Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

Published: October 9, 2014 doi: 10.3791/51845
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine
* These authors contributed equally

Introduction

La transizione epitelio-mesenchimale (EMT) è un programma di sviluppo che guida la morfogenesi di organi e rimodellamento tissutale durante l'embriogenesi. Quando anormalmente attivato, EMT promuove la metastasi del tumore e degli organi fibrosi 1,2. Studi convincenti hanno descritto l'importanza della regolazione trascrizionale durante il processo di EMT, definito da diversi fattori di trascrizione, come il Twist, Lumaca, e ZEB, che reprimono l'espressione della proteina di giunzione adherens E-caderina, con conseguente perdita di un cobble- pietra come morfologia epiteliale e il guadagno di un a forma di fuso fenotipo mesenchimale 3-8. Recenti studi attraverso l'analisi dell'intero genoma di RNA hanno rivelato che esiste un gruppo di geni i cui modelli di splicing sono associati sia con fenotipi epiteliali e mesenchimali 9,10. Il lavoro dal nostro laboratorio funzionalmente collegato splicing alternativo e EMT. Studiando la superficie cellulare molecola di adesione CD44, abbiamo dimostrato che il CD44 Alternative splicing è strettamente regolata durante EMT, e più importante, che CD44 giuntura isoforma passaggio causalmente contribuisce alla EMT 11.

Splicing alternativo rappresenta un modello diffuso e conservato di regolazione genica, in quanto fino al 95% dei geni multi-esone umani sono splicing alternativo 12-14. Generando più prodotti proteici da un singolo gene, splicing alternativo costituisce un meccanismo essenziale per la diversità di proteine, aggiungendo un ulteriore livello di complessità al genoma umano. Come tale, disregolazione di splicing alternativo potrebbe potenzialmente portare a profondi effetti biologici che causano malattie umane. Infatti, aberrante splicing alternativo nelle malattie è stato documentato da oltre un decennio 15-25, compresi recenti scoperte che le mutazioni in geni che codificano per le macchine spliceosoma trovano comunemente nelle sindromi mielodisplastiche 26-28. Pertanto, lo sviluppo di metodi affidabili per la rilevazione di i splicing alternativosoforms è di grande importanza nello studio dei processi biologici diversi, tra cui EMT.

Qui forniamo un protocollo per rilevare i cambiamenti nella splicing alternativo utilizzando un modello di EMT inducibile. I metodi per la progettazione di primer PCR e rilevazione isoforme di splicing sono adatte non solo per lo studio di splicing alternativo durante EMT, ma anche per lo studio di splicing alternativo in altri processi biologici. Indagare splicing alternativo durante EMT è indispensabile al fine di comprendere meglio i meccanismi di EMT e metastasi tumorali, facilitando così lo sviluppo di strategie efficaci per il trattamento di metastasi del cancro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Cella Cultura della EMT induzione

Nota: EMT può essere indotta da trattamenti di TGFβ o espressione ectopica di fattori di trascrizione Twist, Chiocciola, o Zeb1 / 2 in cellule epiteliali. Descritto in questo protocollo è un sistema EMT inducibile mediante espressione della proteina di fusione Twist-ER in cellule immortalizzate umane epiteliali mammarie (HMLE / Twist-ER, un dono di Dr. J Yang, UCSD) 9,11,29. Al 4-hydroxytamoxifen (TAM) il trattamento, la proteina di fusione Twist-ER trasloca nel nucleo di guidare la trascrizione e risultati in una transizione completa EMT in 12-14 giorni 9,11,29. Altri sistemi inducibili EMT, come HMLE / Snail-ER, HMLE / TGFβ, e MCF10A / TGFβ, si possono trovare nelle nostre precedenti pubblicazioni 11,30.

  1. Mantenere le cellule HMLE / Twist-ER in mammaria mezzo di crescita delle cellule epiteliali privo di siero (MEGM) in un incubatore a 37 ° C con il 5% di CO 2. Passage le cellule ogni 2-3 giorni quando raggiungono l'80% di confluenza. Incubare le cellule con tripsina 0,15% a 37 ° C per 5-10 minuti, quindi inattivare la tripsina con siero di vitello al 5% / DMEM. Spin le cellule e risospendere in MEGM. Cellule portapiatti in un nuovo piatto di coltura tissutale con un rapporto di 1 a 4.
  2. Sciogliere TAM in etanolo per ottenere una soluzione 200 mM. Proteggere TAM dalla luce e conservare a -20 ° C. Prima dell'uso, appena aggiungere TAM in MEGM materie ad una diluizione 1: 10.000 per effettuare una concentrazione finale di 20 nM TAM.
  3. Per l'induzione di EMT, piastra cellule 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER in un 10 centimetri piatto di coltura di tessuti in duplice copia. Celle di coltura con 20 supporti nM TAM-contenenti MEGM.
  4. Piatto cellule 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER in un piatto di 10 centimetri in duplice copia e il trattamento di cellule con 0,01% di etanolo come controllo non-TAM-trattati.
  5. Due giorni dopo l'incubazione, scattare foto sotto un microscopio ottico a 10X di ingrandimento per registrare cambiamenti morfologici delle cellule.
  6. Aspirare il mezzo da un piatto di controllo o di TAM-trattaticellule. Lavare le cellule con PBS freddo e celle raccolto da demolizione metà della piastra in tampone di lisi RNA per l'isolamento dell'RNA e l'altra metà in tampone RIPA per l'analisi di proteine.
  7. Cellule passaggio dal controllo o piatti TAM-trattati con 1,6 x 10 6 cellule ri-placcatura in un piatto di 10 centimetri in duplice copia. Continuamente trattare le cellule con 20 nM TAM o di un veicolo.
  8. Ripetere i passaggi da 5 a 7 una volta ogni due giorni fino al giorno 14, in cui il tempo, le cellule Twist-ER TAM-trattati mostrano una mesenchimale morfologia fusiforme, mentre le cellule di controllo del veicolo trattate mantengono la morfologia epiteliale ciottoli-like.

2 Caratterizzazione di EMT

Nota: A completamento della EMT è indicato da: (1) cambiamenti morfologici delle cellule da una morfologia epiteliale ciottoli come a un aspetto fibroblastica-come a forma di fuso; (2) Perdita di localizzazione E-caderina a giunzioni cellula-cellula; e (3) L'espressione commutazione di marcatori EMT, definito dalla perditadi marcatori epiteliali e aumento dei marcatori mesenchimali.

Cellulari cambiamenti morfologici vengono acquisite da microscopio ottico a 10X di ingrandimento nel corso del tempo di induzione EMT, descritto nella Sezione 1 Immuno-fluorescenza rilevamento di E-caderina in cellule-giunzioni è descritto in questa sezione. L'espressione di markers di EMT viene rilevato mediante immunoblotting. Marcatori epiteliali comuni sono E-caderina, γ-catenina, e occludina, e marcatori mesenchimali includono fibronectina, N-caderina e vimentina. Procedure generali di immunoblotting sono descritti nella sezione 4.

  1. Al giorno 12 del trattamento TAM, semi di 1 x 10 5 cellule su un vetro coprioggetti circolare 12 millimetri disposte in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
  2. 48 ore dopo che le cellule di semina, medie Aspirare e lavare con pre-riscaldato PBS.
  3. Fissare le cellule con pre-riscaldato paraformaldeide 4% per 15 min.
  4. Lavare le cellule tre volte con PBS.
  5. Incubare le cellule con 0,2% Triton X-100 in PBS per 15minuti a temperatura ambiente.
  6. Lavare le cellule tre volte con PBS.
  7. Incubare le cellule a 5% BSA / PBS per 1 ora a temperatura ambiente per bloccare legame non specifico.
  8. Incubare le cellule con l'anticorpo E-caderina primario in una diluizione 1:50 in 1% BSA / PBS in una camera di umidificata O / N a 4 ° C. NOTA: L'intervallo per la diluizione anticorpo primario è normalmente compreso tra 1:50 e 1: 200, e la diluizione ottimale per ogni anticorpo deve essere determinato sperimentalmente.
  9. Decantare l'anticorpo primario e lavare le cellule tre volte con PBS.
  10. Incubare le cellule con l'anticorpo secondario fluorescente marcato in una diluizione 1: 500 per 1 ora a temperatura ambiente. Da questo punto in poi, proteggere le cellule dalla luce.
  11. Decantare l'anticorpo secondario e lavare tre volte con PBS.
  12. Cellule macchia con 0,1-1 g / ml DAPI o Hoechst per 10 min.
  13. Lavare le cellule con PBS per tre volte.
  14. Montare coprioggetto con una goccia di mezzo di montaggio, e coprioggetto tenuta con smalto.
  15. Osservare le cellule e prendereimmagini sotto un microscopio a fluorescenza 63X.

Colorazione con anticorpi supplementari può essere eseguita per confermare il fenotipo EMT. Ad esempio, N-caderina e α-actina del muscolo liscio possono essere colorati per un fenotipo mesenchimale 29,31,32. Riorganizzazione della struttura del citoscheletro può essere monitorato mediante colorazione delle cellule con falloidina per la F-actina 11. Inoltre, saggi di motilità cellulare e la resistenza delle cellule morte possono essere eseguite per esaminare le proprietà del EMT 11.

3 Rilevamento di Splice Isoforme Utilizzo qRT-PCR saggi

  1. Disegno Primer
    NOTA: Le coppie di primer deve essere accuratamente studiato per amplificare isoforme di splicing distinti. Exon skipping, l'evento splicing alternativo più comunemente osservato, è illustrata qui come esempio per illustrare la strategia di progettazione di primer. Figura 1A mostra una quattro esone pre-mRNA, con il terzo esone come esone variabile. L'inclusione dell'esone 3 risultati inla produzione di un giunto isoforma più lunga, mentre skipping dell'esone 3 genera una giuntura isoforma più corta. I primer devono essere progettati per distinguere l'isoforma esone-3-incluso e esone-3-saltato isoforma, e per rilevare la trascrizione completa della mRNA.
    1. Per il rilevamento di inclusione dell'esone, progettare con cura un primer in avanti all'interno della variabile esone 3, e un primer reverse all'interno della vicina esone costitutiva 4, permettendo l'amplificazione specifica della variabile isoforma esone-incluso. Assicurarsi di non progettare sia in avanti e reverse primer all'interno dello stesso esone variabile al fine di evitare i prodotti della PCR amplificati a partire dal DNA genomico o pre-mRNA.
    2. Per amplificare specificamente esone eventi saltare, di design uno dei primer che abbracciano la giunzione dell'esone costitutiva 2 e esone 4 che altrimenti sarebbe distrutto quando esone variabile 3 è incluso. Progettare l'altro fondo all'interno del esone costitutiva 4 Come tale, i prodotti di PCR vengono generati solo quando la variabile esone 3 è excluded e la costitutiva esone 2 e l'esone 4 sono successivamente uniti.
    3. Per rilevare le trascrizioni totali del gene, disegnare i primer entro due esoni costitutivi 1 e 2 Pertanto, i prodotti di PCR sono amplificati da tutte le isoforme.
    4. Assicurarsi che la temperatura di fusione (Tm) per tutti i primer è di circa 55 ° C, la lunghezza di ogni primer è di circa 18-22 nucleotidi, e la dimensione dei prodotti di PCR è compresa tra 80 e 150 paia di basi.
  2. Estrazione di RNA: RNA estratto utilizzando un kit di totale isolamento di RNA (vedi tabella dei Materiali).
    1. Raccogliere le cellule in 350 microlitri di buffer di lisi RNA.
    2. Aggiungere 350 ml di etanolo al 70% al lisato e mescolare accuratamente.
    3. Trasferire il campione alla colonna di purificazione dell'RNA.
    4. Centrifugare a 10.000 xg per 1 min e scarto flow-through.
    5. Lavare la colonna una volta con 500 ml di RNA di lavaggio buffer di I e due volte con RNA tampone di lavaggio II.
    6. Rimuovere il tampone di lavaggio RNA residuoII dalla colonna mediante centrifugazione a velocità massima per 2 min.
    7. Trasferire la colonna in una nuova provetta da 1,5 ml, aggiungere acqua priva di nucleasi 50 microlitri al centro della matrice colonna ed eluire l'RNA per centrifugazione a velocità massima.
  3. Sintesi di cDNA First-strand
    1. Determinare la concentrazione e la qualità di RNA con la misura di assorbimento UV. NOTA: Buona RNA qualità dovrebbe avere un / 280 nm rapporto di assorbanza 260 nm di circa 2.0.
    2. Impostare trascrittasi inversa (RT) reazioni che contengono 250 ng di RNA totale, 0,05 mg primer esameriche casuale, 50 pmol MgCl 2, 10 pmol dNTP, 2 microlitri di buffer 5 × GoScript, e 1 ml RT enzima in un volume finale di 20 ml.
    3. Eseguire reazioni RT a 42 ° C per 1 ora, seguito da incubazione a 70 ° C per 5 minuti per inattivare l'enzima RT.
  4. Real-time PCR
    1. Impostare 20 microlitri reazioni che consistono di 10 microlitri SYBR master mix verde,0.1-1.0 modello cDNA microlitri, e 5 pmol avanti e indietro primer.
    2. Eseguire PCR in tempo reale con 40 cicli dei seguenti passi: 95 ° C denaturazione per 10 sec, 58 ° C ricottura per 10 sec e 60 ° C per 30 sec estensione. Eseguire reazioni PCR in triplice copia.
    3. Controllare le curve di dissociazione e fare in modo che un singolo picco si osserva per ogni set di primer.
    4. Ottenere i valori di ciclo di quantificazione (Cq) calcolando i secondi valori derivati ​​curve di amplificazione.
    5. Calcolare la quantità relativa (RQ) del mRNA bersaglio in campioni indotto, rispetto al campione uninduced utilizzando il 'delta delta Cq (ΔΔCq)' metodo come mostrato dalla seguente formula. Utilizzare geni housekeeping, come GAPDH o TBP, come riferimento.

Equazione 1
Per calcolare con maggiore precisione i valori relativi delle isoforme di splicing, tegli usa di più geni di riferimento dovrebbe essere considerato. I risultati possono essere analizzati utilizzando un metodo di quantificazione del valore assoluto modificato descritto da Pfaffl et al 33,34.

4 Esame di Splice Isoforme a livello proteico

  1. Raccogliere le cellule in 100 microlitri di buffer RIPA ghiacciato.
  2. Impostare lisati su ghiaccio per circa 10 min.
  3. Centrifugare a 14000 g per 10 min a 4 ° C, e raccogliere il surnatante.
  4. Misurare la concentrazione di proteine ​​mediante saggi Bradford.
  5. Diluire i campioni di proteine ​​in tampone di caricamento SDS e caricare 20-40 mg di proteine ​​in gel 10% SDS-PAGE.
  6. Eseguire gel SDS-PAGE a 20 mA per 1.5 ore.
  7. Trasferimento proteine ​​di membrane PVDF in un sistema di trasferimento umida a 4 ° C per 3 ore a 85 V. Regolare il tempo di trasferimento secondo il peso molecolare delle proteine ​​bersaglio.
  8. Membrana blocco in 5% di latte senza grassi per 30 minuti a 1 ora a temperatura ambiente.
  9. Incubare la membrana with un anticorpo primario a 4 ° CO / N. La gamma di diluizione anticorpo primario è normalmente compresa tra 1: 200 e 1: 5.000, determinare la diluizione ottimale per ciascun anticorpo sperimentalmente. La diluizione di anticorpi utilizzati in questo protocollo può essere trovato in "Tabella di reagenti e attrezzature specifiche".
    1. Per rilevare isoforme di splicing, utilizzare anticorpi specifici che riconoscono una particolare isoforma. In alternativa, utilizzare un anticorpo che riconosce l'epitopo nella costitutiva esone regione codificante e rilevare le isoforme di splicing simultaneamente in base alle loro dimensioni diverse proteine.
    2. Allo stesso tempo, monitorare EMT mediante immunoblotting per i marcatori di EMT. Utilizzare E-caderina, γ-catenina, e occludina come marcatori epiteliali, e fibronectina, N-caderina e vimentina come marcatori mesenchimali.
  10. Membrana Lavare tre volte con TBS-T (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7.4) in un intervallo di 5 min.
  11. Incubare la membrana con una formica secondario HRP-coniugatoiBody in una diluizione 1: 10.000 per 1 ora a RT.
  12. Membrana Lavare tre volte con TBS-T in un intervallo di 5 min.
  13. Visualizzare proteina con un sistema di rilevazione chemiluminescenza ed esporre la membrana di un film autoradiografia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Le procedure sopra descritte forniscono un metodo affidabile per rilevare splicing alternativo durante EMT. Risultati rappresentativi di CD44 giunzione commutazione isoforma durante EMT Twist-indotta sono riportati di seguito come esempio.

EMT Twist-indotta nelle cellule HMLE / Twist-ER è stato caratterizzato da una transizione da un ciottolo-pietra come fenotipo epiteliale ad un fenotipo fibroblastica allungata (Figura 2A), l'assenza di marcatori epiteliali E-caderina, γ-catenina e Occludin e la sovraregolazione di marcatori mesenchimali fibronectina, N-caderina e vimentina (Figura 2B). Inoltre, EMT è stata valutata dalla perdita di localizzazione E-caderina a giunzioni cellula-cellula (Figura 2C).

L'espressione di CD44 commutato isoforme di splicing durante EMT è stato esaminato da qRT-PCR e immunoblotting. Il gene CD44 umano è composto di nove esoni variabili. Splicing alternativo permette di CD44 per le cellule di provarianti Duce CD44 (CD44v) che comprendono almeno un esone variabile, e standard di CD44 (CD44s), che è privo di tutti gli esoni variabili. Figura 3A raffigura la strategia di disegno primer per il rilevamento di varie isoforme di CD44 giunzione. Per la rilevazione dei CD44s prodotto esone-saltato, il primer in avanti si trova nel esone costitutiva 5, mentre il primer inverso si estende attraverso la giunzione tra esoni costitutivi 5 e 6 per l'individuazione di CD44v isoforme di splicing contenente la variabile v5 e v6 esoni, il forward e reverse primer sono progettati all'interno della v5 e v6, rispettivamente. Primer per il rilevamento di altre variabili isoforme-esone contenente CD44 possono essere progettati utilizzando la stessa strategia. Inoltre, totale trascrizione CD44 viene rilevato utilizzando avanti e indietro primer situati nel costitutiva esone 2 e esone 3, rispettivamente (Figura 3A). Come mostrato nella Figura 3B, qRT-PCR analisi utilizzando questi set di primer indicato una diminuzione significativa CD44v mRNA e l'aumento CD44s mRNA dopo 14 giorni di trattamento TAM nelle cellule HMLE Twist-esprimono ER. Per contro, la trascrizione totale di CD44 è rimasto invariato nel corso EMT (Figura 3C). Coerentemente con i risultati di qRT-PCR, il livello della proteina di CD44v è diminuito notevolmente, mentre l'espressione della proteina CD44s è stato molto sovraregolati (Figura 3D). Pertanto, il principale isoforma di CD44 è stata spostata da CD44v a CD44s durante il processo di EMT.

Figura 1
Disegno Figura 1 Primer. Diagrammi schematici che illustrano la posizione dei primer per il rilevamento isoforme di splicing in un modello-esone skipping. Le caselle grigie rappresentano esoni costitutivi, le scatole arancioni rappresentano esoni variabili, e le linee sottili che collegano le caselle indicano introni. Le posizioni dei primer sono indicatEd dalle frecce: le frecce nere indicano set di primer per il rilevamento mRNA totale, frecce arancioni indicano set di primer per amplificare isoforme esone-incluso, e le frecce blu indicano i set di primer per il rilevamento isoforme-exon skipping.

Figura 2
Figura 2 induzione di EMT. (A) le immagini a contrasto di fase (10X) che illustrano i cambiamenti morfologici nelle cellule HMLE / Twist-ER prima (non trattata) e dopo 14 giorni di trattamento TAM. (B) immunoblot analisi di marcatori di EMT nelle cellule HMLE / Twist-ER prima (non trattato) e dopo 14 giorni di trattamento TAM. Dopo il trattamento TAM, marcatori epiteliali E-caderina, γ-catenina, e Occludin sono stati inibiti e marcatori mesenchimali e fibronectina, N-caderina e vimentina sono stati sovraregolata. (C) immagini immunofluorescenza (63X) che indica la perdita di E-caderinalocalizzazione a giunzioni cellula-cellula dopo 14 giorni di trattamento TAM. Colorazione verde indica E-caderina, e colorazione DAPI (blu) indica nuclei. Barra della scala = 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3 Interruttore di isoforme di CD44 splicing durante EMT. (A) progettazione Primer per il rilevamento delle isoforme di CD44 giunzione. Le caselle grigie rappresentano esoni costitutivi, le scatole arancioni rappresentano esoni variabili, e le linee sottili che collegano le caselle indicano introni. Le posizioni dei primer sono indicati da frecce: le frecce nere indicano set di primer per il rilevamento di mRNA totale CD44, frecce arancioni indicano set di primer per amplificare CD44v5-6, e le frecce blu indicano i set di primer perrilevazione CD44s. (B, C) ​​analisi qRT-PCR dei livelli di isoforme di CD44 durante EMT utilizzando primer che specificamente di rilevare CD44v contenente esoni v5 e v6 variabili (v5 / 6) e CD44s (B), e mRNA totale CD44 (C) . Livelli di espressione relativi di mRNA in Giorno 14 celle sono stati normalizzati al corrispondente giorno 0 cellule TAM trattate e dei gruppi non trattati. Le barre di errore indicano SEM; n = 3 (D) analisi immunoblot delle isoforme di CD44 durante EMT TAM-indotta nelle cellule HMLE / Twist-ER. I livelli di E-caderina e N-caderina sono stati monitorati per identificare lo stato EMT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La procedura qui descritta consente il rilevamento di splicing alternativo in un modello EMT inducibile. Come tali, le alterazioni dinamiche di espressione delle isoforme di splicing possono essere catturate nel corso tempo di EMT. Questo metodo ha vantaggi rispetto all'uso di epithelial- diverso o linee di cellule mesenchimali-che rappresenta per il confronto di splicing alternativo, perché background genetici distinti da linee cellulari connessi alle Nazioni Unite potrebbero influenzare indebitamente splicing alternativo. Tuttavia, l'induzione di successo di EMT deve essere attentamente confermata con vari marcatori di EMT prima di trarre conclusioni su eventuali variazioni di splicing alternativo si possono trarre. Inoltre, in aggiunta al sistema di EMT Twist-ER-inducibile qui descritto, altri sistemi EMT, come quelli indotti da Snail-ER o TGFβ sono raccomandati per la validazione dei risultati sperimentali 11,30.

La commutazione delle isoforme di splicing durante EMT può essere rilevato in entrambi i livelli di RNA e proteine. Splice isoanticorpi specifici moduli sono preferiti per l'analisi delle proteine. Quando anticorpi specifici isoforma non sono disponibili, i livelli di proteina di isoforme di splicing può essere determinato in base al loro peso molecolare su SDS-PAGE mediante immunoblotting. Il livello di RNA di ciascuna isoforma può essere quantificato primer specifici per isoforma. Utilizzando saggi qRT-PCR, la variazione piega di ciascuna isoforma può essere determinato con sensibilità e precisione. In particolare, quando i materiali sperimentali sono limitate, come ad esempio analizzando l'espressione di una particolare isoforma di splicing in campioni clinici, analisi qRT-PCR fornisce una misura quantitativa che potrebbe compensare la mancanza di anticorpi specifici per l'isoforma immunoistochimica.

Il metodo qui menzionato è adatto per la rivelazione dei noti cambiamenti isoforma di splicing durante EMT. Inoltre, questo metodo può essere ampliato per lo studio del genoma a livello di splicing alternativo e per l'identificazione di nuovi commutazione isoforma di splicing durante EMT. Per fare questo,uso di una tecnica di grande scala, come RNA profonde sequenziamento o piattaforme microarray sensibile splicing, potrebbe essere eseguita utilizzando RNA isolato dal modello EMT inducibile sopra descritto. Tuttavia, la convalida qRT-PCR dei cambiamenti isoforma è richiesto a seguito di una analisi su larga scala.

In conclusione, splicing alternativo è regolata dinamicamente durante EMT, un processo che è fondamentale per lo sviluppo embrionale e metastasi tumorali. Considerando l'alta frequenza di splicing alternativo nel genoma umano, è probabile che la regolazione dello splicing alternativo svolge un ruolo importante in molti altri processi biologici e patologici, tra cui la differenziazione cellulare, lo sviluppo dei tessuti, e la morte cellulare programmata 35-41. Il protocollo qui descritto per la rilevazione delle isoforme di splicing sarà applicabile a questi altri sistemi.

Ulteriori modalità sperimentali, come ad esempio test splicing giornalista minigene, può be utilizzato per approfondire i meccanismi regolatori di elementi cis-agendo e fattori trans-acting che controllano lo splicing alternativo 30,42,43. Inoltre, il ruolo funzionale di una particolare isoforma di splicing durante EMT può essere indagato da tacere o ectopicamente esprimono l'isoforma specifica e monitoraggio induzione EMT nel sistema EMT-inducibile descritto 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxytamoxifen Sigma H7904 Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 μM. Keep the solution at -20 °C protected from light.
E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit Omega Bio-Tek R6731 Total RNA isolation kit
GoScript Reverse Transcription System Promega A5001 Reagent for qRT-PCR assay
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6002 Reagent for qRT-PCR assay
LightCycler 480 Real-Time PCR System Roche Equipment for qRT-PCR assay
CD44 antibody R&D Systems BBA10 1:1,000 dilution
E-cadherin antibody Cell Signaling Technology 4065 1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence
γ-Catenin antibody Cell Signaling Technology 2309 1:1,000 dilution
Occludin antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-5562 1:500 dilution
Fibronectin antibody BD Transduction Laboratories 610077 1:5,000 dilution
N-cadherin antibody BD Transduction Laboratories 610920 1:2,000 dilution
Vimentin antibody NeoMarkers MS-129-p1 1:500 dilution
GAPDH antibody Millipore Corporation MAB374 1:10,000 dilution
Amasham ECL Western blotting detection reagent GE Health Life Science RPN2209 Chemiluminescence system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
  2. Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 14, 818-829 (2008).
  3. Yang, J., et al. a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 117, 927-939 (2004).
  4. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).
  5. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).
  6. Comijn, J., et al. The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion. Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).
  7. Bolos, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).
  8. Eger, A., et al. DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells. Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).
  9. Shapiro, I. M., et al. An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype. PLoS Genet. 7, e1002218 (2011).
  10. Warzecha, C. C., et al. An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition. EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).
  11. Brown, R. L., et al. CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression. J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).
  12. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  13. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  14. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).
  15. Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene. Cell. 47, 277-284 (1986).
  16. Krangel, M. S. Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway. J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).
  17. Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse. Nature. 306, 756-760 (1983).
  18. Barbaux, S., et al. Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome. Nat Genet. 17, 467-470 (1997).
  19. Charlet, B. N., et al. Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol Cell. 10, 45-53 (2002).
  20. Hutton, M., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature. 393, 702-705 (1998).
  21. Kohsaka, T., et al. Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome. Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).
  22. Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy. Science. 280, 737-741 (1998).
  23. Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet. 29, 40-47 (2001).
  24. Spillantini, M. G., et al. Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).
  25. Wang, J., et al. Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation. Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).
  26. Graubert, T. A., et al. Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 44, 53-57 (2012).
  27. Papaemmanuil, E., et al. Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts. N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).
  28. Yoshida, K., et al. Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia. Nature. 478, 64-69 (2011).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, 704-715 (2008).
  30. Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition. J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).
  31. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).
  32. Zavadil, J., Bottinger, E. P. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions. Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).
  33. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).
  34. Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biol. 8, R19 (2007).
  35. Boutz, P. L., et al. A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons. Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).
  36. Salomonis, N., et al. Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).
  37. Calarco, J. A., et al. Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein. Cell. 138, 898-910 (2009).
  38. Grabowski, P. Alternative splicing takes shape during neuronal development. Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).
  39. Seol, D. W., Billiar, T. R. A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis. J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).
  40. Srinivasula, S. M., et al. Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis. Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).
  41. Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications. Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).
  42. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37, 331-340 (2005).
  43. Cheng, C., Sharp, P. A. Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion. Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).

Tags

Biologia Cellulare splicing alternativo EMT RNA progettazione di primer real time PCR isoforme di splicing
Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, H., Xu, Y., Cheng, C.… More

Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition. J. Vis. Exp. (92), e51845, doi:10.3791/51845 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter