Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Rapid génotypage des animaux Suivi par Établir des cultures primaires de neurones du cerveau

doi: 10.3791/51879 Published: January 29, 2015
* These authors contributed equally

Summary

Nous décrivons les procédures pour l'étiquetage et le génotypage des souris nouveau-nés et de générer des cultures de neurones primaires d'eux. Le génotypage est rapide, efficace et fiable, et permet pour l'extraction de l'acide nucléique automatisé. Ceci est particulièrement utile pour les souris néonatale létales et leurs cultures qui nécessitent l'achèvement préalable de génotypage.

Abstract

Analyse à haute résolution de la morphologie et la fonction des neurones de mammifères nécessite souvent le génotypage des animaux individuels, suivie par l'analyse des cultures primaires de neurones. Nous décrivons un ensemble de procédures pour: l'étiquetage souriceaux nouveau-nés pour être génotypés, le génotypage rapide, et l'établissement de cultures à faible densité de neurones du cerveau de ces souris. Souris individuels sont repérés par le tatouage, ce qui permet une identification à long terme durable à l'âge adulte. Génotypage par le protocole décrit est rapide et efficace, et permet l'extraction automatisée des acides nucléiques avec une bonne fiabilité. Ce est utile dans des circonstances où le temps suffisant pour le génotypage conventionnelle ne est pas disponible, par exemple, chez les souris qui souffrent de létalité néonatale. Cultures de neurones primaires sont générés à faible densité, qui permet des expériences d'imagerie à haute résolution spatiale. Cette méthode de culture nécessite la préparation de couches nourricières gliales avant le placage neuronale. Le pPROTOCOLE est appliquée dans sa totalité à un modèle de souris de la dystonie trouble du mouvement DYT1 (souris knock-in-torsinA AE), et les cultures neuronales sont préparées à partir de l'hippocampe, le cortex cérébral et le striatum de ces souris. Ce protocole peut être appliqué à des souris avec d'autres mutations génétiques, ainsi que pour d'autres espèces d'animaux. En outre, les composants individuels du protocole peut être utilisé pour les sous-projets isolés. Ainsi ce protocole aura de larges applications, non seulement en neurosciences, mais aussi dans d'autres domaines des sciences biologiques et médicales.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

des modèles de rongeurs de maladies génétiques se sont révélés utiles dans l'établissement des fonctions physiologiques normales de protéines et d'acides nucléiques, ainsi que les conséquences pathophysiologiques de défauts de ceux-ci. Des exemples comprennent les souris déficientes pour des protéines impliquées dans des fonctions cellulaires clés, ainsi que des modèles murins de maladies telles que la maladie d'Alzheimer. Cependant, certaines manipulations génétiques peuvent conduire à létalité néonatale peu ou quelques jours après la naissance. Dans ces cas, des cultures de cellules primaires sont un outil important parce que les cellules vivantes peuvent être obtenus auprès des chiots embryonnaires ou néonatales avant la mort, ils peuvent être conservés pendant au moins quelques semaines in vitro, et pendant ce temps le développement neuronal début peuvent être suivies par expériences biochimiques, morphologiques et fonctionnelles. Pour les cultures primaires, il peut être bénéfique à l'assiette les neurones à faible densité; ce qui permet de visualiser le soma individuel, dendrites, arbres axonales et le nerf termisignaux à haute résolution spatiale. Toutefois, la survie et la différenciation des neurones à faible densité nécessite généralement qu'ils sont étalées sur une couche nourricière gliale, co-cultivées avec des cellules gliales en l'absence de contact physique avec eux, ou cultivées dans du milieu conditionné par des cellules gliales 1.

L'établissement de faible densité des cultures de neurones sur des couches nourricières gliales peut dépendre rapide et fiable génotypage préalable - dans un peu d'heures à la différence de quelques jours. La vitesse est particulièrement importante lorsque le génotype neuronal doit être adaptée à celle d'une couche d'alimentation gliale préparé à l'avance. A titre d'exemple plus pratique, il peut être nécessaire de décider lequel des chiots qui génotype à utiliser dans des cultures de production, afin d'optimiser l'efficacité d'une expérience.

Ici, nous démontrons le protocole de travail qui a été utilisé pour le génotypage de la souris rapide, simplifiée et fiable dans les publications précédentes 2-6. Queues de souris etun kit disponible dans le commerce sont utilisés. Ce protocole comprend une seule étape d'extraction d'acides nucléiques à partir du tissu, et ne nécessite ni une étape de purification des acides nucléiques, ni l'utilisation d'un tampon de terminaison («stop solution"). La fiabilité de cette méthode de génotypage est illustré en présentant les résultats d'une série d'essais lorsque des différences sont introduites par rapport à la quantité de départ des échantillons, l'âge de l'animal et la longueur des amplicons PCR. Ce kit offre les avantages de l'extraction et la fiabilité automatisé.

Par souci d'être complet, l'utilisation du tatouage d'identification à long terme des souris génotypés est également démontrée. Le tatouage est réalisé par application d'une encre de tatouage dans le derme de la peau (sous l'épiderme) 7. Un procédé est décrit pour le tatouage les coussinets des pattes de souris nouveau-nés ou de vieux un jour, bien que les tatouages ​​peuvent être appliqués à d'autres parties du corps, telles que les queues et les orteils, et animals de tous âges. En outre, les procédures seront montrées pour le placage et la culture de neurones de souris à une faible densité, sur la base de la préparation optimisée des différents types de couches nourricières gliales 2,8.

On utilise un modèle de souris génétique du trouble neurologique héréditaire DYT1 dystonie - un trouble du mouvement autosomique dominante causée par une mutation dans le gène de TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. La protéine codée, torsinA, fait partie des "ATPases associées à diverses activités cellulaires" (AAA +) de la famille des protéines, dont les membres accomplissent généralement des fonctions de chaperon, en aidant à: dépliement des protéines, la protéine complexe de démontage, le trafic membranaire, et la fusion des vésicules 10-13. Les résultats de mutation dans une délétion en cadre d'un codon pour l'acide glutamique, et peuvent conduire à la manifestation de «l'apparition précoce de la dystonie généralisée isolé» 14,15. Cependant, la voieophysiological mécanismes responsables de cette maladie sont encore mal compris. Dans un modèle de souris knock-in, l'allèle mutant est Tor1a tm2Wtd, mentionné ci-après comme Tor1a AE. Hétérozygote AE-torsinA souris knock-in sont des patients humains viables et génétiquement imitent avec DYT1 dystonie, alors homozygote souris knock-in meurent après la naissance 16,17, avec la latence à mort postnatale touchés par bagage génétique 18. La mort précoce de souris knock-in homozygote nécessite que tant l'analyse génotypique des animaux et l'établissement de cultures de neurones sont achevées rapidement. Comme autre exemple de génotypage, TFAP2A (facteur de transcription AP-2α, la protéine de liaison d'activation activateur 2α) sera utilisée. La protéine codée par ce gène est important dans la régulation de nombreux processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation, la survie et l'apoptose 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NOTE: Toutes les procédures animales effectuées dans cette étude ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de l'Iowa.

1. identification à long terme des souris en utilisant tatouage les coussinets

  1. Immobiliser une patte avec le coussinet (surface plantaire) face à l'expérimentateur. Maintenez la patte avec le pouce et l'index. Veillez à ne pas pincer la patte.
    NOTE: Stable immobilisation est important de veiller à ce que le pigment de tatouage est placé dans le derme de la coussinet, et est donc permanent 7.
  2. Badigeonner le coussinet avec 70% d'éthanol sur une éponge ou un tampon de gaze.
  3. Appliquer de l'huile de la peau pour un applicateur de coton-tige, et appuyez doucement la pointe contre la surface de la tablette de la patte à plusieurs reprises. Utilisez seulement une petite quantité d'huile de la peau; lorsqu'il est présent en grandes quantités, elle permet d'éviter le pigment de tatouage d'atteindre la peau.
  4. Tremper les pointes des aiguilles de tatouage dans l'encre de tatouage juste avantau tatouage. Utilisez propre, aseptique et aiguilles de tatouage pointus, à diminuer la douleur et la possibilité de l'infection, et aussi pour augmenter l'efficacité de tatouage.
  5. Bien que la surface de coussinet est couvert avec l'huile de la peau, appuyez sur les pointes d'aiguilles de tatouage verticalement et légèrement contre la peau dans le centre du pavé de la patte, et injecter l'encre plusieurs fois. Voir la Table des Matières / Equipement pour informations sur le système de tatouage électrique.
  6. Vaporiser éthanol à 70% sur une éponge de gaze, appuyez doucement contre la patte pour enlever le pigment de tatouage supplémentaire sur la surface de la peau, et d'inspecter la qualité de tatouage. Vérifiez que le milieu de coussinet a une tache ronde sombre qui diffère de la pigmentation de la peau normale. Si le tatouage ne est pas sombre ou assez grand pour le visionnement facile, répétez les étapes de tatouage antérieures.

2. Les souris nouveau-nés génotypage utilisant un kit de génotypage PCR rapide

  1. Désinfecter l'extrémité distale d'une queue de souris avec 70% d'éthanol, couper 5 mm ou moins de la queueincliner et de le transférer dans un tube d'une bande de 8 tubes du type utilisé pour la PCR. Utilisez une lame de rasoir de non-utilisé pour chaque chiot à éviter la contamination croisée entre les spécimens. Sinon, utilisez une paire de ciseaux, mais dans ce cas, avec soin et enlever complètement le tissu restant sur les lames en utilisant 70% d'éthanol. Vérifiez saignement. En cas de saignement, appliquer une pression sur la partie de coupe de la queue avec une éponge de gaze jusqu'à ce saignement se est arrêté.
  2. Ajouter 200 pi de solution d'extraction de l'ADN à chaque tube PCR contenant un spécimen. Voir la Table des Matières / Equipement pour sa composition et des informations sur le kit.
  3. Placer la bande tubulaire dans un cycleur thermique de PCR, et démarrer l'extraction d'ADN en utilisant le programme suivant: 1 cycle à 55 ° C pendant 10 min, 1 cycle à 95 ° C pendant 10 min, et maintien à 4 ° C.
    NOTE: Ce est le même cycleur thermique PCR qui est ensuite utilisé pour la PCR.
  4. Après l'extraction d'ADN est terminée, retirez la bande de tube de l'un cycleur thermiquee inverser 5 fois.
  5. Transfert 4 pi de la solution (extrait d'ADN) de chaque échantillon à un non utilisés tubes d'une bande 8 tube, et mélanger avec: 10 pi de 2X PCR Ready Mix II, 2 pi de mélange de l'avant et marche arrière amorces (recommandé au 0,5 uM; voir le tableau des matériaux / équipement pour les séquences), et 4 pi de sans nucléase H 2 O, pour chaque spécimen. Centrifuger brièvement (par exemple, 3 sec) à l'aide d'une centrifugeuse de table. Gardez les tubes sur la glace en tout temps, sauf lors de la manipulation.
  6. Effectuer le cyclage thermique. Voir Table des Matières / Equipement pour le programme thermique.
  7. Détecter les produits d'ADN amplifiés. Charger la solution de réaction totale de la PCR (20 ul) directement dans un puits de gel d'agarose. Charger les marqueurs de poids moléculaire dans un puits séparé. Appliquer un champ électrique.
  8. Acquérir les images de fluorescence des bandes sous une lumière ultraviolette.

3. Culture primaire de cerveau de souris Neurons sur gliales Feeder couche

REMARQUE: Les procédures de dissection du cerveau et de la dissociation de la cellule (3,1) sont communs à toutes les procédures ultérieures. Les procédures de cultures gliales de la souris (3,2), cultures de cellules gliales de rat (3,3), et des cultures de neurones de souris (3,4) sont décrits séparément par la suite.

  1. Dissection du cerveau et cellulaire Dissocaiation
    1. Sacrifiez une souris ou rat chiot par décapitation, retirez rapidement le cerveau, et le placer dans une solution de Hanks (voir le tableau 1 pour la composition) + 20% de sérum de veau fœtal (FBS) dans une boîte de 35 mm (conservé dans la glace).
    2. Couper le cerveau à travers la ligne médiane en deux hémisphères. Retirer la région d'intérêt (par exemple, le cortex cérébral, le striatum et hippocampe) de chaque hémisphère de cerveau. Retirez les méninges et les principaux vaisseaux sanguins de la surface. Couper la région du cerveau en 4-10 fines tranches à l'aide d'une lame chirurgicale.
    3. Rincer les tranches de cerveau dans un tube à centrifugation de 15 ml, une fois espritLa solution de + 20% de FBS, puis 3 fois avec de l'Hanks h la solution de Hanks (ie sans sérum) (le tout à 4 ° C). Pour rincer, ajouter 5-10 ml de solution, laisser le cerveau tranches se déposent au fond du tube, aspirer la solution par le haut, et ajouter une solution fraîche. Terminez la procédure de rinçage par aspiration de la solution.
    4. Filtre à 2 ml de la solution de digestion contenant de la trypsine (voir le tableau 1 pour la composition) en utilisant une seringue de 3 ml et d'un filtre à seringue de 0,2 um, et ajouter le filtrat directement dans le tube contenant les tranches de cerveau. Laissez le trypsinisation dérouler pendant 13 min à température ambiante.
    5. Neutraliser la solution de trypsine première par aspiration la plus grande partie, puis en ajoutant 7 à 10 ml d'une solution de Hanks + 20% de FBS (4 ° C).
    6. Rincer les tranches de cerveau, deux fois avec une solution de Hanks + 20% de FBS, puis trois fois avec la solution de Hanks (sans sérum) (le tout à 4 ° C). Terminez la procédure de rinçage par l'aspiration du solution.
    7. Filtre à 2 ml de la solution de dissociation (voir le tableau 1 pour la composition) en utilisant une seringue de 3 ml et d'un filtre à seringue de 0,2 um, et ajouter le filtrat directement dans le tube avec les tranches de cerveau.
    8. Mécaniquement dissocier les cellules par trituration doucement 10-20 fois, jusqu'à ce que les morceaux de tissu visibles disparaissent. Utilisez une pipette Pasteur polie au feu coton branché et éviter de faire des bulles lors de la trituration.
    9. Attendre 3 min pour les petites pièces se installer.
    10. Transférer la majorité de la solution (~ 1,5 ml, ce qui laisse une solution en bas) à un tube de 15 ml de centrifugation qui contient 3 ml de solution de Hanks solution de FBS + 20% (4 ° C), en utilisant le coton branché, au feu polie pipette Pasteur. Ne pas transférer toute la solution parce que l'inclusion de tout sédiment au fond se traduit généralement par la détérioration de la culture.
    11. Centrifugeuse pour 13 min à ~ 185 g (~ 1100 rpm) à 4 ° C.
    12. Aspirer délicatement le surnageant,ajouter 1 ml de pré-chauffé milieu d'étalement (37 ° C) de la pastille, et remettre en suspension en pipetant doucement plusieurs fois en utilisant le coton branché, polie au feu pipette Pasteur.
      REMARQUE: Trois types de milieux d'étalement différents sont utilisés à différentes fins de culture: placage moyen 1 pour les cellules gliales de la souris, le placage moyen 2 pour les neurones de souris, et le placage à moyen 3 de neurones de rat et de cellules gliales (voir le tableau 1 pour des compositions) .
    13. Sortez 10 ul de la suspension cellulaire, mélanger avec 10 pi de solution de bleu de trypan 0,4%, et de mesurer la densité de cellules vivantes, en utilisant soit un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé.
  2. Cultures souris gliales
    1. Laver les lamelles pour aider à établir des cultures saines de cellules de souris.
      1. Plonger des lamelles de verre (rond, diamètre 12 mm) dans de l'acide nitrique à 70% dans une boîte de Pétri en verre. Protéger de la lumière en utilisant une feuille d'aluminium, et le placer sur une orbitale agitateur O / N.
      2. Rincer le coversli de verreps dans la boîte de Pétri au moins trois fois à l'eau distillée. Plongez-les dans de l'eau distillée. Placer le plat sur un agitateur orbital O / N.
      3. Sécher les lamelles sur un papier filtre Whatman 150 mm dans le cabinet de sécurité biologique.
      4. Autoclave les lamelles.
      5. Placez les lamelles dans 24 puits boîte de culture.
    2. Souriceaux nouveau-nés d'étiquettes et de génotype selon les étapes 1 et 2.
    3. Obtenir les cellules du cerveau des souriceaux, selon l'étape 3.1.
      REMARQUE: L'utilisation du cortex cérébral est typique pour préparer la couche souris gliale d'alimentation. Toutefois, d'autres régions du cerveau, telles que l'hippocampe et le striatum, travailleront après ajustement approprié de la densité cellulaire en raison de différents nombres et les rendements des cellules provenant de différentes régions.
    4. Ajouter ~ 4 ml de pré-chauffé placage moyen 1 de la suspension cellulaire finale (~ 1 ml). Pour pré-réchauffement des milieux de culture, placer la solution dans l'incubateur de culture (5% de CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, àlaisser les valeurs de température et de pH se stabilise.
    5. Transférer la suspension cellulaire à un flacon de culture T25 non couché, en utilisant le coton-branché, polie au feu pipette Pasteur. Placer la fiole dans l'incubateur de culture.
    6. A un jour in vitro (DIV), rincer les cellules en culture dans le flacon T25 à deux reprises avec une moyenne de placage (4 ° C). Placer le ballon de nouveau dans l'incubateur. Effectuer rinçage par aspiration du milieu dans le flacon complètement avec une pipette Pasteur, en ajoutant environ 5 ml de milieu frais et en inclinant doucement le flacon plusieurs fois en un mouvement tourbillonnant.
    7. À 6-9 DIV, (ce est à dire, un jour avant la trypsine et le placage sur des lamelles, dans les étapes 3.2.8-3.2.13), placer 100 pi du matériau de revêtement avec des protéines de la matrice extracellulaire (voir le tableau des matériaux / équipement pour les commentaires sur le matériau de revêtement) sur les lamelles de verre dans une boîte de culture, et placer la boîte de culture dans l'incubateur de culture.
    8. A 7-10 DIV, lorsque les cellules sont 20-40% de confluence (spatialement continue), Trypsiniser eux.
      1. Rincer la fiole une fois, tout en aspirant la solution dans le ballon et l'ajout de ~ 13 ml d'une solution de Hanks (4 ° C), incliner doucement le flacon plusieurs fois en un mouvement tourbillonnant, et aspirer la solution totalement.
      2. Ajouter 40 ul de solution de DNase (concentration finale de 750 unités / ml) à 4 ml de solution de trypsine-EDTA, passer la solution à travers un filtre à seringue de 0,2 um, et ajouter le filtrat directement aux cellules dans le flacon.
      3. Laissez le trypsinisation procéder pour 13 min à 37 ° C dans l'incubateur.
      4. Neutraliser la solution de trypsine par addition de 2 ml de 100% de FBS (4 ° C) dans le ballon.
      5. Transférer les cellules trypsinisées dans un tube de 15 ml par centrifugation en utilisant un cycle de 5 à 10 ml pipette, ajouter ~ 4 ml d'une solution de Hanks + 20% FBS (4 ° C), centrifuger à ~ 185 g et 4 ° C pendant 13 min et aspirer le surnageant.
    9. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de la pré-warmeune moyenne d placage.
    10. Mesure de la densité des cellules selon l'étape 03.01.13.
    11. Aspirer le matériau de revêtement complètement des lamelles de verre et la plaque ~ 50 ul des cellules gliales remises en suspension sur des lamelles.
      NOTE: Ces cellules vont établir la couche d'alimentation gliale.
    12. Placer la boîte de culture avec des lamelles dans l'incubateur.
    13. 20-60 min plus tard, ajouter 1 ml de pré-chauffé placage moyen 1 dans chaque puits, et placez le plat dans l'incubateur. Remarque: Bien que le moyen de plaquage est ajouté, il sera utile d'utiliser une autre pipette à appuyer sur la périphérie de la lamelle (où il n'y a pas de cellules étalées), de sorte que la lamelle couvre-objet ne sera pas flotter dans le milieu.
    14. A une DIV de la couche d'alimentation gliale (par exemple, sur la lamelle de verre), remplacer le milieu par 1 ml de pré-chauffé placage moyen 1, en ​​aspirant la totalité de la solution dans un puits et en remplissant ensuite avec du milieu frais.
    15. À 2-3 DIV de la couche d'alimentation gliale lorsque le cells sont de 80 à 100% de confluence, ajouter un inhibiteur mitotique (10 ul d'un mélange de 5-fluoro-2'-désoxyuridine + uridine; des concentrations finales de 81,2 et 204,8 uM, respectivement) dans chaque puits, pour inhiber la replication de l'ADN et donc à supprimer la prolifération cellules gliales.
    16. A 9.7 DIV, lorsque les cellules sont confluentes à 90 à 100% (2/1 h avant l'étalement des neurones sur la couche d'alimentation des cellules gliales), remplacer le milieu de culture préchauffé avec placage moyen-2 (37 ° C).
      REMARQUE: Les neurones sont étalées sur le même jour, en utilisant l'étape 3.4.
  3. Cultures Rat gliales
    1. Manteau de un flacon de culture T25 avec le même matériau de revêtement.
      NOTE: Ceci est nécessaire pour le retrait ultérieur de cellules non-adhérentes à l'étape 3.3.5.
      1. Ajouter 2,0 ml de la matière de revêtement dans le ballon, et placer le ballon dans un incubateur de culture.
      2. Après 3/2 heure, aspirer le matériau de revêtement complètement, de telle sorte que la surface du ballon devient sec.
    2. Obtenir les cellulesdes ratons, selon l'étape 3.1.
      REMARQUE: La région CA3-CA1 de l'hippocampe est utilisé pour préparer la couche d'alimentation gliales de rat. Toutefois, d'autres régions du cerveau, comme le cortex cérébral et le striatum, travailleront après ajustement des différences de densité cellulaire due à différents numéros et les rendements des cellules provenant de différentes régions.
    3. Ajouter ~ 4 ml de pré-chauffé placage à moyen 3 de la suspension cellulaire finale (~ 1 ml).
    4. Transférer la suspension cellulaire dans le flacon de culture T25 revêtu, à l'aide de coton-branché, polie au feu pipette Pasteur. Placer la fiole dans un incubateur de culture (5% de CO 2 95% de O 2, 37 ° C).
    5. À 2-3 DIV, lorsque les cellules sont 20 à 40% de confluence, retirez non adhérente ou faiblement cellules adhérentes, en fermant le couvercle bien en agitant vigoureusement ~ 10 fois, aspiration de la solution, et en ajoutant 4-5 ml de plaquage moyen 3 (à 4 ° C). Répétez cette procédure une fois. Examiner les cellules cultivées à travers tout l'étage du flacon (par exemple,en utilisant un microscope à contraste de phase) pour confirmer que ceux qui apparaissent neuronale (par exemple, ceux pour lesquels le bord extérieur du corps de la cellule apparaît phase claire) sont complètement enlevés. Répétez la procédure aussi souvent que nécessaire pour supprimer ces cellules, puis retourner le ballon à l'incubateur.
      NOTE: La force et le nombre total de «shakes» requises peuvent différer entre les expérimentateurs individuels. La chose importante est de ne pas garder le nombre total de shakes à un numéro de série, mais pour confirmer que les cellules analogues à des neurones sont éliminés.
    6. À 6-8 DIV, lorsque les cellules sont de 90 à 100% de confluence, les passage des cellules gliales en les trypsinisation comme à l'étape 3.2.8.
    7. Après centrifugation, remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu d'étalement-3 (4 ° C), ajouter 10 ml de milieu d'étalement-3 (4 ° C), transférer les cellules trypsinisées dans un flacon T75 non revêtu, et la culture eux l'incubateur.
      REMARQUE: les cellules gliales de rat seront repiquées deux fois; En revanche, les cellules gliales de la souris are des passages qu'une seule fois, car ils deviennent insalubres après de multiples passages. Les cellules gliales de rat seront soumises à des passages dans des flacons T75 qui ne sont pas revêtues avec ne importe quel matériau de revêtement. Le revêtement permet aux cellules gliales de rat de grandir trop vite et donnent de nombreuses cellules ciliées (cellules épendymaires putatifs), qui se détérioreront la condition de culture neuronale plus tard.
    8. À 17-19 DIV de culture dans un flacon gliale (par exemple, 11 jours après repiquage, et un jour avant traitement à la trypsine et placage sur des lamelles par étapes 3.3.9-3.3.14), placer 100 ul de la matière de revêtement sur ​​des lamelles de verre non lavés ( rond, diamètre 12 mm) dans une boîte de culture, et de placer la boîte de culture dans l'incubateur de culture.
      NOTE: Pour les cultures gliales de rat, une différence n'a pas été remarqué dans les résultats de la culture avec ou sans se laver les lamelles.
    9. À 18-20 DIV de culture dans un flacon gliale (par exemple, 12 jours après repiquage), préparer la couche d'alimentation gliale par trypsinisation des cellules en culture, selon la rep 3.2.8.
    10. Pendant la centrifugation, aspirer le matériau de revêtement complètement des lamelles de verre.
    11. Après centrifugation, remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu d'étalement-3 (4 ° C), et mesurer la densité de cellules, selon l'étape 03.01.13.
    12. Ajuster la densité des cellules gliales à 10 4 cellules / ml en direct, et la plaque 100 pl de la suspension de cellules gliales sur les lamelles de verre revêtues.
      NOTE: Ces cellules vont établir la couche d'alimentation gliale.
    13. Placez la boîte de culture avec des lamelles dans l'incubateur pour les 20-60 min.
    14. Ajouter 1 ml de milieu d'étalement-3 (4 ° C) dans chaque puits, et placez le plat dans l'incubateur.
    15. A 4.3 DIV de la couche d'alimentation gliale, lorsque les cellules sur la lamelle sont de 40 à 80% de confluence, ajouter 1 ml de milieu de culture préchauffé (voir le tableau 1 pour la composition) qui contient la cytosine β-D-arabinofuranoside ( AraC, concentration finale de 4 pM) pour arrêter la prolifération des cellules gliales. Plate neurones à 9.7 DIV de la couche d'alimentation lorsque les cellules gliales sont 60 à 80% de confluence, en utilisant l'étape 3.4.
  4. Cultures souris neuronaux
    1. Souriceaux nouveau-nés d'étiquettes et de génotype selon les étapes 1 et 2.
    2. Utilisez les souriceaux pour l'étape 3.1.
    3. Ajuster la densité de la suspension des cellules vivantes à 2,0 x 10 ~ 5 cellules / ml en utilisant préchauffé placage moyen 2 pour le placage sur les cellules gliales de la souris, ou à l'aide de placage moyen 3 pour le placage sur des cellules gliales de rat.
    4. Plaque les cellules sur la couche nourricière gliale, en ajoutant doucement la suspension de cellules dans le milieu de culture de chaque puits. Remarque: Le volume de la suspension cellulaire à ajouter est déterminée par le nombre cible de cellules dans un puits de culture. Par exemple, plaque de ~ 60 pi de suspension de cellules pour atteindre 12 000 cellules / puits.
    5. Notez qu'aucune modification de solutions sont nécessaires après que les neurones sont étalées. Soyez prudent pour éviter l'évaporation de la solution dans les puits au cours de la culture, en humidifiant l'intérieur of l'incubateur de culture.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Comme exemple de l'application de ce protocole, des résultats représentatifs sont présentés pour l'étiquetage des souris par le tatouage, le génotypage fiable dans diverses conditions expérimentales, et l'établissement de cultures de neurones primaires sur des couches nourricières gliales.

Tatouage

Les nouveau-nés ont été marqués sur les coussinets en utilisant un système de tatouage ('nouveau-né' de la figure 1). Les étiquettes sont restées clairement visible à trois semaines ('3-semaine-vieux ») et 32 ​​semaines d'âge ('32 semaines à l'avance-old'). Les souris individuelle peut être identifié de manière unique par une combinaison de tatouages ​​sur les quatre pattes (numéros 1 à 16) et par les informations sur la cage pour animaux, ou plans de numérotation plus complexes (non représenté).

Génotypage

Un exemple représentatif de génotypage se affiche (Figure 2). Le gène Tor1a de type sauvage (Tor1a (Tor1a + / AE) et homozygote (Tor1a AE / AE) des souris knock-in AE-torsinA été amplifié à partir de l'ADN génomique isolé à partir queue clips de nouveau-nés. Génotypage dans cet exemple spécifique est basé sur la présence d'un seul site loxP de 34 paires de bases dans l'allèle mutant Tor1a succès après recombinaison Cre et la suppression d'une cassette de résistance à la néomycine 16,18.

L'ADN génomique a été extrait avec un minimum de mains sur le temps, et de nombreux échantillons ont été traités simultanément. Les volumes d'extraction ont été maintenus constants, et donc pas de réglage du volume est nécessaire pour tenir compte des changements dans les conditions testées. La fiabilité de génotypage a été testée dans quatre conditions, comme détaillé ci-dessous.

Premièrement, l'effet des différences dans la quantité de tissu de départ a été examiné (figure 3). Tails de différentes longueurs ont étépréparé à partir de l'hétérozygote AE-torsinA souris knock-in (Tor1a + / AE) à l'âge de sevrage (~ 3 semaines). longueur de la queue de 2 à 5 mm, la gamme généralement recommandée dans les protocoles de génotypage, ont donné le même résultat de génotypage de haute qualité. Les deux bandes correspondent au type sauvage et allèles mutés (Tor1a + et Tor1a AE, respectivement).

Deuxièmement, les effets de la variabilité de l'âge de l'animal ont été examinés (figure 4). Tails ont été obtenus à partir de nouveau-né, 3-semaine-vieux et ~ 24 semaines, âgé AE-torsinA hétérozygote souris knock-in (Tor1a + / AE). Homozygotes ne ont pas été utilisés parce qu'ils meurent quelques jours après la naissance 16-18. Les deux bandes attendues pour de type sauvage et les gènes mutés Tor1a étaient visibles indépendamment de l'âge des animaux (figure 4A). L'applicabilité générale de ce résultat a été testé en utilisant un second gène, TFAP2A 19 à l'état sauvage t-Des souris (ype TFAP2A + / +) (figure 4B).

Troisièmement, les effets des différences de longueur des amplicons de PCR ont été testés (Figure 5). A cet effet, différentes paires d'amorces ont été synthétisées pour un gène donné, de sorte que les ADN amplifiés ont des longueurs différentes de paires de bases. Le gène a été constamment TFAP2A détectée avec différentes longueurs d'amplicon.

Quatrièmement, les deux méthodes d'extraction de l'ADN ont été comparées (Figure 6). Dans un procédé, des tubes en forme de bande de PCR et le cycleur thermique de PCR ont été utilisées (décrit dans l'étape 2). Ce est un parallèle méthode d'extraction multi-tubes automatisé ("Auto" dans la figure 6). Étant donné que plusieurs tubes peuvent être traités simultanément dans le format de bande, et une machine de PCR est utilisé avec un programme pour faire fonctionner en quatre étapes de température, il ne est pas nécessaire de transférer les tubes, manuellement modifier la température lors de l'extraction ou l'utilisation de multiples piècesde l'équipement. Ainsi, il est facile de traiter de nombreux échantillons. Ceci a été comparé à la seconde méthode basée sur l'emploi, l'extraction à tube unique («Manuel» sur la figure 6). Il utilise des tubes individuels de PCR et machines non-PCR séparées (blocs de chaleur et des bains d'eau) pour contrôler la température lors de l'extraction d'ADN. Dans ce cas, les tubes simples, plusieurs ont été transférés à une nouvelle température après chaque étape, nécessitant de multiples appareils de commande de température. Dans les deux cas, le gène a été analysée dans Tor1a de type sauvage, hétérozygotes et homozygotes AE-torsinA souris knock-in (Figure 6A), et le gène TFAP2A a été analysé chez des souris de type sauvage (figure 6B). Les deux protocoles d'extraction ont donné des résultats de génotypage équivalentes.

En résumé, les résultats présentés sur les figures 3 à 6 montrent que la méthode de génotypage est robuste, l'obtention de résultats fiables et reproductibles en dépit de variations dans le montant de tissus, âge de l'animal, la longueur de l'amplicon, et le protocole d'extraction utilisée.

Cultures de neurones

Pour la culture de neurones de souris sur la couche d'alimentation de cellules gliales de la souris, l'ordre des procédures est: (souris nouveau-né de tatouage → génotypage pour la culture des cellules gliales →) la culture des cellules gliales → tatouage souris nouveau-né → génotypage pour la culture neuronale → culture neuronale. Pour les cultures établies sur la couche nourricière de cellules gliales de rat, les procédures indiquées entre parenthèses sont ignorés.

Nous avons examiné l'effet favorable de la couche d'alimentation gliale pré-tête de série sur la survie neuronale et la croissance. Les neurones ont été obtenus à partir de la région CA3-CA1 de l'hippocampe, la région du moteur de cortex cérébral et le striatum de souris de type sauvage nés. Elles ont été étalées à faible densité sur des cellules gliales de rat couche d'alimentation qui a été obtenu à partir de la région CA3-CA1 de l'hippocampe et ensemencées avant le placage neuronal, selonle schéma illustré sur la figure 7 (résumé simplifié de la procédure). Cultures à faible densité sont optimales pour l'imagerie des dendrites individuelles, somata 4,6, les terminaisons nerveuses 2,3,5,8 et 5 axonales arbres à haute résolution spatiale. Les cellules de l'hippocampe (contenant à la fois des neurones et des cellules gliales) ont été étalées sur des lamelles de verre revêtues, soit avec (figure 8A) ou sans une couche nourricière gliale pré-établi (figure 8B, C) ​​et observées avec une optique à contraste de phase. En présence d'une couche d'alimentation gliale près confluentes, les neurones (dans chaque panneau, une flèche indique un neurone de représentant) ont été relativement dispersés 3 et 7 jours après placage (jours in vitro, DIV) (figure 8A). Ils ont également montré des signes de bonne santé, comme une marge nette d'soma neuronale, dendrites étendus, un manque de soma en cluster, et un manque de neurites groupés (à fort grossissement images dans des encarts). Au 14 DIV, ces neurones formés un réseau dense caractérisé par de longs neurites (dendrites et des axones). Notez que la prolifération des cellules gliales a été inhibée avant neurones ont été étalées, par addition de milieu de croissance contenant de l'AraC inhibiteur mitotique (étape 03/03/15).

En revanche, en l'absence de la couche d'alimentation gliale au moment de placage neurones de l'hippocampe, la croissance des neurones hippocampiques en culture a été altérée, même en l'absence d'AraC. À 3 DIV, les cellules gliales (inclus dans les cellules de l'hippocampe nouvellement plaqué) ne ont pas formé une feuille confluentes (astérisque dans le panneau supérieur de la figure 8B). Les cultures ont montré plusieurs signes qui ne sont pas appropriées pour les études d'imagerie à haute résolution, telles que de vastes zones sans cellules gliales sous-jacents (astérisque), la présence de soma cluster et la présence de neurites groupés dans certains domaines (données non présentées). En sept DIV, les cellules gliales formés une feuille confluentes (panneau du milieu de la figure 8C). However, les neurones étaient moins nombreux que lorsque les neurones ont été étalées sur une couche nourricière gliale pré-établi. Les neurones survivants manquaient également, neurites formant réseau de long (en médaillon). Les cellules gliales ont été plus hétérogène de courbure et de l'épaisseur que ceux de la culture de la couche d'alimentation, apparaissant ainsi en phase lumineuse. Afin de tester les effets de la suppression de la prolifération gliale sur les neurones, nous avons appliqué AraC contenant un milieu de croissance. Lorsque l'AraC a été ajouté sur 3 ou 7 DIV et les cellules ont été cultivées jusqu'à 14 DIV et observé sur ce jour (figure 8B et C, panneaux inférieurs), les cellules gliales couverts plus de la surface de la lamelle. Cependant, les neurones étaient encore peu nombreux, surtout quand AraC a été appliqué à sept DIV. Les neurones survivants ne avaient que des processus courts et ne ont pas été largement connectés. Ainsi, la fin plus de AraC permis une couche uniforme gliale pour former, mais n'a pas favorisé la viabilité neuronale ou l'extension des neurites; plutôt la croissance incontrôlée des cellules glialeseu des effets délétères sur les neurones.

Ces données montrent que la couche d'alimentation gliale est critique pour la survie et la croissance des neurones étalées à faible densité, et que la couche gliale doit être présent au moment de l'étalement des neurones que plus tard au cours de la culture des neurones. Des résultats similaires ont été obtenus avec des cultures de cortex cérébral (figure 9) et les neurones du striatum (figure 10).

L'observation qualitative de la survie neuronale a été confirmée par analyse quantitative. Plus précisément, le nombre de neurones survivants à 14 DIV a été compté, à partir d'images en contraste de phase de la culture (figure 11). Le nombre était plus grand pour les neurones cultivés sur une couche nourricière gliale (ie., Plaqué sur la couche d'alimentation gliale). Le nombre était plus faible dans le cas des neurones en culture en l'absence d'une couche nourricière gliale. Le nombre a été réduit encore davantage lorsque les cellules ont été traitées avec AraC à uneultérieurement. Ces différences étaient statistiquement significatives, et ont été observées dans des cultures de neurones obtenus à partir de chacune des trois régions du cerveau.

Les types de cellules survivantes ont été identifiés au 14 DIV chez la souris hippocampe cultures étalées sur la couche rat hippocampe d'alimentation. Double-immunocytochimie a été réalisée en utilisant des anticorps contre le marqueur neuronal, une protéine associée aux microtubules 2 (MAP2), et le marqueur astrocytaire des cellules gliales, la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP). Les cellules avec les processus étendus étaient positifs pour MAP2, alors que les cellules de la couche sous-jacente d'alimentation gliales étaient positifs pour GFAP (deux champs d'images représentatives, figure 12A). Cette coloration ne était pas un artefact d'une combinaison spécifique des anticorps primaires et secondaires, parce que le même schéma a été obtenue lorsque un ensemble différent d'anticorps secondaires a été utilisé (figure 12B).

En revanche, lorsque la même coloration a été performé sur les cultures consistant en seulement une couche nourricière gliales, ce est à dire, en l'absence de cellules de souris supplémentaires (deux champs d'image représentatives, Figure 13A), aucune des cellules étaient positives pour MAP2. Les cellules de la couche d'alimentation ont été constamment positif pour GFAP. Pour un contrôle négatif, deux anticorps primaires ont été omis de la procédure immunocytochimique (Figure 13B). Aucune coloration n'a été détectée dans ces échantillons, bien que les cellules étaient présents, comme en témoigne l'optique lumineux transmis (interférence différentielle de contraste, DIC) et de coloration nucléaire avec le colorant Hoechst. Ainsi, la coloration non spécifique dans les canaux de MAP2 et GFAP était très faible.

Ces données immunocytochimiques ont également été analysées quantitativement (figure 14). Dans chaque image de 8 bits, l'intensité a été mesurée et tracée le long d'une ligne. Parcelles superposées révèlent MAP2 coloration lorsque les cellules de souris (échantillons contenant les neurones) ont été cultivées sur une couche nourricière gliale (+ Neuron,glie +, l'anticorps primaire (1 ° Ab) de +), que cette coloration est absent dans les cultures de cellules nourricières gliale seuls (Neuron -, + glie, 1 ° Ab +). Dans un contrôle négatif sans anticorps primaires, la coloration était négligeable dans des cultures de cellules nourricières gliale seuls (Neuron -, la glie +, 1 ° Ab -). GFAP coloration était apparente dans la couche d'alimentation gliale, indépendamment du fait que les cellules de souris ont été étalées (Neuron +, cellules gliales +, 1 ° Ab +) ou non (Neuron -, + glie, 1 ° Ab +). Encore une fois, la coloration dans le contrôle négatif était négligeable (Neuron -, la glie +, 1 ° Ab -). Ces résultats montrent que la couche d'alimentation gliales de rat était composé principalement d'astrocytes, et que les neurones étaient présents seulement quand des cellules de souris ont été ajoutés. Ils indiquent également que les neurones présents dans ces cultures proviennent uniquement de la souris.

La Section de la vidéo en ligne des résultats montre aussi les images DIC et MAP2 de neurones cultivés étalées sur une couche nourricière gliale, boe préparé à partir de la région hippocampique CA3-CA1 de souris de type sauvage.

Pour un contrôle précis de la culture cellulaire, il est recommandé de mesurer la densité de cellules vivantes, à la fois pour évaluer la qualité générale de la dissection des cerveaux et les étapes de dissociation cellulaire, et pour le placage des cellules à la densité prédéterminée. Voici la liste des quatre séries de mesures typiques de densité. Notez, cependant, que ces nombres peuvent varier en fonction des conditions de culture et les réactifs. Par exemple, même différents lots de sérum du même fournisseur peuvent affecter les résultats. Ainsi, ces chiffres doivent être considérés comme un indicateur général, plutôt que d'une directive absolue.

Pour la dissociation cellulaire (étape 3.1.13), des valeurs typiques pour la densité des cellules vivantes obtenu d'un chiot sont: ~ 2 x 10 5 cellules / ml (souris du cortex moteur et CA3-CA1 souris hippocampe), ~ 5 x 10 5 cellules / ml (cortex cérébral de souris et le rat des hippocampe CA3-CA1), et 1 x 10 ~ 6 cElls / ml (striatum de souris). Dans tous ces cas, les fractions de cellules vivantes étaient> 90% (viabilité, défini comme le rapport du nombre de cellules vivantes à celle du nombre total de cellules). Le cortex moteur est vaguement définie comme étant la région du cortex cérébral qui se trouve immédiatement au striatum dorsal 20. Pour les cultures hippocampiques, les régions CA3 et CA1 de l'hippocampe approprié sont préférés. L'ensemble comprend en outre l'hippocampe gyrus denté, l'inclusion de ce qui conduit à la formation de grandes terminaisons nerveuses des cellules granulaires et présente une hétérogénéité des propriétés 21 synaptiques. La culture du striatum comprend le noyau caudé-putamen et le globus pallidus, mais ne inclut pas le noyau accumbens, ou en dedans ou noyaux septaux latéraux dans les structures voisines.

Pour la culture gliale de souris (étape 02/03/11), la densité de placage est de ~ 10 000 cellules gliales sur chaque lamelle couvre-objet de 12 mm ronde, en utilisant ~ 50 pi de suspension de cellules à une densité de 2 x ~10 5 cellules / ml. Habituellement, la densité mesurée dans le surnageant est relativement constante et ne nécessite pas de réglage. Pour convertir la densité sur les différents domaines, l'information utile est que la lamelle a un diamètre de 1,20 cm et une surface de 1,13 cm 2. Ainsi, ~ 10 000 cellules / lamelle = ~ 8800 cellules / cm 2 sur une lamelle.

Pour la culture des cellules gliales de rat (étape 03/03/12), la densité de placage est d'environ 1000 cellules gliales sur chaque lamelle couvre-objet de 12 mm ronde, en utilisant ~ 100 ul de suspension de cellules à une densité de 1x10 ~ 4 cellules / ml. Ainsi, 1.000 cellules / lamelle = ~ 900 cellules / cm 2 sur une lamelle.

Pour les souris à faible densité culture neuronale (étape 3.4.4), la densité de placage est comprise entre 2 000 et 48 000 cellules par puits d'une plaque à 24 puits. Les valeurs typiques où placage neurones sur les cellules gliales de rat sont: 10,000-24,000 cellules / puits pour les neurones corticaux cérébraux, 12,000-24,000 cellules / puits pour CA3-CA1 neurones de l'hippocampe et 24,000-48,000 cellules / puits pour les neurones du striatum. Lorsque le placage sur les cellules gliales de la souris, le nombre est réduit, par exemple, 2000 cellules / puits pour CA1-CA3 neurones de l'hippocampe. Comme une note de côté, pour le placage rat CA3-CA1 neurones de l'hippocampe sur une couche nourricière de cellules gliales de rat, la densité de placage est 1,000-6,000 cellules / puits. Pour la conversion de la densité dans un puits à la densité sur une lamelle couvre-objet, l'information utile est que le diamètre interne du puits au fond est de 1,56 cm et sa superficie est de 1,91 cm 2. Ainsi, par exemple, 12 000 cellules / puits = 7100 cellules / lamelle = 6300 cellules / cm 2 sur une lamelle. Ces densités ont été choisis dans le but de culture de neurones relativement clairsemées pour l'imagerie cellulaire à haute résolution. Les chercheurs devraient choisir leurs numéros qui conviennent le mieux à leurs objectifs expérimentaux.

Figure 1
Figure 1. coussinets tatoués de souris. Newborn souris ont été marqués par un tatouage les coussinets. Ils ont été photographiés immédiatement après le tatouage (nouveau-né), à 3 semaines d'âge (3 semaines d'âge) et à 32 semaines d'âge (32 semaines d'âge). Les étiquettes sont restées facilement visibles à l'âge adulte. Les images ont été prises à partir de différents animaux. Ils ne sont pas représentés à la même échelle. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Le génotypage de type sauvage (Tor1a + / +), hétérozygote (Tor1a + / AE) et homozygote (Tor1a AE / AE) AE-torsinA souris knock-in. Les allèles de gènes Tor1a ont été analysés dans de type sauvage et mutant formes, en utilisant l'ADN extrait des queues des nouveau-nés. Ttous les conseils étaient ~ 4 mm de longueur. L'ADN a été coloré en utilisant SYBR Safe DNA Gel Stain. Voir la Table des Matières / Equipement pour les informations sur les amorces et programme de cyclage thermique pour gène Tor1a. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Détection de l'ADN génomique dans le contexte de la variation de la quantité de matière de départ. Conseils queue de longueurs différentes ont été utilisées. Animaux testés étaient trois-semaines-vieux, hétérozygote AE-torsinA souris knock-in (Tor1a + / AE). Les lignes représentent les longueurs de queue 2, 3, 4 et 5 mm, en double exemplaire (à gauche). Les conseils de la queue ont été obtenus à partir de souris différentes. Poids moléculaire des marqueurs de taille dans la voie la plus à gauche représentent l'ADN de longueurs steps de 100 paires de bases. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Détection de l'ADN génomique dans le contexte de la variation de l'âge des animaux. Gène (A) Tor1a. Lanes représentent conseils de queue obtenues à partir hétérozygote AE-torsinA souris knock-in (Tor1a + / AE) aux étapes suivantes: nouveau né, 3-semaine-vieux, et ~ 24 semaines d'âge (en double de gauche à droite) (B). TFAP2A gène. Lanes représentent conseils de queue obtenues à partir de type sauvage (+ / + TFAP2A) souris sur les étapes suivantes: nouveau né, 3-semaine-vieux, et ~ 24 semaines d'âge (en double partir de la gauche). Les deux gènes ont été amplifiés à partir de queues ~ 4 mm de longueur. Le fragment PCR attendu 498 pb. Le programme wa PCR est la même que celle utilisée pour le gène Tor1a. Se il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Détection de l'ADN génomique dans le contexte de la variation de la longueur de l'amplicon de PCR. Le gène TFAP2A a été analysé avec des longueurs de PCR d'amplicon de 498 pb (voies gauche), 983 pb (les voies du milieu) et 1990 pb (les voies de droite) dans doublons. Le gène a été amplifié à partir de queues de souris à 3 semaines d'âge. Poids moléculaire des marqueurs de taille dans les voies les plus à gauche et les plus à droite du gel représentent des longueurs d'ADN par pas de 100 et 200 paires de bases, respectivement. Voir la Table des Matières / Equipement pour des informations sur les amorces pour différents amplicons. 879fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. La détection de l'ADN génomique dans le contexte de la variation de la méthode d'extraction d'ADN. Les résultats pour l'emploi, l'extraction à tube unique (manuel), et les méthodes d'extraction multi-tubes parallèles automatisés (Auto) sont comparées. Cette dernière méthode a été utilisée dans ce rapport. Les gènes ont été amplifiés à partir de queues ~ 4 mm de longueur, recueillies auprès des nouveau-nés. (A) gène Tor1a dans les nouveau-nés de AE-torsinA souris knock-in. Lanes représentent ADN extraites de type sauvage (manuelle et automatique), hétérozygote (manuelle et automatique), et les souris homozygotes (manuelle et automatique) (de gauche à droite). (B) gène TFAP2A en 3-semaine-vieux souris de type sauvage. Le fragment PCR attendu 498 pb.jove.com/files/ftp_upload/51879/51879fig6highres.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7. simplifié, illustration schématique des procédures de placage neurones de souris sur la souris (A) et le rat (B) des couches nourricières gliales. Les nombres de jours (jours in vitro) font référence aux jours cumulatifs après que les cellules gliales sont d'abord étalées dans la culture flacons. Ils servent seulement comme une estimation approximative. Pour plus de détails pratiques, voir les procédures section. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8
Figure 8. Effet de soutiende couche nourricière gliale sur la croissance des neurones hippocampiques en culture basse densité. Les neurones ont été obtenus à partir de la région CA3-CA1 de l'hippocampe de souris de type sauvage du nouveau-né. cellules de l'hippocampe (A) de souris ont été étalées sur des lamelles de verre revêtues, qui a été pré-ensemencé avec une couche nourricière de cellules gliales de rat obtenu à partir de la région CA3-CA1 de l'hippocampe. Les neurones ont été réparties de façon égale d'une manière saine. Les cultures ont été observées à 3, 7 et 14 DIV. Cellules de l'hippocampe (B, C) ​​de souris ont été étalées sur des lamelles de verre revêtues, qui ne avaient pas de couche d'alimentation pré-établi. Les cultures ont été observés à 3 DIV (panneau supérieur en B) et 7 DIV (panneau du milieu en C) sans traitement AraC. En d'autres ensembles de cultures, les cellules ont été traitées avec AraC au 3 DIV (de panneau de fond en B) et 7 DIV (panneau inférieur en C), et observés à 14 DIV. Toutes les images représentent des cultures sœurs issus de la même petits, dont les neurones ont été étalées sur le même jour. Voir le texte pour plus de détails. Pour chaque panneau, un examplement d'un neurone est indiqué par une flèche blanche et magnifié dans un encart. Les neurones ont des corps cellulaires dont le périmètre se affiche lumineuse lorsqu'il est vu par une optique à contraste de phase, et ils ont aussi des processus d'épaisseur. Les astérisques indiquent les zones sans cellules gliales. Les cultures ont été imagées en direct sur ​​un microscope inversé utilisant une optique à contraste de phase avec 20X objectif (ouverture numérique de 0,45) sans lentille intermédiaire (c.-à 1x). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9
Figure 9. effet de soutien de couche nourricière gliale sur la croissance des neurones de cortex cérébral dans une culture de faible densité. Des résultats similaires comme sur la figure 8, mais avec les neurones obtenus à partir de la région du moteur de ccortex erebral. Les conditions sous étiquettes AC correspondent à ceux de la figure 8. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 10
Figure 10. Effet de soutien de couche nourricière de cellules gliales sur la croissance des neurones striataux en culture à faible densité. Des résultats similaires que dans les figures 8 et 9, mais avec les neurones obtenus à partir du striatum. Les conditions sous étiquettes AC correspondent à ceux de la figure 8. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 11. Effet de soutien de couche nourricière gliale sur la survie neuronale. Le nombre de neurones survivants a été compté dans les expériences illustrées à la figure 8, en utilisant des images acquises par microscopie à contraste de phase. Images pour 14 DIV sont présentés ici, mais avec des pointes de flèches pointant vers des exemples de neurones comptés. Le graphique à barres indique le nombre de neurones par champ d'image (449,0 x 335,5 um um) (moyenne ± écart-type de la moyenne, n = 7-24 champs pour chaque condition de culture). Les astérisques indiquent les différences statistiquement significatives de «couche nourricière gliale (-), AraC le 3 DIV» et «couche nourricière gliale (-), AraC le 7 DIV 'de' couche gliale d'alimentation (+)» (* p <0,05, ** p <0,01, le t -test de Student non apparié). Les chiffres ci-dessus les barres indiquent la densité neuronale mesurée dans des montages de champs d'images multiples. Images étaientacquise en utilisant un objectif 20X. Pour éviter les biais d'acquisition, toutes les images ont été acquises le long d'une bande verticale totale, de haut en bas d'une lamelle couvre-objet et passant par le centre approximatif de la lamelle. Les images individuelles avaient un certain chevauchement (par exemple, 1/6 à 1/4 d'un champ d'image en haut et en bas). Deux méthodes ont été utilisées pour l'analyse. Dans l'une, les neurones ont été comptés en alternance les images pour faire en sorte que les neurones individuels ne étaient pas comptés plus d'une fois. Les chiffres obtenus ont été utilisés pour générer le graphique à barres. Dans la seconde méthode, un seul montage a été créé à partir des images individuelles. Ils ont été cousues en utilisant le Microsoft Image Composite Editor ou manuellement à l'aide de Photoshop. Les montages également exclus de multiples chefs d'accusation les mêmes neurones. Les chiffres obtenus sont indiqués au-dessus des barres. Dans les deux méthodes, de vastes zones à la périphérie de lamelle qui ne contenaient pas toutes les cellules ont été exclus. Les cellules ont été comptés comme neurones se ils avaient des corps cellulaires qui semblaient lumineuxpar microscopie à contraste de phase, ainsi que les processus cellulaires étendus. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 12
Figure 12. identification immunocytochimique de types de cellules dans des cultures de neurones. La condition de culture correspond à l'image en bas à gauche de la figure 8A. Les neurones ont été obtenus à partir de la région CA3-CA1 de l'hippocampe de souris de type sauvage, et étalées sur une couche gliale d'alimentation produite à partir de la région CA3-CA1 de l'hippocampe de rats de type sauvage. Les cellules cultivées ont été analysés par immunohistochimie pour le marqueur MAP2 neuronale et l'astrocytaire gliale marqueur de cellule GFAP. Contraste interférentiel différentiel (DIC) microscopie a été utilisé pour révéler la morphologie générale des champs de représentation, de 14 à 17jours après les neurones ont été étalées sur la couche nourricière gliale. (A) de trois couleurs coloration, y compris les contre-coloration nucléaire avec le marqueur colorant Hoechst 33342. Deux champs d'image représentatifs sont présentés. (B) coloration bicolore, avec différentes combinaisons d'anticorps secondaires conjugués avec différents fluorophores. Dans ces expériences, les cellules cultivées ont été fixées avec du paraformaldehyde à 4% et 4% de saccharose dans la solution de Tyrode (contenant, en mM: 125 NaCl, 2 de KCl, 2 de CaCl2, 2 MgCl2, 30 le D-glucose, 25 HEPES, pH 7,4 ajusté avec du NaOH 5 M, ~ 310 mOsm sans adaptation) pendant 30 min à 4 ° C. Après avoir été lavé avec une solution de Tyrode, ils ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans une solution de Tyrode à 10 min. Ils ont été à nouveau lavées avec une solution de Tyrode et ensuite bloquées avec 2% de sérum de chèvre normal dans du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS) (solution de blocage) pendant 60 min à température ambiante. Par la suite, ils ont été traités avec le poly de lapinanticorps monoclonal anti-MAP2 (AB5622; 400x dilution dans une solution de blocage), et anticorps monoclonal de souris anti-GFAP cocktail (NE1015; 1,000x dilution) O / N (15 à 21 heures) à 4 ° C. À la suite de lavages avec du PBS, les cellules ont été incubées avec des anticorps de chèvre anti-lapin et l'anticorps anti-IgG de souris conjugué à Alexa Fluor 405 (500x dilution dans une solution de blocage), Alexa Fluor 488 (1,000x) ou Alexa Fluor 568 colorant (500x) pour 60 min à température ambiante. Ils ont été lavées avec PBS et ensuite observés directement dans du PBS. Dans certaines cultures, après le lavage final dans les procédures ci-dessus, les cellules ont été traitées avec Hoechst 33342 à 0,5 pg / ml dans du PBS pendant 10 min à température ambiante, et lavés avec du PBS avant l'observation. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 13
Figure 13. Immuidentification nocytochemical de types de cellules dans gliales cultures de couches nourricières. des cultures sœurs des couches nourricières gliales de rat qu'à la figure 12, mais sans le dépôt de neurones de souris. (A) coloration en utilisant les procédures immunocytochimiques décrites sur la figure 12A. Deux champs d'images représentatives sont affichées. (B) La coloration de la couche d'alimentation gliales en utilisant les procédures décrites dans immunocytochimiques A, mais avec les anticorps primaires omises. Toutes les images MAP2 dans les figures 12A et 13A, B ont été acquises dans les mêmes conditions d'imagerie, et sont présentés dans le même contraste d'image pour permettre la comparaison de l'intensité. Les mêmes modes opératoires ont été utilisés pour les images de GFAP sur les figures 12A et 13A, B. La culture de la couche d'alimentation a été reproduite sur des cellules gliales, le même jour que les cultures de la figure 12. Ainsi, les couches d'alimentation en gliales 13 ont été cultivées in vitro pour la même quantité de temps. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 14
Figure 14. L'intensité de la coloration immunocytochimique. Lignes ont été tracées sur les images représentées dans les figures 12 et 13, et l'intensité a été long de ces tracés. Encarts montrent des images de la rangée supérieure de la figure 12A. Les trois conditions sont: 1) le placage des cellules de souris (contenant des neurones) sur une couche nourricière de rat et la coloration avec les anticorps primaires (Neuron +, cellules gliales +, 1 ° Ab +), 2) couche d'alimentation gliale uniquement (pas de placage neuronale) et la coloration avec les anticorps primaires (Neuron -, la glie, + 1 ° Ab +), et 3) l'alimentation glialeer couche uniquement (pas de placage neuronale) et la coloration sans anticorps primaires (Neuron -, la glie +, 1 ° Ab -). Coloration neuronale (MAP2) était présent uniquement lorsque des cellules de souris ont été étalées (conditions 1 contre 2), et la coloration gliale (GFAP) était présent dans les deux ensembles de cultures (conditions 1 vs 2). La coloration immunocytochimique était spécifique aux deux anticorps primaires (conditions 1 contre 3). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

SOLUTIONS
Tampon TAE (50x de solution)
Tris base, 486 g
L'acide acétique glacial, 114,2 ml
EDTA 0,5 M, pH 8,0, 200 ml
Ajouter de l'eau distillée pour porter le volume total à 2 L
Make up dans une hotte chimique.
Diluer 50 fois avant utilisation.
Une solution de Hanks
Les sels équilibrés de Hanks, sans chlorure de calcium, le sulfate de magnésium et bicarbonate de sodium (pour 1 L)
NaHCO 3, 350 mg (concentration finale 4,17 mM)
HEPES, 2,38 g (concentration finale 10 mM)
Ajuster le pH à 7,4 en utilisant du NaOH 5 M.
Réglez osmolarité à 310 mOsm en utilisant le saccharose (osmolarité tend à ~ 290 mOsm sans aucun réglage).
Ajouter de l'eau distillée pour porter le volume total à 1 L
solution de digestion (par traitement à la trypsine du tissu cérébral)
NaCl, 800,6 mg (concentration finale 137 mM)
KCl, 37,3 mg (fconcentration Inal, 5 mM)
Na 2 HPO 4 · (7H 2 O), 187,6 mg (concentration finale, 7 mM)
HEPES, 595,8 mg (concentration finale, 25 mM)
Glucose, 97,3 mg (concentration finale, 5,4 mM)
Ajuster le pH à 7,2 en utilisant du NaOH 5 M.
Osmolarité tend à ~ 310 mOsm sans aucun ajustement.
Ajouter de l'eau distillée pour porter le volume total à 100 ml.
Juste avant l'utilisation, ajouter 20 mg de trypsine (concentration finale de 10 mg / ml) et 20 ul de DNase (concentration finale de 750 unités / ml) à 2 ml de solution de digestion.
solution de dissociation (par dissociation mécanique d'un tissu du cerveau)
Une solution de Hanks
MgSO 4 · (7H 2 O), 295,1 mg (concentrations d finalesur, 11,97 mM)
Ajuster l'osmolarité de 310 mOsm à l'aide de saccharose.
Le volume total est de 100 ml.
Juste avant l'utilisation, ajouter 20 ul de DNase (concentration finale de 750 unités / ml) à 2 ml de solution de dissociation.
Placage moyen 1 (pour les cellules gliales de la souris)
Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), 449,5 ml
MITO + Sérum Extender, 0,5 ml
FBS, 50 ml
Le volume total est de 500 ml.
Moyen 2 placage (pour les neurones de souris)
Neurobasal-A, 485 ml
B27, 10 ml
GlutaMAX-I, 5 ml (concentration finale, 2 mM)
Le volume total est de 500 ml.
Moyen 3 placage (pour les neurones de rat et des cellules gliales)
Médias essentiel minimum (MEM, sans rouge de phénol)
Le glucose, 2,5 g (concentration finale de 27,8 mM)
NaHCO 3, 100 mg (concentration finale 2,38 mM)
La transferrine, 50 mg
FBS, 50 ml
GlutaMAX-I, 5 ml (concentration finale, 2 mM)
L'insuline, 12,5 mg
Le volume total est de 500 ml.
Le milieu de croissance (pour les neurones de rat et des cellules gliales)
MEM (sans rouge de phénol)
Le glucose, 2,5 g (concentration finale de 27,8 mM)
NaHCO 3, 100 mg (concentration finale 2,38 mM)
La transferrine, 50 mg
FBS,25 ml
GlutaMAX-I, 1,25 ml (concentration finale, 0,5 mM)
B27 ou NS21 {Chen, 2008 # 2399}, 10 ml
Cytosine β-D-arabinofuranosidiques (ARAC), 0,56 mg (concentration finale, 4 pm)
Le volume total est de 500 ml.
Observations générales
Nos milieux de culture ne contient pas d'antibiotiques, car ils peuvent avoir des effets cytotoxiques sur les cellules gliales et les neurones en culture (de référence 70, 71). Il est donc particulièrement important de respecter les procédures stériles dans le travail lié à la culture.
Voir la Table des réactifs pour les sources détaillées de produits chimiques.

Tableau 1. Solutions

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Le protocole présenté ici inclut des procédures pour le tatouage d'étiqueter / identifier les souris, pour le génotypage des souris de conseils de la queue, et pour la culture de neurones du cerveau de la souris à faible densité. Dans une série d'expériences utilisant 6-8 chiots, ces procédures exigent généralement ~ 0,5 h, ~ 4 h et ~ 2 heures, respectivement, à un total de 6-7 heures. Cela rend pratique pour une seule expérimentateur pour terminer toutes les procédures nécessaires à partir du moment de la naissance de chiots au bordé de cultures de neurones - en moins d'une journée de travail (à l'exception de la préparation préalable de couches nourricières gliales).

Tatouage

Identification à long terme des animaux est nécessaire aux fins de l'élevage et des études scientifiques tels que des analyses de l'histologie, la fonction des cellules et le comportement des animaux. Tatouage animaux nouveau-nés est avantageuse car elle peut être effectuée rapidement et dure beaucoup plus de la vie de l'animal 7,22-25. Tattooing sur les coussinets des pattes peut être mieux que orteil écrêtage 23 par rapport à la préservation de comportements vérifiables, par exemple en suspension ou de préhension 22,26, bien que certaines études ne ont pas noté de telles déficiences (par exemple, 25). Il n'y avait aucun cas de rejet ou de mères cannibaliser petits après le tatouage. Pour les autres méthodes d'identification à long terme des animaux, voir récents 7,23,24.

Génotypage

Une caractéristique critique de notre protocole est l'utilisation d'un procédé de génotypage rapide. Bien que les méthodes de génotypage similaires ont été décrits dans les rapports précédents (par exemple, 27,28), le système décrit ici comporte au moins deux améliorations. Premièrement, elle peut tolérer certaines variations dans la quantité de tissu de départ, de l'âge de l'animal, et la longueur d'amplicon. Ainsi, le génotypage peut être réalisée avec succès en utilisant des souris âgés de 1 jour et que dès l'âge de 6 mois, et peut être effectuée en utilisant unlarge éventail de paires d'amorces. D'autre part, cette méthode ne nécessite pas une solution d'arrêt pour l'étape d'extraction de l'ADN. Ceci élimine la manipulation excessive des tubes et pipetage, et permet l'automatisation parallèle multi-tubes du processus d'une machine de PCR. Le nombre de spécimens peut être étendu (par exemple, 96 échantillons) encore traitées facilement et simultanément. De plus, le type d'échantillon ne est pas limitée à queue clips; d'autres types d'échantillons qui pourraient être utilisés comprennent poinçons de l'oreille, des coupures d'orteil, début des embryons entiers, et les tissus de placenta 2-4,29,30. Espèces animales différentes peuvent également être utilisés. Ainsi, les procédures de génotypage sont fiables (reproductibles avec une faible variance intra-essai) et reproductible (faible variance inter-essai entre les courses ou entre laboratoires), et ont l'avantage d'une grande évolutivité.

Notez qu'une certaine prudence est nécessaire pour atteindre la qualité attendue des résultats. Tout d'abord, lors de l'extraction d'ADN, une grande variation dans le protocole peut dégrader les résultats.Par exemple, une réduction significative du volume de la solution d'extraction de l'ADN (par exemple, de 200 à 100 ul de l'étape 2.2) permet toujours génotypage, mais il peut réduire la fiabilité et dans une modification des résultats de la PCR. Dans ces conditions, il est recommandé de réduire le volume de l'extrait d'ADN de 4 à 2 pi, et accroître le volume de H 2 O de 2 à 4 ul de compenser la variation de volume au cours des réactions de PCR (étape 2.5). Deuxièmement, à la fin de l'extraction d'ADN, la solution peut être utilisée pour la PCR sans centrifugation immédiatement dans la plupart des cas, bien que la queue conserve sa structure générale et ne sera pas complètement décomposé. Cependant, l'inversion décrit des tubes est essentiel pour le but de dissocier l'ADN génomique à partir du tissu (étape 2.4). Il est également important d'utiliser le haut, partie claire de la solution, à l'exclusion des débris au fond du tube, car l'inclusion de celle-ci mènera à des résultats peu concluants PCR. Cesétapes seront efficaces avec un minimum de temps et d'efforts. De même, de bons résultats peuvent être obtenus par vortex activement l'échantillon (à la place des inversions) suivie d'une centrifugation et l'utilisation du surnageant. Troisièmement, après l'extraction de l'ADN, l'ADN peut être stocké à long terme (par exemple,> deux semaines). Il est recommandé de centrifuger la solution en utilisant une microcentrifugeuse (par exemple, 3,000-13,000 g à 4 ° C pendant 2 min), transférer les surnageants dans de nouveaux tubes, et de les stocker à -80 ° C. Lorsque l'extrait stocké doit être utilisé pour le génotypage, centrifuger brièvement le spécimen après décongélation, et utiliser le surnageant.

Cultures de neurones

Une autre caractéristique essentielle de notre protocole est l'utilisation d'une couche nourricière de cellules gliales établir des cultures de neurones à une densité de placage faible. Typiquement, dans des cultures primaires de neurones de cerveau de mammifère, les cellules sont étalées avec une densité relativement élevée, sur des lamelles revêtues sans gliel couche d'alimentation (par exemple, 31-39). Lorsque la densité de placage de neurones est réduit en utilisant cette méthode, le manque initial de la feuille gliale conduit à la croissance neuronale pauvres et l'extension dendritique (panneaux B, C dans les figures 8-10), comme indiqué précédemment 40-42, probablement due à une mauvaise gliale 43,44 de croissance.

Réussi, à faible densité cultures neuronales peuvent être générées par au moins trois grands types de méthodes. Dans une approche, Neurobasal moyen est utilisé comme milieu de culture. Ceci permet aux neurones de culture en l'absence d'une couche nourricière gliale, et peut être utilisé pour de faible densité cultures neuronales 45,46. Dans une seconde approche ("de type bancaire» et sa modification), les cellules gliales sont co-cultivées avec des neurones dans le même puits mais sont physiquement séparés d'eux. Dans ce contexte, les cellules gliales fournissent 'support trophique »pour les neurones sans les contactant directement1,41,42,47-49. Dans la troisième approche, les neurones sont étalées sur une couche nourricière gliale pré-établi qui soutient la croissance neuronale (par exemple, 50 à 53) (figures 8-10). En particulier, les neurones du cerveau de la souris sont étalées sur une couche nourricière gliale préparé à partir de souris ou de rats 8,34,54 41,55,56.

Nous préférons le dernier des trois approches de la culture basse densité, parce que le Neurobasal moyen peut affecter la survie neuronale 57, les cellules gliales astrocytaires seront essentiels dans la régulation de fonctions neuronales 8,58, et le contact physique entre les neurones et les cellules gliales peut-être importante. Les procédures pour la culture de cellules de souris et les cellules gliales de rat sont similaires 59,60, mais nous les avons légèrement modifié pour tenir compte de la croissance plus rapide in vitro de rat vs. cellules gliales de la souris. Les procédures pour la culture de cellules de rat ont été modifiées 61-63. L'utilisation d'un dispositif d'alimentation laye glialer à faible densité des cultures de neurones, il est nécessaire d'effectuer le génotypage rapide, afin de faire correspondre le génotype de la couche d'alimentation à celle des neurones dans la période entre les naissances de chiots et les décès néonatals ou la fin de la fenêtre de la culture (1 -2 jours après la naissance).

La culture à faible densité sur une couche nourricière gliale est également un moyen important quand on essaie de neurones de culture de petits noyaux dans le cerveau (par exemple, le locus coeruleus noradrénaline libération et le substantia nigra de dopamine libération). Ces noyaux contiennent seulement un petit nombre de neurones et inévitablement céder cultures à faible densité de 64 à 67.

Les cultures primaires sont couramment préparés dans notre laboratoire à partir de la région CA3-CA1 de l'hippocampe, la région motrice du cortex cérébral et le striatum de souris. Les mêmes procédures peuvent être utilisées pour préparer des cultures de neurones qui représente d'autres régions du cerveau, par exemple l'hippocampe entier (y comprisCOMPRIS le gyrus denté) et l'ensemble du cortex cérébral. les neurones de rat provenant de régions du cerveau telles que l'hippocampe et le locus coeruleus sont cultivées de manière similaire, en utilisant la couche d'alimentation gliales de rat. Ces neurones en culture sont généralement utilisés à 1-4 semaines in vitro, avec l'âge exact de la culture en fonction du but de l'expérience. Il est à noter que certains neurones cultivés sur une couche nourricière gliale peuvent survivre pendant plus de 10 semaines 34,68.

Un problème potentiel de basse densité cultures neuronales est que les propriétés neuronales peuvent être différents de ceux dans des cultures à haute densité ou dans les neurones in situ. La comparaison de ces systèmes prévoit la possibilité intéressant d'étudier la façon dont le développement et la maturation neuronale sont affectés par plusieurs facteurs, tels que la densité neuronale, les facteurs solubles sécrétés par les neurones, le contact neurone-neurone de, et des interactions gliales-neuronales.

En résumé, le tattooil'étiquetage de la souris à base d'ng est de longue durée, le procédé de génotypage est rapide, et le procédé de culture permet de plaquer les neurones de souris à faible densité. Le protocole décrit ici peut être appliqué dans son intégralité à d'autres espèces animales hébergeant d'autres mutations génétiques. En outre, différentes étapes du protocole peuvent être utilisés à d'autres fins. Ainsi, le protocole peut être utilisé dans un large éventail d'applications basées sur les besoins des expérimentateurs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS - tattooing
Machine Cleanser Animal Identification and Marking Systems, Inc. NMCR3 This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent Animal Identification and Marking Systems, Inc. NDAR4 This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment Animal Identification and Marking Systems, Inc. NBP01
Skin Prep Applicator Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSPA1 Q-tip.
Skin Prep solution Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSP01 This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format) EZ BioResearch LLC G2001-100
2X PCR Ready Mix II EZ BioResearch LLC G2001-100 A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial VWR BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade rpi A20090-500  We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA) Fisher BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl Dot Scientific Inc UG104-96RS  Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl Dot Scientific Inc UG2020-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl Dot Scientific Inc UG2812-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp EZ BioResearch LLC L1001 We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp EZ BioResearch LLC L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder GIBCO-Invitrogen 10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml  USA Scientific 1402-2900 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual  rpi 145660 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural USA Scientific 1605-0000 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO GIBCO-Invitrogen S33102
Tris base rpi T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement GIBCO-Invitrogen 17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated BD falcon 353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml BD falcon 353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml BD falcon 353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml BD falcon 352095
Countess (cell number counter) chamber slides GIBCO-Invitrogen C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) Sigma-Aldrich C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC) Sigma-Aldrich G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm Pyrex 3160-101
Distilled water GIBCO-Invitrogen 15230-147
DNase Type II Sigma-Aldrich D4527-200KU Stock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate GIBCO-Invitrogen 10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 569-0020
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO-Invitrogen 26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0 Carolina 633017
GlutaMAX-I GIBCO-Invitrogen 35050-061
Hanks' Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma-Aldrich H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent Sigma-Aldrich 258148-100 ML
Insulin Sigma-Aldrich I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka) Sigma-Aldrich 63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free BD Biosciences 356237 This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM) GIBCO-Invitrogen 51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml BD Biosciences 355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate BD falcon 353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate BD falcon 353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid GIBCO-Invitrogen 10888-022
Nitric Acid VWR bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21  prepared in the lab Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”  Fisher 13-678-6A Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”  Fisher 13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0% Sigma-Aldrich P9333-500G
Serological pipet, 2 ml BD falcon 357507
Serological pipet, 5 ml  BD falcon 357543
Serological pipet, 10 ml BD falcon 357551
Serological pipet, 25 ml BD falcon 357525
Serological pipet, 50 ml  BD falcon 357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis Sigma-Aldrich 480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich Sigma-Aldrich 431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC) Sigma-Aldrich S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm Corning 431219
Syringe, 3 ml BD falcon 309585
Transferrin, Holo, bovine plasma Calbiochem 616420
Trypan Blue stain, 0.4% GIBCO-Invitrogen T10282 This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI Sigma-Aldrich T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%  GIBCO-Invitrogen 25200-056
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2 Merck Millipore AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail Merck Millipore NE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMS Animal Identification and Marking Systems, Inc. NEO–9 This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GT BIO–RAD 170–4405 Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800 ProteinSimple FluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal Cycler BIO-RAD PTC-1148EDU Our PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac Basic BIO-RAD 164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, Countess GIBCO-Invitrogen C10310 This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2 NUAIRE NU-425-400 This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket NUAIRE NU-4850
Horizontal Clean Bench NUAIRE NU-201-330 This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed Shaker Labnet S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge Fisher 46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793 (2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034 (2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245 (2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. e626 (2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. e3844 (2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87, (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895 (2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. e2373 (2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. e2389 (2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. e3634 (2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. e3965 (2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. e3257 (2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. e2111 (2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633 (2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).
Rapid génotypage des animaux Suivi par Établir des cultures primaires de neurones du cerveau
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).More

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter