Abstract
Telomerase, een ribonucleoproteïne, is verantwoordelijk voor het handhaven van de telomeerlengte en daarmee het bevorderen van genomische integriteit, proliferatie, en levensduur. Bovendien telomerase beschermt de mitochondriën tegen oxidatieve stress en resistentie tegen apoptose, suggereert de mogelijke betekenis voor de overlevende van niet-mitotische, zeer actieve cellen zoals neuronen. We hebben eerder werd aangetoond dat telomerase nieuwe activatoren telomerase activiteit en expressie in de verschillende muizen hersengebieden verhogen en motorische neuronen cellen tegen oxidatieve stress. Deze resultaten versterken het idee dat telomerase is betrokken bij de bescherming van neuronen uit verschillende letsels. Om de rol van telomerase in de hersenen onderstrepen we hier vergelijken de activiteit van telomerase in mannelijke en vrouwelijke muizenhersenen en de afhankelijkheid van de leeftijd. TRAP assay is een standaard methode voor het detecteren van telomerase-activiteit in verschillende weefsels of cellijnen. Hier laten we de analysis van telomerase-activiteit in drie gebieden van de hersenen van muizen door niet-denaturerende eiwit extractie middels CHAPS lysis buffer gevolgd door modificatie van de standaard TRAP assay.
In deze 2 stappen assay endogene telomerase verlengt specifieke telomerase substraat (TS primer) door toevoeging van TTAGGG 6 bp herhalingen (telomerase reactie). De telomerase reactieproducten worden versterkt door PCR-reactie het creëren van een DNA-ladder van stappen 6 bp. De analyse van de DNA ladder wordt door 4,5% hoge resolutie agarose gelelektroforese gevolgd door kleuring met zeer gevoelige nucleïnezuur vlek.
Vergeleken met de traditionele TRAP assay die gebruik 32 P gemerkt radioactief dCTP voor DNA detectie en polyacrylamide gelelektroforese oplossing van het DNA ladder Dit protocol biedt niet giftige tijdbesparende TRAP-assay voor het evalueren van telomerase-activiteit in de hersenen van muizen, tonen de mogelijkheid om detecteren verschillen in telomerase activiteit in de verschillende vrouwelijke en mannelijke regio muizenhersenen.
Introduction
Telomerase is een ribonucleoproteïne uit telomerase reverse transcriptase (TERT), de katalytische subeenheid van telomerase, en een RNA component (TERC). De canonieke rol van telomerase is de juiste lengte van de telomeren behouden door toevoeging van repetitieve sequenties (TTAGGG) de telomere eindigt derhalve bevordering genomische integriteit en celproliferatie 1. Aanvullende functies werden toegeschreven aan TERT in cellen, dwz resistentie tegen apoptose geïnduceerd door verschillende beschadigende middel 2 verleent beschermt menselijke mesenchymale stamcellen uit oxidatieve stress 3, en speelt een pro-survival rol in volledig gedifferentieerde neuronen door deelneming aan positieve RNA TIA1 granules 4.
TERT- wordt uitgedrukt en zich hoofdzakelijk bezighield met somatische delende cellen en in de meeste vormen van kanker, terwijl het enzym expressie en activiteit niveaus strak zijn geregeld in niet-delende cellen 5,6. Studies hebben aangetoond dat in de rOdent hersenen, telomerase-activiteit niet herkend door postnatale dag 10, terwijl TERT mRNA wordt op lagere niveaus in de volwassenheid 7. Andere studies toonden telomerase activiteit in de volwassen sub-ventriculaire zone, de bulbus olfactorius, de hippocampus en in de volwassen cortex en cerebellum 8. We hebben onlangs aangetoond dat nieuwe verbindingen die telomerase expressie en activiteit te verhogen in de hersenen en ruggenmerg uitgeoefend neuroprotectieve effecten in N-methyl-D-aspartaat (NMDA) - geïnjecteerde muizen vertraagde het ontstaan en de progressie van amyotrofische laterale sclerose ziekte in SOD1 transgene muizen en verhoogde de overleving van motorische neuronen in het ruggenmerg van deze muizen 9. Om volledig de pro-survival rol van telomerase in neuronen en in de hersenen, is het essentieel om een eenvoudige en relatief gevoelig snelle test voor het detecteren van telomerase-activiteit in de verschillende gebieden van de hersenen ontwikkelen.
De telomeer rEPEAT amplificatie protocol (TRAP) is een bekende gevoelige test combineert de canonieke activiteit van telomerase en de polymerase kettingreactie (PCR). In deze assay, telomerase voegt TTAGGG herhaalt een telomerase substraat (TS primer) oligonucleotide, gevolgd door PCR-amplificatie waarbij 6 baseparen (bp) DNA-ladder met de TS reverse primer genereert -. ACX 32P gemerkte dCTP worden gebruikt om te detecteren lage hoeveelheid PCR producten. De DNA ladder wordt opgelost door sequentiebepaling polyacrylamide gelelektroforese (PAGE). Zowel de intensiteit van de DNA-banden en de lengte van de DNA ladder weerspiegelen de hoeveelheid actief enzym moleculen en hun processivity respectievelijk 10.
Dit traditionele test houdt een aantal grote problemen: Het gevaar van blootstelling aan radioactieve stoffen, grote en moeilijk te sequencing PAGE en de tijd het verbruik van de gel lopen en blootstelling van het radioactieve product film verwerken ('s nachts in beide gevallen). Dit protocol biedt een verbeterde niet-radioactieve agarose mini-gel gebaseerde bepaling. De DNA 6 bp ladder wordt opgelost met 4,5% hoge-resolutie agarose gel en de detectie wordt bereikt met zeer gevoelige nucleïnezuur vlek. De combinatie van het gebruik van hoge resolutie agarose mini-gel en gevoelige nucleïnezuur kleuring biedt eenvoudig te hanteren assay, wordt voorkomen van blootstelling aan radioactiviteit en aanzienlijk verkort overall duration assay van 3 dagen tot enkele uren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierproeven werden goedgekeurd door de ethische commissie voor dierproeven in de Ben-Gurion Universiteit (IL-39-08-2010).
1 Mouse Brain Eiwitextractie
- Bereid 3 buisjes van 15 ml die elk 5 ml Ringer's oplossing en plaats buisjes op ijs.
- Offer de muis met behulp van isofluraan anesthesie (LET OP - Gebruik van chemische kap) gedurende 10-20 sec gevolgd door cervicale dislocatie en onmiddellijke onthoofding.
- Verwijder de hersenen uit de schedel en spoel een paar seconden met ijskoude Ringer's oplossing om schade aan het hersenweefsel voorkomen.
- Met een chirurgisch mes, scheid de cerebellum (CR) en hersenstam (BS) van de frontale cortex. Vervolgens scheiden de kleine hersenen van de hersenstam en snijd de frontale kwab (FL) van de frontale cortex; verwijder het reukorgaan van de frontale kwab. Plaats de 3 gebieden van de hersenen in de aangewezen 15 ml buizen.
- Homogeniseer het weefsel in elke buis. Fr toevoegenoplossing ESH ijskoud Ringer's zodat elke buis bevat hetzelfde volume en centrifugeer gedurende 7 min bij 800 x g.
- Verwijder het supernatant en voeg 100 pl CHAPS lysis buffer aan elke buis. Meng goed door de oplossing enkele malen (~ 10) door een 1 ml spuit met een 21 G naald en incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
- Breng de inhoud van elke buis in nieuw micro-centrifugebuis en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 13.000 x g. Breng de bovenstaande om een nieuwe micro-centrifugebuis en bepalen van de eiwitconcentratie met behulp van een eerder vastgestelde methode. Bewaar de eiwitextracten in aliquots van 10 pi bij -80 ° C.
2 TRAP Assay Voorbereiding van instrumenten, Reaction Solutions, en Protein Verwatering Berekeningen
- Bereid juiste aantal gelabelde micro-centrifuge buizen voor proteïne-extract verdunningen en telomerase reactie buffer. Voer alle pipetteren in het protocol met behulp van filter tips om besmetting te voorkomen. Ontdooi de volgende oplossingen op het ijs: TRAP reactie mix 10x, TS primer, dNTP's, UPW en proteïne-extracten (zie tabel van materialen voor reagentia en reagentia concentraties).
- Verdun de oplossing van het eiwit extract tot een eindconcentratie van 1 ug / ul met ultrazuiver water (UPW).
3 Telomerase Reaction
- Bereid telomerase reactiemengsel door toevoeging van de volgende opties om een micro-centrifugebuis: 2 pi TRAP mix (10x), 1 ui TS primer (0,1 ug), 1 ui dNTPs (10 mm) en 15 ul UPW. Voor meerdere monsters, vermenigvuldig bovengenoemde volumes door het aantal monsters, plus 1.
- Voeg 19 ul van het reactiemengsel aan elke reageerbuis en voeg 1 pl van het verdunde proteïne extract (1 ug eiwit) aan elke buis voor een eindvolume van 20 pi.
- Plaats de reageerbuisjes in een 30 ° C voorverwarmd waterbad gedurende 45 minuten.
4. PCR Reaction
- Vijftien min voor het einde van de telomerase reactie ontdooien de volgende oplossingen: ACX primer, Titanium Taq buffer, UPW.
- Bereid PCR reactie mix door het toevoegen van de volgende opties om een micro-centrifuge buis: 2,5 ul Titanium Taq Buffer (10x), 1 ui ACX primer (0,1 ug), 2 pi UPW (1 pi bij IC wordt gebruikt) en 0,5 ul Titanium Taq Polymerase (50x). Voor meerdere monsters, vermenigvuldig bovengenoemde volumes door het aantal monsters plus 2.
- Voeg 6 ul van de PCR-mix elke PCR-buis en voeg het gehele volume van de telomerase reactiemengsel (20 pi) aan elke buis voor een eindvolume van 26 pi.
- Plaats de PCR-buisjes om een PCR thermo fietser en start het volgende programma:
- 90 ° C - 2 min.
- 94 ° C -. 30 sec *
- 60 ° C -. 30 sec *
- 72 ° C -. 45 sec *
- 72 ° C - 2 min.
WINKEL PCR producten bij -20 ° C.
* = 34 cycli
5. Agarose Mini-gel Voorbereiding, Monsters Hardlopen, en gelkleuring
- Voeg 25 ml gekoelde elektroforese buffer (TBE) en een roerstaaf in een bekerglas dat 2-4 maal het volume van de bufferoplossing en langzaam strooi 1,125 g van de hoge-resolutie (HR) agarose poeder terwijl de oplossing snel geroerd . Verwijder het roerstaafje, dek het bekerglas af met een plastic folie en prik in een klein gaatje voor de ventilatie. Verhit de beker in de magnetron op "Low" stroom voor 3 min en dan overschakelen op "Hoog" kracht en verwarm de oplossing in korte pulsen met zorg niet te leiden tot morsen. Merk op dat wanneer het schuim door verhitting wordt grote bellen en verdwijnt na een paar seconden, de agarose klaar.
- Zet de gel een horizontale mini-gel apparaat, nadat de gel stolt bij kamertemperatuur zodat de gel te koelen gedurende 20 minuten bij 4 ° C vóór gebruik.
- Laad elke baan met 25 ul van TRAP monster (20 ul TRAP PCR-producten en 5 ul 6x gel-loading dye) en lopen op 110 V gedurende 3 uur in een 4 ° C koude kamer.
- Bereid nucleïnezuur vlek 3x werkende oplossing door het toevoegen van 15 pi 10,000x nucleïnezuur vlek, stock oplossing tot 50 ml dubbel gedestilleerd water (DDW) met 0,1 M NaCl (0,29 g). Vlekken op de gel gedurende 20 minuten onder voorzichtig schudden.
- Gebruik UV transilluminator met 302 nm golflengte aan de TRAP ladder DNA-banden te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele cellen eiwitextracten werden bereid uit de frontale kwab (FL), hersenstam (BS) en cerebellum (CR), verkregen uit 3 CD-1 vrouwelijke en 3 mannelijke CD-1-muizen op de leeftijd van 1 en 3 maanden voor de gewijzigde TRAP assay en 3 CD-1 mannelijke muizen op de leeftijd van 2 maanden oud voor de radioactieve TRAP assay. Telomerase-activiteit werd gedetecteerd in 1 ug eiwit extract met behulp van de gemodificeerde TRAP-test en 2 pg eiwitten te extraheren voor de radioactieve TRAP assay. Detectie van telomerase-activiteit door de radioactieve TRAP assay en door de gemodificeerde TRAP assay toont aan dat een betere visualisatie en oplossing van het DNA telomerase producten wordt waargenomen met de gemodificeerde test zoals gezien door de duur en intensiteit van de DNA-ladder (Figuur 1A vs. 1C en 1D). Een geleidelijke vermindering van het telomerase DNA producten wordt waargenomen wanneer dalende concentraties van eiwitextracten verkregen uit glioblastoma U-251 cellijn werd gebruikt suggesteken de gevoeligheid van de gemodificeerde TRAP-assay voor de detectie van telomerase activiteit bij lagere concentraties van eiwitten extraheren (Figuur 1B).
Een significant hogere telomerase-activiteit wordt waargenomen in de FL en BS regio vergeleken met de CR in 3 maanden oude vrouwtjes en mannetjes zoals blijkt uit de intensiteit van de DNA-banden en de lengte van de DNA ladder producten. Bovendien is aangetoond dat in de muis overgang naar volwassenheid telomerase activiteit neemt in de FL en toename van het BS en CR (figuur 1D). Vergelijking tussen de seksen blijkt dat de FL telomerase-activiteit is hoger bij vrouwen in tegenstelling tot de BS en CR die hogere telomerase-activiteit bij mannen.
In weefsels tot expressie lage niveaus van telomerase-activiteit hebben wij gevonden dat de detectie van de DNA-ladder met PCR efficiënter zonder de interne controle (IC) primer, aangezien de IC gebruikt de TS als een voorwaartse primer dus interfereren met de DNA-ladder versterking. De reproduceerbaarheid van de gegevens wordt bereikt door het herhalen elk experiment meerdere malen.
Figuur 1 Telomerase activiteit in de hersenen van muizen: Traditioneel versus bewerkt TRAP assay. A) Telomerase activiteit in 3 hersengebieden door radioactieve TRAP assay (2 maanden oude CD-1 mannelijke muizen, 2 ug eiwit extract). B) Gevoeligheid van de gemodificeerde TRAP assay wordt getoond door dalende concentraties van de eiwitten geanalyseerd extract verkregen uit glioblastoma U -251 cellijn. C, D) Telomerase activiteit in 3 hersengebieden 1 (C) en 3 (D) maanden oude CD-1 vrouwelijke en mannelijke muizen. Het DNA ladder vanaf de 50 bp band in stappen van 6 bp. (NC - negatieve controle, IC- interne controle, BS - hersenstam, CR - cerebellum, FL - frontale kwab).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse van telomerase-activiteit in de hersenen van muizen via de TRAP assay bestaat uit 4 belangrijke stappen: 1) proteïnen extractie uit specifieke gebieden van het hersenweefsel 2) TS primerverlenging door telomerase - telomerase reactie 3) amplificatie van het telomerase reactieproducten door PCR 4 ) scheiding van de PCR producten met behulp van hoge resolutie agarose gel.
Deze gemodificeerde TRAP assay worden twee belangrijke problemen die ontstaan uit de traditionele assay: het gebruik van radioactieve dCTP voor gevoelige detectie van de PCR producten en PAGE scheiding van de DNA ladder. Hoge resolutie agarosegel vereenvoudigt de detectie van de telomerase reactieproducten (de DNA ladder) vergeleken met de moeilijk sequencing PAGE verwerken. Bovendien, het nucleïnezuur kleuring is een niet-toxische oplossing met hoge gevoeligheid nodig voor de detectie van kleine hoeveelheid DNA.
Speciale aandacht moet worden besteed aan de volgende kritische stappen: 1) Waarbij de tijd tussen het verwijderen van weefsel en homogeniseren tot een minimum eiwit integriteit behouden 2) CHAPS lysis buffer opnieuw bevriezen te vermijden 3) eiwit fragmenten in porties bewaard en eenmaal ontdooid voor gebruik. Vermijd opnieuw invriezen van monsters.
Problemen kunnen optreden tijdens de gel bereidingsstap aangezien hoge concentratie agarose gel is gevoelig voor overloop en vereist aandacht tijdens het koken. De techniek heeft verschillende beperkingen voor de noodzaak van het uitvoeren van de gel in een koude kamer. Bovendien kan de kleine hoeveelheid PCR producten niet worden weergegeven op een UV tafel.
Telomerase activiteit varieert tussen verschillende weefsels en is laag in de hersenen. Dit protocol biedt een meer gevoelige detectie werkwijze te vergelijken met de traditionele radioactieve assay waardoor betere detectie van telomerase-activiteit in de hersenen. Hoewel verschillende tijd-efficiënte methoden zijn beschikbaar (een stap TRAP testkits, met behulp van een labeled TS primer voor detectie) deze methoden zijn aanzienlijk duurder. Bovendien is het gebruik van agarose elimineert de giftig gebruik van polyacrylamide gel.
Zoals blijkt uit de representatieve resultaten met de hierboven beschreven werkwijze is het mogelijk om de verschillen in telomerase activiteit tussen de verschillende gebieden van de hersenen en tussen mannelijke en vrouwelijke tonen. Deze methode kan worden gebruikt voor het detecteren van telomerase-activiteit in andere normale weefsels met lage telomerase-activiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRAP Mix (10x) | Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTPs (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
References
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
