ER לתוך צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטר בשני עותקים. תרבות תאים עם 20 תקשורת ננומטר MEGM TAM המכיל.
  4. פלייט תאי 1.6 x 10 6 HMLE / טוויסט-ER לתוך צלחת 10 סנטימטר בשני עותקים ולטפל בתאים עם אתנול 0.01% כביקורת שטופל הלא TAM.
  5. יומיים לאחר הדגירה, לצלם תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה 10x להקליט שינויים מורפולוגיים של תאים.
  6. לשאוב את המדיום מצלחת אחת של שליטה או שטופל TAMתאים. שטוף תאים עם PBS הקר, ותאי קציר על ידי מבטל מחצית מהצלחת במאגר תמוגה RNA לבידוד RNA ואת החצי השני בחיץ Ripa לניתוח חלבונים.
  7. תאי מעבר מהשליטה או המנות שטופלו על ידי TAM 1.6 x 10 6 תאי ציפוי מחדש בצלחת 10 סנטימטר בשני עותקים. רציפות טיפול בתאים עם 20 ננומטר TAM או רכב.
  8. חזור על שלבים 5 עד 7 פעם אחת בכל יום אחר עד היום 14, בו בזמן, תאי טוויסט-ER טופל TAM להראות מורפולוגיה mesenchymal דמוי כישור, ואילו תאי שליטת רכב שטופל לשמור על מורפולוגיה אפיתל כמו מרוצפת-.

.2 אפיון EMT

הערה: השלמת EMT הוא הצביע על ידי: (1) תא שינויים מורפולוגיים ממורפולוגיה אפיתל כמו מרוצפת למראה דמוי כישור כמו fibroblastic-; הפסד של לוקליזציה E-cadherin בצמתים תאי תאים (2); ו (3) הביטוי עבר של סמני EMT, שהוגדר על ידי האובדןשל סמנים ורווח של סמני mesenchymal אפיתל.

שינויים מורפולוגיים תא נתפסו על ידי מיקרוסקופ אור בהגדלה 10x במהלך האינדוקציה EMT הזמן, שתוארו בסעיף 1 זיהוי חיסוני הקרינה של E-cadherin בתא צמתים מתואר בסעיף זה. הביטוי של סמני EMT הוא זוהה על ידי immunoblotting. סמני אפיתל נפוצים הם E-cadherin, γ-catenin, וoccludin, וסמני mesenchymal כוללים פיברונקטין, N-cadherin וvimentin. נהלים כלליים של immunoblotting מתוארים בסעיף 4.

  1. ביום 12 טיפול TAM, זרע 1 x 10 5 תאים על coverslip מעגלי מ"מ זכוכית 12 להציב גם צלחת 24 גם.
  2. 48 שעות לאחר זריעת תאים, בינוניים לשאוב ולשטוף עם PBS המחומם מראש.
  3. תקן תאים עם paraformaldehyde 4% מחוממים מראש במשך 15 דקות.
  4. שטוף תאים שלוש פעמים עם PBS.
  5. דגירה תאים עם 0.2% טריטון X-100 בPBS ל15דקות ב RT.
  6. שטוף תאים שלוש פעמים עם PBS.
  7. דגירה תאים בBSA / PBS 5% עבור שעה 1 ב RT לחסום הלא ספציפי מחייב.
  8. דגירה תאים עם E-cadherin הנוגדן הראשוני ב01:50 דילול של 1% BSA / PBS בO תא humidified / N ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: הטווח לדילול נוגדן ראשוני הוא בדרך כלל בין 01:50 ו1: 200, והדילול האופטימלי עבור כל נוגדן צריך להיקבע באופן ניסיוני.
  9. למזוג את הנוגדן הראשוני ולשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS.
  10. דגירה תאים עם נוגדנים משני שכותרתו ניאון בדילול 1: 500 עבור שעה 1 ב RT. משלב זה על, להגן על התאים מפני אור.
  11. למזוג נוגדנים משני ולשטוף שלוש פעמים עם PBS.
  12. תאי כתם עם 0.1-1 גר '/ מ"ל ​​DAPI או Hoechst עבור 10 דקות.
  13. יש לשטוף את תאי פעמים עם PBS שלוש.
  14. הר coverslips עם ירידה של מדיום הרכבה, וcoverslips חותם עם לק.
  15. שימו לב תאים ולקחתתמונות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי 63X.

צביעה עם נוגדנים נוספים ניתן לבצע על מנת לאשר את הפנוטיפ EMT. לדוגמא, N-cadherin ויקטינו שריר α-חלק יכולים להיות מוכתם ל29,31,32 פנוטיפ mesenchymal. ארגון מחדש של מבנה cytoskeletal יכול להיות במעקב על ידי צביעת תאים עם phalloidin לF-אקטין 11. בנוסף, ניתן לבצע מבחני לתנועתיות תא והתנגדות תא מוות לבחון את המאפיינים של 11 EMT.

.3 איתור של isoforms Splice שימוש מבחני qRT-PCR

  1. עיצוב פריימר
    הערה: זוגות פריימר צריכים להיות מתוכננים בקפידה על מנת להגביר isoforms אחוי ברור. אקסון דילוג, אירוע שחבור החלופי הנפוצה ביותר שנצפה, מוצג כאן כדוגמא כדי להמחיש את האסטרטגיה של עיצוב פריימר. איור 1 א מציג מראש mRNA ארבעה אקסון, עם אקסון השלישי כאקסון משתנה. הכללת אקסון 3 תוצאות בהייצור של איזופורם אחוי יותר, ואילו דילוג של אקסון 3 יוצר איזופורם אחוי קצר יותר. Primers צריך להיות מתוכנן להבחין איזופורם כלול אקסון-3-ואיזופורם אקסון-3-לדלג עליו, וכדי לזהות את התמליל הכולל של mRNA זה.
    1. לצורך זיהוי של הכללת אקסון, לעצב בקפידה פריימר קדימה בתוך אקסון משתנה 3, ופריימר הפוכה בתוך אקסון המכונן הסמוך 4, המאפשר להגברה הספציפית של איזופורם-כלול אקסון משתנה. הקפד לא לתכנן שני קדימה לאחור פריימרים בתוך אותו אקסון משתנה על מנת להימנע ממוצרי PCR מוגברים מהדנ"א הגנומי או הרנ"א ראשוני.
    2. כדי להגביר באופן ספציפי אירועי דילוג אקסון, עיצוב אחד של פריימרים פורש הצומת של אקסון המכונן 2 ואקסון 4 שאחרת היה נהרס כאשר אקסון משתנה 3 כלול. עיצוב פריימר האחר בתוך אקסון המכונן .4 ככזה, מוצרי PCR נוצרים רק כאשר אקסון משתנה 3 הוא excludעורך ומכונן אקסון 2 ואקסון 4 לאחר מכן חברו יחד.
    3. כדי לזהות את התמלילים הכולל של הגן, עיצוב פריימרים בתוך שני אקסונים מכוננים 1 ו -2 וכך, מוצרי PCR הם מוגברים מכל isoforms.
    4. ודאו את טמפרטורת ההתכה (TM) עבור כל פריימרים הוא כ 55 ° C, לאורכו של כל צבע יסוד הוא כ 18-22 נוקלאוטידים, ואת הגודל של מוצרי PCR הוא בין 80 ו150 זוגות בסיסים.
  2. מיצוי RNA: חלץ RNA באמצעות כוללת ערכת בידוד RNA (ראה טבלה של חומרים).
    1. איסוף תאים ב350 מאגר תמוגה RNA μl.
    2. הוסף 350 μl של 70% אתנול לlysate ומערבבים היטב.
    3. להעביר את המדגם לעמודת טיהור RNA.
    4. צנטריפוגה ב XG 10,000 דקות 1 וזרימה דרך קלפים שנזרקו.
    5. לשטוף את העמודה פעם אחת עם 500 μl שלי לשטוף חיץ RNA ופעמים עם חיץ לשטוף RNA II.
    6. הסר חיץ לשטוף RNA שיוריתהשני מהטור על ידי צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 2 דקות.
    7. העבר את הטור לתוך צינור 1.5 מ"ל חדש, להוסיף מים nuclease ללא 50 μl במרכז מטריצת העמודה וelute RNA על ידי צנטריפוגה במהירות המרבית.
  3. סינתזה של cDNA הראשון הגדיל
    1. קבע את הריכוז ואיכות של RNA על ידי מדידת ספיגת UV. הערה: RNA באיכות טובה צריכה יחס הספיגה / 280 ננומטר 260 ננומטר של כ 2.0.
    2. הגדר את תגובות טרנסקריפטאז (RT) המכילות 250 RNA ng סך הכל, 0.05 מיקרוגרם פריימרים hexamer האקראי, 50 pmol MgCl 2, 10 dNTP pmol, 2 μl 5 × חיץ GoScript, ואנזים RT μl 1 בנפח סופי של μl 20.
    3. לבצע תגובות RT ב42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ואחריו דגירה ב70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית את אנזים RT.
  4. בזמן אמת PCR
    1. הגדרה 20 תגובות μl שמורכבות מתערובת הורים הירוקים SYBR 10 μl,.1-1.0 תבנית μl cDNA, וpmol 5 קדימה הפוך פריימרים.
    2. הפעל בזמן אמת PCR עם 40 מחזורים מהשלבים הבאים: 95 מעלות צלזיוס denaturation עבור 10 שניות, 58 ° C חישול עבור 10 שניות, ו60 ° C הארכה ל30 שניות. לבצע PCR תגובות בשלושה עותקים.
    3. בדקו עקומות דיסוציאציה ולוודא ששיא יחיד הוא ציין עבור כל קבוצת פריימר.
    4. השג את ערכי מחזור כימות (CQ) על ידי חישוב הערכים נגזרים השני של עקומות הגברה.
    5. לחשב את הכמות היחסית (RQ) של mRNAs היעד בדגימות מושרה בהשוואה למדגם uninduced באמצעות "דלתא הדלתא Cq (ΔΔCq) 'שיטה כפי שמוצג על ידי הנוסחא הבאה. השתמש בגני משק בית, כגון GAPDH או TBP, כנקודת התייחסות.

משוואת 1
כדי לחשב בצורה מדויקת יותר את הערכים יחסי של isoforms אחוי, tהוא משתמש בגני התייחסות מרובים, צריך להיחשב. ניתן לנתח את התוצאות באמצעות שיטת כימות ערך המוחלט שונה שתוארה על ידי אל Pfaffl et 33,34.

.4 בחינת isoforms אחוי ברמת החלבון

  1. איסוף תאים ב100 חיץ Ripa קר כקרח μl.
  2. הגדר lysates על קרח למשך כ 10 דקות.
  3. צנטריפוגה ב XG 14,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C, ולאסוף את supernatant.
  4. למדוד ריכוז חלבון על ידי מבחני ברדפורד.
  5. לדלל דגימות חלבון בחיץ טעינת SDS ולטעון 20-40 מיקרוגרם של חלבונים לתוך ג'לי SDS-PAGE 10%.
  6. הפעל ג'לי SDS-PAGE ב20 mA ל1.5 שעות.
  7. העברת חלבונים לממברנות PVDF במערכת העברה רטובה על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות ב85 V. התאם את זמן העברה על פי המשקל המולקולרי של חלבוני יעד.
  8. קרום בלוק ב5% חלב דל שומן ל30 דקות ל1 שעות ב RT.
  9. דגירה wi קרוםth נוגדן ראשוני על 4 מעלות CO / N. הטווח לדילול נוגדן ראשוני הוא בדרך כלל בין 1: 200 ו1: 5,000, לקבוע את הדילול האופטימלי עבור כל נוגדן באופן ניסיוני. ניתן למצוא הדילול של נוגדנים המשמשים בפרוטוקול זה ב" טבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים ".
    1. כדי לזהות isoforms אחוי, להשתמש בנוגדנים ספציפיים שיכירו איזופורם מסוים. לחלופין, להשתמש בנוגדן שמכיר אפיטופ באזור אקסון המכונן הקידוד ולזהות isoforms אחוי בו זמנית המבוסס על גדלי החלבון השונים שלהם.
    2. בה בעת, לפקח EMT ידי immunoblotting לסמני EMT. השימוש E-cadherin, γ-catenin, וoccludin כסמני אפיתל, ופיברונקטין, N-cadherin וvimentin כסמני mesenchymal.
  10. פעמים קרום לשטוף שלוש עם TBS-T (50 מ"מ טריס, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4) במרווח של 5 דקות.
  11. דגירה קרום עם נמלה משנית HRP-מצומדותibody בדילול 1: 10,000 לשעה 1 בRT.
  12. פעמים קרום לשטוף שלוש עם TBS-T במרווח 5 דק '.
  13. דמיין חלבון עם מערכת איתור chemiluminescence ולחשוף את הקרום לסרט autoradiography.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הנהלים שתוארו לעיל מספקים שיטה חזקה כדי לזהות שחבור חלופי במהלך EMT. תוצאות נציג של מיתוג איזופורם אחוי CD44 במהלך EMT-Induced טוויסט הן כדלקמן לדוגמא ירושלים.

EMT-Induced טוויסט בתאי HMLE / טוויסט-ER התאפיין במעבר ממרצפות כמו פנוטיפ אפיתל לפנוטיפ fibroblastic מוארך (איור 2 א), העדר סמני אפיתל E-cadherin, γ-catenin וoccludin ו גברת ביטוי של פיברונקטין סמני mesenchymal, N-cadherin, וvimentin (איור 2). יתר על כן, EMT הוערך על ידי האובדן של לוקליזציה E-cadherin בצמתים תאי תאים (איור 2 ג).

הביטוי עבר של isoforms אחוי CD44 במהלך EMT נבדק על ידי qRT-PCR וimmunoblotting. גן CD44 האנושי מורכב מתשעה אקסונים משתנים. שחבור חלופי של CD44 מאפשר לתאים לפרוגרסאות הדוצ'ה CD44 (CD44v) הכוללות אקסון אחד לפחות משתנה, וCD44 סטנדרטי (CD44s) שהוא נטול כל אקסונים משתנים. איור 3 א מציג את האסטרטגיה של עיצוב פריימר לצורך זיהוי של isoforms אחוי CD44 השונים. לצורך זיהוי של CD44s מוצר אקסון-לדלג עליו, פריימר קדימה ממוקם באקסון המכונן 5, בעוד פריימר ההפוכה משתרעת על פני הצומת בין אקסונים המכוננים 5 ו -6 לזיהוי של isoforms אחוי CD44v המכיל משתנה v5 וv6 אקסונים, קדימה ופריימרים הפוכים נועדו בתוך v5 וv6, בהתאמה. צבעי יסוד לזיהוי של isoforms המכיל אקסון האחר CD44 משתנה יכול להיות מתוכנן תוך שימוש באותה האסטרטגיה. בנוסף, סך הכל תמליל CD44 הוא זוהה באמצעות קדימה לאחור פריימרים ממוקמים באקסון המכונן אקסון 2 ו -3, בהתאמה (איור 3 א). כפי שניתן לראות באיור 3 ב, qRT-PCR ניתוחי ניצול סטי פריימר אלה הצביע על ירידה משמעותית בCD44v mRNA ועלייה בCD44s mRNA לאחר 14 ימי טיפול TAM בתאי HMLE טוויסט-להביע ER. בניגוד לכך, לפרוטוקול הכולל של CD44 נותר ללא שינוי במהלך EMT (איור 3 ג). עולה בקנה אחד עם התוצאות של qRT-PCR, רמת החלבון של CD44v ירדה פלאים, בעוד שהביטוי של חלבון CD44s היה שהוגבר (איור 3D) באופן משמעותי. לכן, איזופורם העיקרי של CD44 הועבר מCD44v לCD44s במהלך תהליך EMT.

איור 1
עיצוב פריימר 1 איור. דיאגרמות סכמטי הממחישות את מיקומו של פריימרים לאיתור isoforms שחבור במודל הדילוג-אקסון. קופסות האפורות מייצגות אקסונים מכוננים, קופסות כתומות מייצגות אקסונים משתנים, והקווים הדקים חיבור תיבות לציין אינטרונים. מקומות פריימר הם indicatאד על ידי חיצים: חיצים שחורים מצביעים על סטי פריימר לגילוי mRNA סך הכל, חצים כתומים מצביעים על סטי פריימר להגברת isoforms-כלול אקסון, וחיצים כחולים מצביעים על סטי פריימר לאיתור isoforms דילוג-אקסון.

איור 2
איור 2 אינדוקציה של EMT. (א) בניגוד שלב תמונות (10X) הממחיש שינויים מורפולוגיים בתאי HMLE / טוויסט-ER לפני (ללא טיפול) ולאחר 14 ימי טיפול TAM. (ב) ניתוח immunoblot של סמני EMT בתאי HMLE / טוויסט-ER לפני (שלא טופל) ואחרי 14 ימי טיפול TAM. על טיפול TAM, סמני אפיתל E-cadherin, γ-catenin, וoccludin היו downregulated, ופיברונקטין סמני mesenchymal, N-cadherin, וvimentin היו שהוגבר. (C) תמונות הקרינה חיסון (63X) המצביע על האובדן של E-cadherinלוקליזציה בצמתים תאי תאים לאחר 14 ימי טיפול TAM. כתמים ירוקים מציין E-cadherin, ומכתים DAPI (כחול) מצביע על גרעינים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
החלף איור 3 של isoforms אחוי CD44 במהלך EMT. עיצוב פריימר לצורך זיהוי של isoforms אחוי CD44 (). קופסות האפורות מייצגות אקסונים מכוננים, קופסות כתומות מייצגות אקסונים משתנים, והקווים הדקים חיבור תיבות לציין אינטרונים. מקומות פריימר מסומנים על ידי חצים: חיצים שחורים מצביעים על סטי פריימר לגילוי mRNA הכולל CD44, חצים כתומים מצביעים על סטי פריימר להגברת CD44v5-6, וחיצים כחולים מצביעים על סטי פריימר לגילוי CD44s. (B, C) ​​ניתוח qRT-PCR של הרמות של isoforms CD44 במהלך EMT באמצעות פריימרים המזהים באופן ספציפי CD44v מכיל v5 משתנה אקסונים וv6 (v5 / 6) וCD44s (B), וmRNA הכולל CD44 (C) . רמות ביטוי היחסית של mRNA ביום 14 תאים היו מנורמלים ליום מקביל 0 תאים בTAM טופלו וקבוצות שאינם מטופלים. ברים שגיאה מצביעים SEM; n = 3 ניתוח (D) immunoblot של isoforms CD44 במהלך EMT-Induced TAM בתאי HMLE / טוויסט-ER. רמות של E-cadherin וN-cadherin היו במעקב כדי לזהות מצב EMT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההליך המתואר כאן מאפשר זיהוי של שחבור חלופי במודל EMT מושרה. כשינויים כאלה, דינמיים ביטוי איזופורם אחוי יכולים לנפול בפח בכל המהלך של EMT הזמן. לשיטה זו יתרונות על פני השימוש בepithelial- שונה או שורות תאים המייצגים-mesenchymal להשוואה של שחבור חלופי בגלל רקע גנטי שונה משורות תאים הקשורים לבלתי יכול להשפיע יתר על המידה שחבור חלופי. עם זאת, האינדוקציה המוצלחת של EMT חייבת להיות מאושרת בזהירות באמצעות ניתן להסיק סמני EMT שונים לפני כל מסקנות על שינויים בשחבור חלופי. יתר על כן, בנוסף למערכת EMT טוויסט-ER-מושרה המתוארת כאן, מערכות EMT אחרות כגון אלה הנגרמים על ידי החילזון-ER או TGFβ מומלצות לאימות של ממצאים ניסיוניים 11,30.

המיתוג של isoforms אחוי במהלך EMT ניתן לאתרם בשתי רמות RNA והחלבון. iso Spliceנוגדני צורה ספציפית עדיפים לניתוח חלבונים. כאשר נוגדני איזופורם הספציפי אינם זמינים, רמות החלבון של isoforms אחוי יכולות להיקבע על בסיס המשקל המולקולרי שלהם על SDS-PAGE ידי immunoblotting. רמת RNA של כל איזופורם ניתן לכמת על ידי פריימרים איזופורם ספציפי. שימוש במבחני qRT-PCR, שינוי הקיפול של כל איזופורם יכול להיות ברגישות ובדייקנות שנקבע. בפרט, כאשר חומרים ניסיוניים מוגבלים, כגון ניתוח הביטוי של איזופורם אחוי מסוים בדגימות קליניות, ניתוח qRT-PCR מספק מדד כמותי שיפצה על חוסר נוגדני איזופורם הספציפי לאימונוהיסטוכימיה.

השיטה שהוזכר כאן היא מתאימה לזיהוי של שינויים ידועים איזופורם אחוי במהלך EMT. בנוסף, בשיטה זו ניתן להרחיב למחקר של שחבור חלופי הגנום וזיהוי של מיתוג איזופורם אחוי רומן במהלך EMT. כדי להשיג זאת,שימוש בטכניקה בקנה מידה גדולה, כגון עמוק רצף RNA או פלטפורמות microarray רגיש שחבור, יכול להתבצע באמצעות RNAs מבודד ממודל EMT מושרה שתואר לעיל. אף על פי כן, אימות qRT-PCR של שינויי איזופורם נדרש לאחר כל ניתוח בקנה מידה גדולה.

לסיכום, שחבור חלופי מוסדר באופן דינמי במהלך EMT, תהליך זה הוא קריטי להתפתחות עוברית וגרורות סרטניים. בהתחשב בתדירות הגבוהה של שחבור חלופי בגנום האנושי, סביר להניח כי הרגולציה של שחבור חלופי ממלאת תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים רבים ופתולוגיים אחרים, כוללים התמיינות תאים, התפתחות רקמות, ותאים מתוכנתים מוות 35-41. הפרוטוקול המתואר במסמך זה לצורך זיהוי של isoforms אחוי יהיה ישים למערכות אחרות אלה, כמו גם.

שיטות ניסיוניות נוספות, כגון מבחני minigene כתב שחבור, יכול בדואר לשמש כדי לחקור עוד יותר את מנגנוני הוויסות של אלמנטים הפועל cis וגורמים הפועלים טרנס השולטים שחבור חלופי 30,42,43. יתר על כן, התפקיד הפונקציונלי של איזופורם אחוי בפרט במהלך EMT יכול להיחקר על ידי השתקה או ectopically להביע איזופורם והמעקב הספציפי האינדוקציה EMT במערכת EMT-מושרה תיארה 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxytamoxifen Sigma H7904 Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 μM. Keep the solution at -20 °C protected from light.
E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit Omega Bio-Tek R6731 Total RNA isolation kit
GoScript Reverse Transcription System Promega A5001 Reagent for qRT-PCR assay
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6002 Reagent for qRT-PCR assay
LightCycler 480 Real-Time PCR System Roche Equipment for qRT-PCR assay
CD44 antibody R&D Systems BBA10 1:1,000 dilution
E-cadherin antibody Cell Signaling Technology 4065 1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence
γ-Catenin antibody Cell Signaling Technology 2309 1:1,000 dilution
Occludin antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-5562 1:500 dilution
Fibronectin antibody BD Transduction Laboratories 610077 1:5,000 dilution
N-cadherin antibody BD Transduction Laboratories 610920 1:2,000 dilution
Vimentin antibody NeoMarkers MS-129-p1 1:500 dilution
GAPDH antibody Millipore Corporation MAB374 1:10,000 dilution
Amasham ECL Western blotting detection reagent GE Health Life Science RPN2209 Chemiluminescence system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
  2. Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 14, 818-829 (2008).
  3. Yang, J., et al. a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 117, 927-939 (2004).
  4. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).
  5. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).
  6. Comijn, J., et al. The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion. Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).
  7. Bolos, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).
  8. Eger, A., et al. DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells. Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).
  9. Shapiro, I. M., et al. An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype. PLoS Genet. 7, e1002218 (2011).
  10. Warzecha, C. C., et al. An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition. EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).
  11. Brown, R. L., et al. CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression. J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).
  12. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  13. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  14. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).
  15. Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene. Cell. 47, 277-284 (1986).
  16. Krangel, M. S. Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway. J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).
  17. Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse. Nature. 306, 756-760 (1983).
  18. Barbaux, S., et al. Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome. Nat Genet. 17, 467-470 (1997).
  19. Charlet, B. N., et al. Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol Cell. 10, 45-53 (2002).
  20. Hutton, M., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature. 393, 702-705 (1998).
  21. Kohsaka, T., et al. Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome. Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).
  22. Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy. Science. 280, 737-741 (1998).
  23. Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet. 29, 40-47 (2001).
  24. Spillantini, M. G., et al. Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).
  25. Wang, J., et al. Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation. Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).
  26. Graubert, T. A., et al. Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 44, 53-57 (2012).
  27. Papaemmanuil, E., et al. Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts. N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).
  28. Yoshida, K., et al. Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia. Nature. 478, 64-69 (2011).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, 704-715 (2008).
  30. Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition. J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).
  31. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).
  32. Zavadil, J., Bottinger, E. P. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions. Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).
  33. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).
  34. Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biol. 8, R19 (2007).
  35. Boutz, P. L., et al. A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons. Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).
  36. Salomonis, N., et al. Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).
  37. Calarco, J. A., et al. Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein. Cell. 138, 898-910 (2009).
  38. Grabowski, P. Alternative splicing takes shape during neuronal development. Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).
  39. Seol, D. W., Billiar, T. R. A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis. J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).
  40. Srinivasula, S. M., et al. Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis. Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).
  41. Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications. Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).
  42. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37, 331-340 (2005).
  43. Cheng, C., Sharp, P. A. Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion. Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 92 שחבור חלופי EMT RNA עיצוב פריימר בזמן אמת PCR isoforms אחוי
איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, H., Xu, Y., Cheng, C.… More

Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition. J. Vis. Exp. (92), e51845, doi:10.3791/51845 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter