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Neuroscience

पशु की रैपिड जीनोटाइपिंग मस्तिष्क न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृतियों की स्थापना के द्वारा पीछा किया

Published: January 29, 2015 doi: 10.3791/51879
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 1
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC
* These authors contributed equally

Summary

हम लेबलिंग के लिए और नवजात चूहों जीनोटाइपिंग और उन लोगों से प्राथमिक neuronal संस्कृतियों पैदा करने की प्रक्रियाओं का वर्णन है। जीनोटाइपिंग, तेजी से कुशल और विश्वसनीय है, और स्वचालित न्यूक्लिक एसिड निकासी के लिए अनुमति देता है। इस neonatally घातक चूहों और जीनोटाइपिंग की पूर्व पूरा होने की आवश्यकता है कि उनकी संस्कृतियों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।

Abstract

स्तनधारी न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान और समारोह के उच्च संकल्प विश्लेषण अक्सर न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृतियों के विश्लेषण के बाद अलग-अलग जानवरों के जीनोटाइपिंग की आवश्यकता है। Genotyped जा करने के लिए नवजात चूहों, तेजी से जीनोटाइपिंग लेबलिंग, और इन चूहों से मस्तिष्क न्यूरॉन्स के कम घनत्व संस्कृतियों की स्थापना: हम के लिए प्रक्रियाओं का एक सेट का वर्णन है। व्यक्तिगत चूहों वयस्कता में स्थायी लंबी अवधि की पहचान के लिए अनुमति देता है जो गोदना, द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। वर्णित प्रोटोकॉल द्वारा जीनोटाइपिंग तेज और कुशल है, और अच्छा विश्वसनीयता के साथ न्यूक्लिक एसिड की स्वचालित निकासी के लिए अनुमति देता है। इस नवजात मारक से ग्रस्त हैं कि चूहों में, जैसे पारंपरिक जीनोटाइपिंग के लिए पर्याप्त समय उपलब्ध नहीं है जहां परिस्थितियों के तहत उपयोगी है। प्राथमिक neuronal संस्कृतियों उच्च स्थानिक संकल्प पर इमेजिंग प्रयोगों में सक्षम बनाता है जो कम घनत्व, कम से उत्पन्न कर रहे हैं। इस संस्कृति विधि से पहले न्यूरोनल चढ़ाना के लिए glial फीडर परतों की तैयारी की आवश्यकता है। पीrotocol आंदोलन विकार DYT1 दुस्तानता (ΔE-torsinA तोड़े में चूहों) के एक माउस मॉडल के लिए अपनी संपूर्णता में लागू किया जाता है, और neuronal संस्कृतियों इन चूहों के हिप्पोकैम्पस, सेरेब्रल कॉर्टेक्स और स्ट्रिएटम से तैयार कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल अन्य प्रजातियों के जानवरों के लिए, साथ ही अन्य आनुवंशिक परिवर्तन के साथ चूहों के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल की व्यक्तिगत घटकों को अलग-थलग उप-परियोजनाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रकार इस प्रोटोकॉल तंत्रिका विज्ञान में बल्कि जैविक और चिकित्सा विज्ञान के अन्य क्षेत्रों में न केवल व्यापक अनुप्रयोगों, होगा।

Introduction

आनुवंशिक रोगों के कृंतक मॉडल सामान्य प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड होता है, साथ ही इन में दोष का pathophysiological परिणामों की शारीरिक कार्यों स्थापित करने में उपयोगी साबित किया है। उदाहरण कुंजी सेलुलर कार्यों में शामिल प्रोटीन के लिए चूहों की कमी है, साथ ही इस तरह के अल्जाइमर रोग के रूप में विकारों के माउस मॉडल शामिल हैं। हालांकि, कुछ आनुवंशिक जोड़तोड़ शीघ्र ही नवजात मारक या जन्म के बाद कुछ दिनों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इन मामलों में, प्राथमिक सेल संस्कृतियों जीवित कोशिकाओं मौत से पहले भ्रूण या नवजात पिल्ले से प्राप्त किया जा सकता है, क्योंकि एक महत्वपूर्ण उपकरण है, वे इन विट्रो में कम से कम एक कुछ हफ्तों के लिए बनाए रखा जा सकता है, और इस समय के दौरान जल्दी neuronal विकास के द्वारा पीछा किया जा सकता है जैव रासायनिक कार्यात्मक और रूपात्मक प्रयोगों। प्राथमिक संस्कृतियों के लिए, यह कम घनत्व में न्यूरॉन्स थाली करने के लिए फायदेमंद हो सकता है; इस व्यक्ति somata, डेन्ड्राइट, axonal शाफ्ट और तंत्रिका termi कल्पना करने के लिए यह संभव बनाता हैउच्च स्थानिक संकल्प पर nals। हालांकि, कम घनत्व में न्यूरॉन्स के अस्तित्व और भेदभाव आम तौर पर वे एक glial फीडर परत पर चढ़ाया जाता है कि आवश्यकता है, सह सुसंस्कृत glia एक से वातानुकूलित शारीरिक उन लोगों के साथ संपर्क, या माध्यम सुसंस्कृत के अभाव में glial कोशिकाओं के साथ।

glial फीडर परतों पर कम घनत्व neuronal संस्कृतियों की स्थापना के पहले से तेज और विश्वसनीय जीनोटाइपिंग पर निर्भर हो सकता है - कुछ दिनों के लिए इसके विपरीत में कुछ घंटे के भीतर। न्यूरोनल जीनोटाइप पहले से तैयार एक glial फीडर परत की है कि करने के लिए मिलान करने की आवश्यकता है जब स्पीड विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। एक और अधिक व्यावहारिक उदाहरण के रूप में, यह जो जीनोटाइप के पिल्ले एक प्रयोग की दक्षता का अनुकूलन करने के लिए, पैदा करने संस्कृतियों में उपयोग करने के लिए जो तय करने के लिए आवश्यक हो सकता है।

यहाँ हम पिछले प्रकाशनों 2-6 में, तेजी से सरल और विश्वसनीय माउस जीनोटाइपिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है कि काम कर रहे प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है। माउस पूंछ औरएक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का इस्तेमाल किया जाता है। इस प्रोटोकॉल के ऊतकों से न्यूक्लिक एसिड के एकल चरण निकासी भी शामिल है, और ('समाधान रोक') एक न्यूक्लिक एसिड शुद्धि कदम है और न ही एक समाप्ति बफर का उपयोग न होने की आवश्यकता है। इस जीनोटाइपिंग विधि की विश्वसनीयता मतभेद नमूनों के शुरू राशि, जानवरों की उम्र और पीसीआर amplicons की लंबाई के लिए सम्मान के साथ पेश कर रहे हैं जब परीक्षणों की एक श्रृंखला के परिणाम पेश करने से यह साफ है। इस किट स्वचालित निकासी और विश्वसनीयता का लाभ प्रदान करता है।

व्यापक किया जा रहा है की खातिर, genotyped चूहों की लंबी अवधि की पहचान के लिए गोदने का उपयोग भी प्रदर्शन किया है। गोदना (एपिडर्मिस) के तहत त्वचा की dermis के लिए गोदना स्याही लगाने से हासिल की है 7। एक प्रक्रिया टैटू ऐसे पूंछ और पैर की उंगलियों के रूप में शरीर के अन्य भागों के लिए लागू किया जा सकता है, हालांकि नवजात शिशु या एक दिन पुराने चूहों का पंजा पैड गोदने के लिए वर्णन किया गया है, और anim के लिएसभी उम्र के ए एल एस। इसके अलावा, प्रक्रियाओं glial फीडर परतों 2,8 के विभिन्न प्रकार के अनुकूलित तैयारी पर आधारित है, एक कम घनत्व पर माउस न्यूरॉन्स चढ़ाना और संवर्धन के लिए प्रदर्शन किया जाएगा।

(; P.Glu302del / p.Glu303del c.904_906delGAG / c.907_909delGAG) 9 जीन TOR1A में उत्परिवर्तन के कारण एक autosomal प्रमुख आंदोलन विकार - हम विरासत में मिला मस्तिष्क संबंधी विकार DYT1 दुस्तानता की एक आनुवंशिक माउस मॉडल का उपयोग करें। प्रोटीन खुलासा, प्रोटीन जटिल disassembly, झिल्ली तस्करी, और पुटिका संलयन: इनकोडिंग प्रोटीन, torsinA, जिसके सदस्य आम तौर पर, निगरानी की तरह कार्य करते हैं में सहायता (एएए +) प्रोटीन का परिवार, "विविध सेलुलर गतिविधियों से जुड़े ATPases" के अंतर्गत आता है 10-13। उत्परिवर्तन glutamic एसिड के लिए एक कोडोन का एक में फ्रेम विलोपन में परिणाम है, और 'पहले ही शुरू होने सामान्यीकृत पृथक दुस्तानता' 14,15 की अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। हालांकि, पथइस अव्यवस्था के लिए जिम्मेदार ophysiological तंत्र खराब समझ रहते हैं। एक दस्तक में माउस मॉडल में, उत्परिवर्ती एलील Tor1a ΔE के रूप में इसके बाद उल्लेख Tor1a tm2Wtd है। विषमयुग्मजी ΔE-torsinA तोड़े में चूहों DYT1 दुस्तानता साथ व्यवहार्य और आनुवंशिक रूप से नकल मानव रोगियों कर रहे हैं, जबकि समयुग्मक तोड़े में चूहों आनुवंशिक पृष्ठभूमि 18 से प्रभावित प्रसव के बाद मौत के लिए विलंबता के साथ, जन्म 16,17 के बाद मर जाते हैं। समयुग्मक तोड़े में चूहों की जल्दी मौत जानवरों की जीनोटाइपिंग और neuronal संस्कृतियों की स्थापना दोनों तेजी से पूरा कर रहे हैं कि जरूरी। जीनोटाइपिंग का एक और उदाहरण के रूप में, Tfap2a (प्रतिलेखन कारक एपी-2α, बढ़ाने प्रोटीन 2α बाध्यकारी को सक्रिय करने) का उपयोग किया जाएगा। इस जीन द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन ऐसे प्रसार, भेदभाव, अस्तित्व और apoptosis 19 के रूप में कई सेलुलर प्रक्रियाओं, विनियमित करने में महत्वपूर्ण है।

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Protocol

नोट: इस अध्ययन में प्रदर्शन सभी पशु प्रक्रियाओं आयोवा विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

पंजा पैड गोदना का उपयोग कर चूहे के 1. लंबे समय तक पहचान

  1. प्रयोगकर्ता का सामना करना पड़ पंजा पैड (तल सतह) के साथ एक पंजा स्थिर। अंगूठे और तर्जनी के साथ पंजा पकड़ो। पंजा चुटकी करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
    नोट: स्थिर स्थिरीकरण टैटू वर्णक पंजा पैड के डर्मिस में रखा गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है, और इस तरह सात स्थायी है।
  2. एक धुंध स्पंज या झाड़ू पर 70% इथेनॉल के साथ पंजा पैड झाड़ू।
  3. एक कपास इत्तला दे दी applicator के लिए त्वचा तेल लागू करें, और धीरे पंजा पैड कई बार की सतह के खिलाफ टिप दबाएँ। त्वचा तेल का केवल एक छोटी राशि का उपयोग करें; जब वर्तमान बड़ी मात्रा में, यह त्वचा तक पहुँचने से टैटू वर्णक को रोकने जाएगा।
  4. सिर्फ पूर्व गोदना स्याही में टैटू सुइयों के सुझावों डुबकीगोदने के लिए। दर्द और संक्रमण की संभावना को कम करने के लिए, और भी गोदना दक्षता बढ़ाने के लिए, स्वच्छ, सड़न रोकनेवाला और तेज गोदना सुई का प्रयोग करें।
  5. पंजा पैड सतह त्वचा के तेल के साथ कवर किया जाता है, वहीं पंजा पैड के बीच में त्वचा के खिलाफ खड़ी है और हल्के से टैटू सुई सुझावों दबाएँ, और स्याही कई बार इंजेक्षन। बिजली गोदना सिस्टम के बारे में जानकारी के लिए सामग्री / उपकरण की तालिका देखें।
  6. धीरे, एक धुंध स्पंज पर 70% इथेनॉल स्प्रे त्वचा की सतह पर अतिरिक्त टैटू वर्णक हटाने के लिए पंजा खिलाफ प्रेस, और टैटू की गुणवत्ता का निरीक्षण किया। पंजा पैड के बीच सामान्य त्वचा रंजकता से अलग है कि एक काले, दौर हाजिर है कि जाँच करें। टैटू अंधेरे या आसान देखने के लिए पर्याप्त नहीं है, तो पूर्व गोदने के चरणों को दोहराएँ।

एक फास्ट पीसीआर जीनोटाइपिंग किट का उपयोग 2. जीनोटाइपिंग नवजात चूहे

  1. 70% इथेनॉल के साथ एक चूहे की पूंछ के बाहर का अंत कीटाणुरहित पूंछ के 5 मिमी या उससे कम कटौतीटिप और पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया प्रकार की एक 8-ट्यूब पट्टी की एक ट्यूब को हस्तांतरण। नमूनों के बीच पार संक्रमण से बचने के लिए एक पिल्ला के लिए एक संयुक्त राष्ट्र के इस्तेमाल रेजर ब्लेड का प्रयोग करें। वैकल्पिक रूप से, कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें, लेकिन इस मामले में, ध्यान से और अच्छी तरह से 70% इथेनॉल का उपयोग ब्लेड पर शेष ऊतक को हटा दें। खून बह रहा है के लिए जाँच करें। खून बह रहा होता है, तो खून बह रहा बंद कर दिया है, जब तक एक धुंध स्पंज के साथ पूंछ की कटौती भाग के लिए दबाव लागू होते हैं।
  2. एक नमूना युक्त प्रत्येक पीसीआर ट्यूब करने के लिए डीएनए निष्कर्षण समाधान के 200 μl जोड़ें। किट के बारे में इसकी संरचना और जानकारी के लिए सामग्री / उपकरण की तालिका देखें।
  3. एक पीसीआर थर्मल cycler में ट्यूब पट्टी रखें, और निम्न प्रोग्राम का उपयोग डीएनए निष्कर्षण शुरू: एक चक्र 55 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक चक्र के लिए, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़े।
    नोट: यह बाद में पीसीआर के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक ही पीसीआर थर्मल cycler है।
  4. डीएनए निष्कर्षण के समाप्त होने पर, थर्मल cycler एक से ट्यूब पट्टी को दूरएन डी 5 बार पलटना।
  5. एक संयुक्त राष्ट्र के इस्तेमाल एक 8-ट्यूब पट्टी की ट्यूब, और साथ मिश्रण करने के लिए प्रत्येक नमूना के स्थानांतरण समाधान (डीएनए निकालने) के 4 μl: 2x पीसीआर तैयार मिक्स द्वितीय के 10 μl, आगे और प्राइमरों रिवर्स मिश्रित के 2 μl (कम से सिफारिश की 0.5 माइक्रोन, प्रत्येक नमूना के लिए nuclease मुक्त एच 2 ओ के दृश्यों के लिए सामग्री / उपकरण की तालिका देखें), और 4 μl। एक टेबल टॉप सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर स्पिन संक्षेप में (उदाहरण के लिए, 3 सेकंड)। जब से निपटने को छोड़कर सभी समय पर बर्फ पर ट्यूबों रखें।
  6. थर्मल साइकिल प्रदर्शन करते हैं। देख थर्मल कार्यक्रम के लिए सामग्री / उपकरण की तालिका।
  7. प्रवर्धित डीएनए उत्पादों का पता लगाने। सीधे एक agarose जेल के एक कुएं में पीसीआर (20 μl) से कुल प्रतिक्रिया समाधान लोड करें। एक अलग कुएं में आणविक वजन मार्कर लोड करें। एक बिजली के क्षेत्र लागू करें।
  8. पराबैंगनी प्रकाश के तहत बैंड के प्रतिदीप्ति छवियों मोल।

माउस ब्रेन न्यूरॉन 3. प्राथमिक संस्कृतिGlial फीडर परत पर

नोट: मस्तिष्क विच्छेदन और सेल हदबंदी (3.1) के लिए प्रक्रियाओं के बाद के सभी प्रक्रियाओं के लिए आम हैं। माउस glial संस्कृतियों के लिए प्रक्रियाओं (3.2), चूहे glial संस्कृतियों (3.3), और माउस neuronal संस्कृतियों (3.4) बाद में अलग से वर्णित हैं।

  1. ब्रेन विच्छेदन और सेलुलर Dissocaiation
    1. तेजी से मस्तिष्क को हटा दें, और हैंक्स 'समाधान में जगह, कत्ल से एक माउस या चूहा पिल्ला बलिदान (रचना के लिए 1 टेबल देखें) + 20% (बर्फ पर रखा) एक 35 मिमी डिश में भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)।
    2. दो गोलार्द्धों में midline के माध्यम से मस्तिष्क कट। मस्तिष्क की प्रत्येक गोलार्द्ध से ब्याज के क्षेत्र (जैसे, सेरेब्रल कॉर्टेक्स, स्ट्रिएटम और हिप्पोकैम्पस) निकालें। सतह से तानिका और प्रमुख रक्त वाहिकाओं निकालें। एक सर्जिकल ब्लेड का उपयोग कर 4-10 पतली स्लाइस में मस्तिष्क क्षेत्र काटें।
    3. बुद्धि एक बार, एक 15 मिलीलीटर centrifugation के ट्यूब में मस्तिष्क स्लाइस कुल्लाएच हैंक्स 'समाधान + 20% FBS के, हैंक्स के साथ फिर 3 बार' (सीरम के बिना यानी,) समाधान (सभी 4 डिग्री सेल्सियस पर)। कुल्ला, 5-10 मिलीलीटर समाधान जोड़ने, स्लाइस ट्यूब के नीचे बसा मस्तिष्क, ऊपर से समाधान महाप्राण करते हैं, और एक ताजा समाधान जोड़ने के लिए। समाधान aspirating द्वारा rinsing प्रक्रिया समाप्त करें।
    4. एक 3 मिलीलीटर सिरिंज और एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग trypsin युक्त पाचन समाधान (रचना के लिए 1 टेबल देखें) के 2 मिलीलीटर फिल्टर, और मस्तिष्क स्लाइस युक्त ट्यूब में सीधे छानना जोड़ें। Trypsinization आरटी पर 13 मिनट के लिए आगे बढ़ना।
    5. इसमें से अधिकांश aspirating द्वारा और फिर 7-10 मिलीलीटर हैंक्स 'समाधान + 20% FBS के (4 डिग्री सेल्सियस) से जोड़कर पहले trypsin समाधान बेअसर।
    6. हैंक्स के साथ दो बार, मस्तिष्क स्लाइस कुल्ला 'समाधान + 20% FBS के, और हैंक्स के साथ फिर तीन बार' समाधान (यानी सीरम के बिना) (सभी 4 डिग्री सेल्सियस पर)। Solut के aspirating द्वारा rinsing प्रक्रिया समाप्तआयन।
    7. एक 3 मिलीलीटर सिरिंज और एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग हदबंदी समाधान (रचना के लिए 1 टेबल देखें) के 2 मिलीलीटर फिल्टर, और मस्तिष्क स्लाइस के साथ ट्यूब के लिए सीधे छानना जोड़ें।
    8. यंत्रवत् दिखाई ऊतक टुकड़े गायब हो जाते हैं जब तक धीरे, 10-20 बार triturating द्वारा कोशिकाओं को अलग कर देना। एक कपास खामियों को दूर किया, आग पॉलिश पाश्चर विंदुक का प्रयोग करें और विचूर्णन दौरान बुलबुले बनाने से बचें।
    9. छोटे-छोटे टुकड़ों बसने के लिए 3 मिनट रुको।
    10. समाधान के बहुमत के हस्तांतरण (~ 1.5 मिलीलीटर, तल पर कुछ समाधान छोड़कर) का उपयोग करते हुए, 3 मिलीलीटर हैंक्स 'समाधान + 20% FBS के समाधान (4 डिग्री सेल्सियस) है जिसमें एक 15 मिलीलीटर centrifugation के ट्यूब के लिए कपास-खामियों को दूर किया, आग पॉलिश पाश्चर विंदुक। तल पर किसी भी तलछट के शामिल किए जाने के लिए आम तौर पर संस्कृति की गिरावट में यह परिणाम है क्योंकि सभी समाधान स्थानांतरण नहीं है।
    11. 4 डिग्री सेल्सियस पर ~ 185 ग्राम (~ 1100 आरपीएम) पर 13 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    12. धीरे सतह पर तैरनेवाला Aspirate,जोड़ने के 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म गोली मध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) चढ़ाना, और धीरे कपास-खामियों को दूर किया, आग पॉलिश पाश्चर विंदुक का उपयोग कई बार pipetting द्वारा यह resuspend।
      नोट: मीडिया चढ़ाना के तीन अलग अलग प्रकार अलग संस्कृति उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं: माउस न्यूरॉन्स के लिए मध्यम-2 चढ़ाना, माउस glial कोशिकाओं के लिए मध्यम-एक चढ़ाना, और चूहा न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं के लिए मध्यम 3 चढ़ाना (रचनाओं के लिए 1 टेबल देखें) ।
    13. एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग, सेल निलंबन के 10 μl बाहर ले जाओ 0.4% trypan नीले समाधान के 10 μl के साथ मिश्रण है, और जीवित कोशिकाओं के घनत्व को मापने।
  2. माउस Glial संस्कृति
    1. माउस कोशिकाओं के स्वस्थ संस्कृतियों की स्थापना में मदद करने के लिए coverslips धो लें।
      1. एक गिलास पेट्री डिश में 70% नाइट्रिक एसिड में कांच coverslips (दौर, 12 मिमी व्यास) विसर्जित कर दिया। एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश से बचाने के लिए, और एक कक्षीय प्रकार के बरतन हे / एन पर जगह है।
      2. कांच coversli कुल्लाआसुत जल के साथ पेट्री डिश में पुनश्च कम से कम तीन बार। आसुत जल में उन्हें विसर्जित कर दिया। एक कक्षीय प्रकार के बरतन हे / एन पर पकवान रखें।
      3. जैविक सुरक्षा कैबिनेट में एक वाटमान 150 मिमी फिल्टर पेपर पर coverslips सूखी।
      4. Coverslips के आटोक्लेव।
      5. 24 अच्छी तरह से संस्कृति डिश में coverslips के रखें।
    2. चरण 1 और 2 के अनुसार लेबल और जीनोटाइप नवजात चूहों।
    3. 3.1 कदम के अनुसार, माउस पिल्ले से मस्तिष्क की कोशिकाओं को प्राप्त करते हैं।
      नोट: सेरेब्रल कॉर्टेक्स के माउस का प्रयोग glial फीडर परत की तैयारी के लिए विशिष्ट है। हालांकि, इस तरह के हिप्पोकैम्पस और स्ट्रिएटम के रूप में अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों, की वजह से अलग अलग संख्या और विभिन्न क्षेत्रों से कोशिकाओं की पैदावार के लिए सेल घनत्व के समुचित समायोजन के बाद काम करेंगे।
    4. पूर्व गर्म अंतिम सेल निलंबन के लिए मध्यम-एक चढ़ाना के ~ 4 मिलीलीटर जोड़ें (~ 1 एमएल)। पूर्व वार्मिंग संस्कृति मीडिया के लिए, संस्कृति इनक्यूबेटर में समाधान (5% सीओ 2 के -95% 2 हे, 37 डिग्री सेल्सियस) हे / एन, के लिए जगहतापमान और पीएच मान को स्थिर करने की अनुमति देते हैं।
    5. कपास-खामियों को दूर किया, आग पॉलिश पाश्चर विंदुक का उपयोग, एक uncoated T25 संस्कृति फ्लास्क सेल निलंबन स्थानांतरण। संस्कृति इनक्यूबेटर में कुप्पी रखें।
    6. इन विट्रो (DIV) में एक दिन में दो बार चढ़ाना के साथ T25 कुप्पी में संवर्धित कोशिकाओं कुल्ला मध्यम-1 (4 डिग्री सेल्सियस)। वापस इनक्यूबेटर में कुप्पी रखें। एक घूमता प्रस्ताव में कई बार ताजा माध्यम से ~ 5 मिलीलीटर जोड़ने, पूरी तरह से एक पाश्चर विंदुक के साथ कुप्पी के अंदर मध्यम aspirating और धीरे कुप्पी झुकने से rinsing प्रदर्शन करते हैं।
    7. 6-9 DIV में, (यानी, एक trypsinization के पहले दिन और 3.2.8-3.2.13 चरणों में, coverslips पर चढ़ाना), (बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ कोटिंग सामग्री के 100 μl जगह के बारे में टिप्पणी के लिए सामग्री / उपकरण की तालिका देखें कोटिंग एक संस्कृति डिश में कांच coverslips पर सामग्री), और संस्कृति इनक्यूबेटर में संस्कृति पकवान जगह है।
    8. 7-10 div, पर कोशिकाओं 20-4 कर रहे हैं जब0% मिला हुआ (स्थानिक निरंतर), उनमें trypsinize।
      1. कुप्पी के भीतर सभी समाधान aspirating और ~ हैंक्स 'समाधान (4 डिग्री सेल्सियस) के 13 मिलीलीटर जोड़कर, एक बार फ्लास्क कुल्ला, धीरे से एक घूमता प्रस्ताव में कुप्पी कई बार झुकाव है, और पूरी तरह से समाधान aspirate।
      2. 4 मिलीलीटर ट्रिप्सिन-EDTA समाधान करने के लिए DNase समाधान (अंतिम एकाग्रता, 750 इकाइयों / एमएल) के 40 μl जोड़ें 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान पास, और कुप्पी में कोशिकाओं को सीधे छानना जोड़ें।
      3. Trypsinization इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 13 मिनट के लिए आगे बढ़ना।
      4. कुप्पी के लिए 100% FBS के (4 डिग्री सेल्सियस) के 2 मिलीलीटर जोड़कर trypsin समाधान बेअसर।
      5. हैंक्स 'समाधान 20% की FBS के (4 डिग्री सेल्सियस), पर अपकेंद्रित्र ~ 4 ​​मिलीलीटर जोड़ने के लिए, एक 5- करने के लिए 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर centrifugation के ट्यूब को trypsinized कोशिकाओं स्थानांतरण ~ 185 ग्राम और 13 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस , और सतह पर तैरनेवाला aspirate।
    9. पूर्व warme के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspendडी चढ़ाना मध्यम-1।
    10. कदम 3.1.13 के अनुसार कोशिकाओं के घनत्व को मापने।
    11. Coverslips पर ~ resuspended glial कोशिकाओं के 50 μl कोटिंग कांच coverslips से पूरी तरह से सामग्री, और थाली aspirate।
      नोट: इन कोशिकाओं glial फीडर परत स्थापित करेगा।
    12. इनक्यूबेटर में coverslips साथ संस्कृति डिश रखें।
    13. 20-60 मिनट बाद में, पूर्व गर्म अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए मध्यम-एक चढ़ाना के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और वापस इनक्यूबेटर में पकवान जगह है। नोट: चढ़ाना मध्यम जोड़ा जाता है, वहीं यह coverslip के माध्यम में नाव नहीं होगा, इसलिए है कि (कोई चढ़ाया कोशिकाओं रहे हैं जहाँ) coverslip की परिधि नीचे प्रेस करने के लिए एक और पिपेट का उपयोग करने के लिए उपयोगी हो जाएगा।
    14. (कांच coverslip पर यानी,) glial फीडर परत का एक DIV में, के 1 मिलीलीटर के साथ मध्यम जगह पूर्व गर्म चढ़ाना मध्यम-एक, एक अच्छी तरह से समाधान के सभी aspirating और फिर ताजा माध्यम के साथ भरने के द्वारा।
    15. Glial फीडर परत के 2-3 DIV पर जब सेल, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए इसलिए डीएनए प्रतिकृति और को बाधित करने के लिए; रास mitotic अवरोध (81.2 और 204.8 माइक्रोन के अंतिम सांद्रता, क्रमशः 5-फ्लोरो 2'- deoxyuridine + uridine का एक मिश्रण के 10 μl) जोड़ने, 80-100% मिला हुआ हैं glial सेल प्रसार को दबाने।
    16. कोशिकाओं 90-100% मिला हुआ (glial फीडर परत पर न्यूरॉन्स चढ़ाना पहले 1-2 घंटा) कर रहे हैं जब 7-9 DIV पर, साथ संस्कृति मध्यम जगह पूर्व गर्म चढ़ाना मध्यम-2 (37 डिग्री सेल्सियस)।
      नोट: न्यूरॉन्स 3.4 कदम का उपयोग करते हुए, एक ही दिन पर चढ़ाया जाएगा।
  3. चूहा Glial संस्कृति
    1. कोट वही कोटिंग सामग्री के साथ एक T25 संस्कृति फ्लास्क।
      नोट: यह कदम 3.3.5 में गैर पक्षपाती कोशिकाओं के बाद हटाने के लिए आवश्यक है।
      1. कुप्पी के लिए कोटिंग सामग्री के 2.0 मिलीलीटर जोड़ें, और संस्कृति इनक्यूबेटर में कुप्पी जगह है।
      2. 2-3 घंटे के बाद, फ्लास्क की मंजिल शुष्क हो जाता है कि इस तरह, पूरी तरह से कोटिंग सामग्री aspirate।
    2. कोशिकाओं को प्राप्तचूहा पिल्ले से, 3.1 कदम के अनुसार।
      नोट: हिप्पोकैम्पस के सीए 3-सीए 1 क्षेत्र चूहे glial फीडर परत तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, इस तरह सेरेब्रल कॉर्टेक्स और स्ट्रिएटम के रूप में अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों, की वजह से अलग अलग संख्या और विभिन्न क्षेत्रों से कोशिकाओं की पैदावार के लिए सेल घनत्व में अंतर के लिए समायोजित करने के बाद काम करेंगे।
    3. पूर्व गर्म अंतिम सेल निलंबन के लिए मध्यम 3 चढ़ाना के ~ 4 मिलीलीटर जोड़ें (~ 1 एमएल)।
    4. कपास-खामियों को दूर किया, आग पॉलिश पाश्चर विंदुक का उपयोग, लेपित T25 संस्कृति फ्लास्क में सेल निलंबन स्थानांतरण। संस्कृति इनक्यूबेटर (5% सीओ 2 के -95% 2 हे, 37 डिग्री सेल्सियस) में कुप्पी रखें।
    5. 2-3 DIV में, कोशिकाओं 20-40% मिला हुआ हैं, जब कसकर ढक्कन बंद फ्लास्क झटकों से, गैर पक्षपाती या दुर्बलता से पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने सख्ती ~ 10 बार, समाधान aspirating, और चढ़ाना के 4-5 मिलीलीटर जोड़ने मध्यम-3 (4 डिग्री सेल्सियस पर)। एक बार इस प्रक्रिया को दोहराएं। जैसे (पूरे कुप्पी मंजिल भर में संवर्धित कोशिकाओं की जांच,पूरी तरह से हटा दिया जाता है) सेल शरीर के बाहरी रिम चरण उज्ज्वल दिखाई देता है, जो उन लोगों के लिए यानी न्यूरोनल (दिखाई देते हैं, उन है कि है कि पुष्टि करने के लिए चरण विपरीत माइक्रोस्कोप) का उपयोग। इन कोशिकाओं को हटाने, और फिर इनक्यूबेटर कुप्पी वापस करने के लिए के रूप में अक्सर के रूप में आवश्यक प्रक्रिया को दोहराएं।
      नोट: शक्ति और व्यक्तिगत प्रयोगकर्ताओं के बीच भिन्न हो सकती आवश्यक 'हिलाता' की कुल संख्या। महत्वपूर्ण बात यह है कि एक निर्धारित संख्या के लिए हिलाता की कुल संख्या रखने के लिए, लेकिन न्यूरॉन कोशिकाओं की तरह सफाया कर रहे हैं कि इस बात की पुष्टि करने के लिए नहीं है।
    6. 6-8 DIV में, कोशिकाओं 90-100% मिला हुआ, बीतने कदम 3.2.8 में के रूप में उन्हें trypsinizing द्वारा glial कोशिकाओं रहे हैं।
    7. Centrifugation के बाद, एक संयुक्त राष्ट्र-लेपित T75 फ्लास्क को trypsinized कोशिकाओं को हस्तांतरण, मध्यम-3 (4 डिग्री सेल्सियस) चढ़ाना के 10 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और संस्कृति उन में, मध्यम-3 (4 डिग्री सेल्सियस) चढ़ाना के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend इनक्यूबेटर।
      नोट: चूहा glial कोशिकाओं में दो बार passaged किया जाएगा; इसके विपरीत माउस glial कोशिकाओं की गिरफ्तारीवे कई मार्ग के बाद अस्वस्थ हो जाते हैं क्योंकि ई केवल एक बार passaged। चूहा glial कोशिकाओं किसी भी कोटिंग सामग्री के साथ लेपित नहीं कर रहे हैं कि T75 बोतल में passaged किया जाएगा। कोटिंग चूहे glial कोशिकाओं को भी जल्दी से आगे बढ़ने और बाद में न्यूरोनल संस्कृति हालत खराब हो जाएगा, जो कई रोमक कोशिकाओं (ख्यात ependymal कोशिकाओं), उपज के लिए अनुमति देता है।
    8. एक फ्लास्क में glial संस्कृति का 17-19 DIV में (यानी, 11 दिनों के passaging और trypsinization से पहले एक दिन और 3.3.9-3.3.14 कदमों से coverslips पर चढ़ाना के बाद), (मैला कांच coverslips पर कोटिंग सामग्री के 100 μl जगह गोल, 12 मिमी व्यास) एक संस्कृति डिश में, और संस्कृति इनक्यूबेटर में संस्कृति पकवान जगह है।
      नोट: चूहे glial संस्कृतियों के लिए, एक अंतर के साथ या coverslips धोने के बिना संस्कृति परिणामों में गौर नहीं किया गया था।
    9. एक फ्लास्क में glial संस्कृति के 18-20 DIV में (यानी, passaging के बाद 12 दिन), सेंट के अनुसार, संवर्धित कोशिकाओं trypsinizing द्वारा glial फीडर परत को तैयारईपी 3.2.8।
    10. Centrifugation के दौरान, कांच coverslips से पूरी तरह से कोटिंग सामग्री aspirate।
    11. Centrifugation के बाद, कदम 3.1.13 के अनुसार, मध्यम-3 (4 डिग्री सेल्सियस) चढ़ाना के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend, और सेल घनत्व को मापने।
    12. 10 4 जीवित कोशिकाओं / एमएल glial घनत्व को समायोजित करें, और लेपित गिलास coverslips पर glial सेल निलंबन के 100 μl थाली।
      नोट: इन कोशिकाओं glial फीडर परत स्थापित करेगा।
    13. 20-60 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में coverslips के साथ संस्कृति डिश रखें।
    14. प्रत्येक अच्छी तरह से मध्यम-3 (4 डिग्री सेल्सियस) चढ़ाना के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और वापस इनक्यूबेटर में पकवान जगह है।
    15. Coverslip पर कोशिकाओं 40-80% मिला हुआ हैं जब glial फीडर परत के 3-4 div, पर, पूर्व गर्म मध्यम विकास के 1 मिलीलीटर जोड़ने (साइटोसिन β डी arabinofuranoside शामिल है (रचना के लिए 1 टेबल देखें) ARAC, 4 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता) glial सेल प्रसार को रोकने के लिए। प्लेट न्यूरॉनglial फीडर परत की 7-9 DIV के एस कोशिकाओं 3.4 कदम का उपयोग कर, 60-80% मिला हुआ हैं जब।
  4. माउस neuronal संस्कृतियों
    1. चरण 1 और 2 के अनुसार लेबल और जीनोटाइप नवजात चूहों।
    2. 3.1 कदम के लिए माउस पिल्ले का प्रयोग करें।
    3. जीना सेल निलंबन के घनत्व को समायोजित करने के लिए ~ का उपयोग कर 2.0 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल पूर्व गर्म मध्यम दो माउस glial कोशिकाओं पर चढ़ाना, या प्रयोग करने के लिए चढ़ाना चढ़ाना मध्यम 3 चूहे glial कोशिकाओं पर चढ़ाना के लिए।
    4. धीरे प्रत्येक की संस्कृति के माध्यम से सेल निलंबन जोड़ने अच्छी तरह से, glial फीडर परत पर कोशिकाओं थाली। नोट: जोड़ा जा करने के लिए सेल निलंबन की मात्रा अच्छी तरह से एक संस्कृति में कोशिकाओं के लक्ष्य की संख्या द्वारा निर्धारित किया जाएगा। उदाहरण के लिए, थाली ~ सेल निलंबन के 60 μl / अच्छी तरह से 12,000 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए।
    5. न्यूरॉन्स चढ़ाया जाता है के बाद कोई समाधान परिवर्तन जरूरी हैं कि ध्यान दें। संस्कृति के पाठ्यक्रम पर, अंदर ओ humidifying द्वारा कुओं से समाधान के वाष्पीकरण से बचने के लिए सावधान रहेंसंस्कृति इनक्यूबेटर एफ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के आवेदन का एक उदाहरण के रूप में, प्रतिनिधि परिणाम विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के तहत गोदना, विश्वसनीय जीनोटाइपिंग द्वारा चूहों लेबलिंग, और glial फीडर परतों पर प्राथमिक neuronal संस्कृतियों की स्थापना के लिए दिखाए जाते हैं।

गोदना

नवजात पिल्ले (चित्रा 1 में 'नवजात') एक गोदना प्रणाली का उपयोग पंजा पैड पर लेबल रहे थे। लेबल तीन सप्ताह में स्पष्ट रूप से दिखाई बनी ('3 सप्ताह पुरानी') और उम्र के 32 सप्ताह ('32 '-week पुराने)। व्यक्तिगत चूहों विशिष्ट चार पंजे (संख्या 16/01) पर टैटू के संयोजन के द्वारा और जानवर पिंजरे, या अधिक जटिल नंबर योजनाओं के बारे में जानकारी से पहचाना जा सकता है () नहीं दिखाया।

जीनोटाइपिंग

जीनोटाइपिंग का एक प्रतिनिधि उदाहरण (चित्रा 2) दिखाया गया है। जंगली प्रकार की Tor1a जीन (Tor1a (Tor1a / + ΔE) और समयुग्मक (Tor1a ΔE / ΔE) ΔE-torsinA तोड़े में चूहों नवजात पिल्ले की पूंछ क्लिप से अलग जीनोमिक डीएनए से परिलक्षित किया गया था। इस विशिष्ट उदाहरण में जीनोटाइपिंग एक neomycin प्रतिरोध कैसेट 16,18 के सफल Cre पुनर्संयोजन और विलोपन के बाद उत्परिवर्ती Tor1a एलील में एक भी 34 आधार जोड़ी loxP साइट की उपस्थिति पर आधारित है।

जीनोमिक डीएनए न्यूनतम हाथों पर समय के साथ निकाला गया था, और कई नमूने एक साथ प्रोसेस किया गया। निकासी के संस्करणों को स्थिर रखा गया है, और इसलिए मात्रा का कोई समायोजन का परीक्षण परिस्थितियों में परिवर्तन को समायोजित करने के लिए आवश्यक था। नीचे विस्तृत रूप जीनोटाइपिंग की विश्वसनीयता, चार शर्तों के तहत परीक्षण किया गया था।

सबसे पहले, ऊतक शुरू करने की राशि में अंतर का प्रभाव (चित्रा 3) जांच की गई थी। अलग अलग लंबाई की पूंछ थेप्रातः उम्र में विषमयुग्मजी ΔE-torsinA तोड़े में चूहों (Tor1a / + ΔE) (~ 3 सप्ताह) से तैयार किया। 2 मिमी से 5 की पूंछ लंबाई, आम तौर पर जीनोटाइपिंग प्रोटोकॉल में सिफारिश की रेंज, उच्च गुणवत्ता की इसी जीनोटाइपिंग परिणाम दे दी है। दो बैंड जंगली प्रकार और उत्परिवर्तित एलील (Tor1a + और ​​Tor1a ΔE, क्रमशः) के अनुरूप हैं।

दूसरा, पशु उम्र में परिवर्तनशीलता के प्रभाव (चित्रा 4) की जांच की गई। पूंछ नवजात शिशु, 3 सप्ताह पुराने से प्राप्त किए गए थे और ~ 24 सप्ताह पुरानी विषमयुग्मजी ΔE-torsinA तोड़े में चूहों (Tor1a / + ΔE)। वे जन्म 16-18 के बाद कई दिनों मर क्योंकि समयुग्मज इस्तेमाल नहीं किया गया। दो जंगली प्रकार के लिए उम्मीद की बैंड और उत्परिवर्तित Tor1a जीन की परवाह किए बिना पशु उम्र (चित्रा -4 ए) के दिखाई दे रहे थे। इस परिणाम के सामान्य प्रयोज्यता जंगली-टी में एक दूसरे जीन, Tfap2a 19 का उपयोग कर परीक्षण किया गया थाype चूहों (Tfap2a / + +) (4B चित्रा)।

तीसरा, पीसीआर amplicons की लंबाई में अंतर का प्रभाव (चित्रा 5) परीक्षण किया गया। इस प्रयोजन के लिए विभिन्न प्राइमर जोड़े परिलक्षित DNAs अलग आधार जोड़ी लंबाई के होते हैं, जैसे कि किसी दिए गए जीन के लिए संश्लेषित किया गया। Tfap2a जीन लगातार अलग amplicon लंबाई के साथ पाया गया।

चौथा, दो डीएनए निष्कर्षण तरीकों (चित्रा 6) की तुलना में थे। एक विधि में, पीसीआर पट्टी ट्यूब और पीसीआर थर्मल cycler (चरण 2 में वर्णित) का इस्तेमाल किया गया था। यह एक स्वचालित, समानांतर बहु-ट्यूब निष्कर्षण विधि (चित्रा 6 में 'ऑटो') है। कई ट्यूबों पट्टी प्रारूप में एक साथ नियंत्रित किया जा सकता है, और एक पीसीआर मशीन चार तापमान चरणों में संचालित करने के लिए एक कार्यक्रम के साथ प्रयोग किया जाता है, मैन्युअल, ट्यूब हस्तांतरण निकासी के दौरान तापमान में परिवर्तन या कई टुकड़े का उपयोग करने की कोई जरूरत नहीं हैउपकरणों की। इस प्रकार यह कई नमूनों की प्रक्रिया आसान है। यह (चित्रा 6 में 'मैनुअल') पुस्तिका, एकल ट्यूब निष्कर्षण के आधार पर दूसरी विधि के साथ तुलना में किया गया था। यह डीएनए निष्कर्षण के दौरान तापमान को नियंत्रित करने के लिए व्यक्तिगत पीसीआर ट्यूब और अलग गैर-पीसीआर मशीन (गर्मी ब्लॉक और पानी स्नान) का उपयोग करता है। इस मामले में, कई, एकल ट्यूब कई तापमान को नियंत्रित करने apparatuses की आवश्यकता होती है, हर कदम के बाद एक नया तापमान में ले जाया गया। दोनों ही मामलों में, Tor1a जीन जंगली प्रकार, विषमयुग्मजी और समयुग्मक ΔE-torsinA तोड़े में चूहों (चित्रा 6A) में विश्लेषण किया गया था, और Tfap2a जीन जंगली प्रकार चूहों (चित्रा 6B) में विश्लेषण किया गया था। दो निष्कर्षण प्रोटोकॉल बराबर जीनोटाइपिंग परिणाम सामने आए।

सारांश में, आंकड़े 3 से 6 में प्रस्तुत परिणाम जीनोटाइपिंग विधि VA के बावजूद विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने, मजबूत दिखाना है किऊतक राशि, पशु उम्र, amplicon लंबाई, और उपयोग निष्कर्षण प्रोटोकॉल में riations।

Neuronal संस्कृतियों

माउस glial फीडर परत पर माउस न्यूरॉन्स संवर्धन के लिए, प्रक्रियाओं का आदेश है: Neuronal संस्कृति → न्यूरोनल संस्कृति के लिए नवजात चूहों → जीनोटाइपिंग गोदने glial संस्कृति → (glial संस्कृति → लिए गोदना नवजात चूहों → जीनोटाइपिंग)। चूहे glial फीडर परत पर स्थापित संस्कृतियों के लिए, कोष्ठक में प्रक्रियाओं छोड़ रहे हैं।

हम न्यूरोनल अस्तित्व और विकास पर पूर्व वरीयता प्राप्त glial फीडर परत का समर्थन प्रभाव की जांच की। न्यूरॉन्स हिप्पोकैम्पस के सीए 3-सीए 1 क्षेत्र, सेरेब्रल कॉर्टेक्स के मोटर क्षेत्र, और नवजात शिशु जंगली प्रकार चूहों के स्ट्रिएटम से प्राप्त किया गया। वे के अनुसार, हिप्पोकैम्पस के सीए 3-सीए 1 क्षेत्र से प्राप्त और neuronal चढ़ाना करने से पहले वरीयता प्राप्त किया गया था कि चूहे glial फीडर परत पर कम घनत्व पर चढ़ाया गया7 चित्रा में सचित्र योजना (प्रक्रियाओं के सरलीकृत सारांश)। कम घनत्व संस्कृतियों, उच्च स्थानिक संकल्प पर somata 4,6, तंत्रिका टर्मिनलों 2,3,5,8 और axonal शाफ्ट 5 व्यक्ति dendrites की इमेजिंग के लिए उपयोगी हैं। हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं (न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं दोनों युक्त) या तो (चित्रा 8A) के साथ या एक पूर्व स्थापित glial फीडर परत (चित्रा 8B, सी) के बिना, लेपित गिलास coverslips पर चढ़ाया और चरण विपरीत प्रकाशिकी के साथ मनाया गया। एक लगभग मिला हुआ glial फीडर परत की उपस्थिति में, न्यूरॉन्स (प्रत्येक कक्ष में एक Arrowhead एक प्रतिनिधि न्यूरॉन इंगित करता है) अपेक्षाकृत (इन विट्रो में दिनों, DIV) (चित्रा 8A) चढ़ाना के बाद 3 और 7 दिनों बिखरे थे। वे भी ऐसे neuronal somata का एक स्पष्ट मार्जिन बढ़ाया डेन्ड्राइट, क्लस्टर somata की कमी है, और बंडल neurites की कमी के रूप में अच्छे स्वास्थ्य के संकेत, पता चला है (उच्च बढ़ाई imaginsets में ते)। 14 DIV में, इन न्यूरॉन्स लंबे neurites (dendrites और एक्सोन) द्वारा विशेषता एक घने नेटवर्क का गठन किया। न्यूरॉन्स mitotic अवरोध ARAC (कदम 3.3.15) युक्त मध्यम विकास जोड़कर, चढ़ाया गया से पहले glial प्रसार हिचकते किया गया था कि ध्यान दें।

इसके विपरीत, हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स चढ़ाना के समय में glial फीडर परत के अभाव में, सुसंस्कृत hippocampal न्यूरॉन्स के विकास को भी ARAC के अभाव में, बिगड़ा हुआ था। 3 DIV में, (नव चढ़ाया हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं में शामिल) glial कोशिकाओं (चित्रा 8B के शीर्ष पैनल में तारक) मिला हुआ चादर का गठन नहीं किया है। संस्कृतियों ऐसे अंतर्निहित glial कोशिकाओं (तारांकन) के बिना विस्तृत क्षेत्रों के रूप में उच्च संकल्प इमेजिंग अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं हैं कि कई लक्षण, क्लस्टर somata की उपस्थिति और कुछ क्षेत्रों में बंडल neurites की मौजूदगी से पता चला है (डेटा) नहीं दिखाया। 7 DIV के द्वारा, glial कोशिकाओं मिला हुआ शीट (चित्रा 8C के बीच पैनल) का गठन किया। Howevएर, न्यूरॉन्स न्यूरॉन्स एक पूर्व स्थापित glial फीडर परत पर चढ़ाया गया जब से अधिक संख्या में कम थे। जीवित न्यूरॉन्स भी लंबा, नेटवर्क के गठन के neurites (इनसेट) का अभाव है। glial कोशिकाओं इस प्रकार चरण उज्ज्वल दिखाई दे रहा, फीडर परत संस्कृति में उन लोगों की तुलना में टेढ़ापन और मोटाई में अधिक विषम थे। न्यूरॉन्स पर glial प्रसार को दबाने के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, हम मध्यम विकास ARAC युक्त आवेदन किया। ARAC तीन या सात div पर जोड़ा गया है और कोशिकाओं को 14 DIV तक सुसंस्कृत थे और इस दिन (चित्रा 8B और सी, नीचे पैनल) पर मनाया गया था, glial कोशिकाओं coverslip सतह के सबसे को कवर किया। हालांकि, न्यूरॉन्स ARAC 7 DIV में लागू किया गया था, खासकर जब अभी भी संख्या में कम थे। जीवित न्यूरॉन्स ही कम प्रक्रियाओं की थी और बड़े पैमाने पर लॉग इन नहीं कर रहे थे। इस प्रकार, ARAC की देर इसके अलावा फार्म करने के लिए एक समान glial परत की अनुमति दी है, लेकिन न्यूरोनल व्यवहार्यता या neurite विस्तार का प्रचार नहीं किया था; अनियंत्रित glial विकास नहीं बल्किन्यूरॉन्स पर हानिकारक प्रभाव पड़ा।

इन आंकड़ों glial फीडर परत कम घनत्व पर चढ़ाया न्यूरॉन्स के अस्तित्व और विकास के लिए महत्वपूर्ण है कि, और glial परत न्यूरोनल संस्कृति के दौरान बाद में न्यूरोनल चढ़ाना बजाय के समय मौजूद होना चाहिए कि दिखा। इसी तरह के परिणाम मस्तिष्क कॉर्टिकल की संस्कृतियों (चित्रा 9) और striatal न्यूरॉन्स (10 चित्रा) का उपयोग कर प्राप्त किया गया।

न्यूरोनल अस्तित्व के बारे में गुणात्मक अवलोकन मात्रात्मक विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई। विशेष रूप से, 14 DIV पर जीवित न्यूरॉन्स की संख्या संस्कृतियों के चरण विपरीत छवियों (11 चित्रा) पर आधारित है, गिना गया। नंबर एक glial फीडर परत पर सभ्य न्यूरॉन्स (यानी।, glial फीडर परत पर चढ़ाया) के लिए सबसे बड़ा था। नंबर एक glial फीडर परत के अभाव में सभ्य न्यूरॉन्स के मामले में कम थी। कोशिकाओं एक पर ARAC साथ इलाज किया गया, जब संख्या और आगे भी कम हो गया थाबाद में समय। इन मतभेदों सांख्यिकीय महत्वपूर्ण थे, और सभी तीन मस्तिष्क क्षेत्रों से प्राप्त न्यूरॉन्स की संस्कृतियों में नोट कर रहे थे।

जीवित कोशिकाओं के प्रकार के हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों चूहे के हिप्पोकैम्पस फीडर परत पर चढ़ाया माउस में 14 DIV में पहचान की गई। डबल-immunocytochemistry के neuronal मार्कर के खिलाफ, microtubule जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2) एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था, और astrocytic glial सेल मार्कर, glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP)। अंतर्निहित glial फीडर परत में कोशिकाओं GFAP (दो प्रतिनिधि छवि क्षेत्रों, चित्रा 12A) के लिए सकारात्मक थे जबकि विस्तारित प्रक्रियाओं के साथ कोशिकाओं, MAP2 के लिए सकारात्मक थे। माध्यमिक एंटीबॉडी का एक अलग सेट (चित्रा 12B) का इस्तेमाल किया गया था जब एक ही पैटर्न प्राप्त हुई थी क्योंकि यह धुंधला, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के एक विशिष्ट संयोजन की एक विरूपण साक्ष्य नहीं था।

इसके विपरीत, एक ही धुंधला perfo किया गया था जबजोड़ा माउस कोशिकाओं (दो प्रतिनिधि छवि क्षेत्रों, चित्रा 13A) के अभाव में केवल एक glial फीडर परत, यानी, से मिलकर संस्कृतियों पर rmed, कोई कोशिकाओं MAP2 के लिए सकारात्मक थे। फीडर परत की कोशिकाओं GFAP के लिए लगातार सकारात्मक थे। एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए, दोनों को प्राथमिक एंटीबॉडी immunocytochemical प्रक्रिया (चित्रा 13B) से छोड़े गए थे। कोशिकाओं मौजूद थे, हालांकि कोई धुंधला प्रेषित प्रकाश प्रकाशिकी (अंतर हस्तक्षेप विपरीत, डीआईसी) और Hoechst डाई के साथ परमाणु धुंधला से ही स्पष्ट है, इन नमूनों में पाया गया था। इस प्रकार, MAP2 और GFAP चैनलों में गैर विशिष्ट धुंधला बहुत कमजोर था।

ये immunocytochemical डेटा भी मात्रात्मक (चित्रा 14) विश्लेषण किया गया। प्रत्येक 8 बिट छवि में, तीव्रता मापा गया था और एक रेखा के साथ साजिश रची है। माउस कोशिकाओं (न्यूरॉन्स युक्त नमूने) (न्यूरॉन + एक glial फीडर परत पर सुसंस्कृत थे जब मढ़ा भूखंडों, MAP2 धुंधला पता चलता हैglia + ऐसे धुंधला अकेले glial फीडर कोशिकाओं की संस्कृतियों (न्यूरॉन में अनुपस्थित था जबकि प्राथमिक एंटीबॉडी (1 ° अब) +) - glia + 1 ° ab +)। (- 1 ° एबी,, glia + - न्यूरॉन) प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना एक नकारात्मक नियंत्रण में, धुंधला अकेले glial फीडर कोशिकाओं की संस्कृतियों में नगण्य था। GFAP धुंधला की परवाह किए बिना माउस कोशिकाओं चढ़ाया गया है कि क्या की, glial फीडर परत में स्पष्ट किया गया था (न्यूरॉन + glia + 1 ° ab +) या नहीं (न्यूरॉन - glia + 1 ° ab +)। फिर, नकारात्मक नियंत्रण में धुंधला (न्यूरॉन - glia + 1 ° एबी -) नगण्य था। इन परिणामों के चूहे glial फीडर परत ज्यादातर astrocytes की रचना की थी कि दिखाने के लिए, और न्यूरॉन्स उपस्थित थे कि माउस कोशिकाओं जोड़ा गया था केवल जब। उन्होंने यह भी इन संस्कृतियों में मौजूद न्यूरॉन्स माउस से पूरी तरह से शुरु हुआ कि संकेत मिलता है।

ऑनलाइन वीडियो का परिणाम धारा भी बो एक glial फीडर परत, पर चढ़ाया सुसंस्कृत न्यूरॉन्स की डीआईसी और MAP2 छवियों से पता चलता हैवें जंगली प्रकार चूहों के सीए 3-सीए 1 हिप्पोकैम्पस क्षेत्र से तैयार किया।

सेल संस्कृति का विस्तृत नियंत्रण के लिए, यह दोनों मस्तिष्क विच्छेदन और सेलुलर हदबंदी चरणों के सामान्य गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, और पूर्व निर्धारित घनत्व पर चढ़ाना कोशिकाओं के लिए जीवित कोशिकाओं के घनत्व को मापने के लिए सिफारिश की है। ठेठ घनत्व माप के चार सेट नीचे सूचीबद्ध हैं। इन नंबरों संस्कृति की स्थिति और अभिकर्मकों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, हालांकि, कि ध्यान दें। उदाहरण के लिए, एक ही विक्रेता से सीरम की भी अलग बहुत से परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार, इन नंबरों एक सामान्य सूचक है, बजाय एक निरपेक्ष दिशानिर्देश पर विचार किया जाना चाहिए।

सेलुलर हदबंदी (कदम 3.1.13) के लिए, एक पिल्ला से प्राप्त रहते सेल घनत्व के लिए विशिष्ट मान रहे हैं: ~ 2 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल (माउस मोटर प्रांतस्था और माउस सीए 3-सीए 1 हिप्पोकैम्पस), ~ 5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल (माउस सेरेब्रल कॉर्टेक्स और चूहे सीए 3-सीए 1 हिप्पोकैम्पस), और ~ 1 एक्स 10 6 गएल / एमएल (माउस स्ट्रिएटम)। इन सभी मामलों में, जीवित कोशिकाओं के भागों (कोशिकाओं की कुल संख्या की है कि जीवित कोशिकाओं की संख्या के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया, व्यवहार्यता)> 90% थे। मोटर कॉर्टेक्स शिथिल तुरंत स्ट्रिएटम से 20 पृष्ठीय निहित है कि सेरेब्रल कॉर्टेक्स के क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है। हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों के लिए, हिप्पोकैम्पस के सीए 3 और सीए 1 क्षेत्रों उचित पसंद कर रहे हैं। पूरे हिप्पोकैम्पस अतिरिक्त दाना कोशिकाओं की बड़ी तंत्रिका टर्मिनलों के गठन की ओर जाता है और synaptic गुणों 21 में विविधता का परिचय शामिल किए जाने हैं जिनमें से दांतेदार गाइरस, भी शामिल है। striatal संस्कृति पूंछवाला-पुटामेन और ग्लोबस पैलिडस शामिल है, लेकिन नाभिक accumbens शामिल हैं, या आसपास के ढांचे में औसत दर्जे या पार्श्व सेप्टल नाभिक नहीं करता है।

माउस glial संस्कृति (कदम 3.2.11) के लिए, चढ़ाना घनत्व ~ 2 एक्स के घनत्व पर प्रत्येक 12 मिमी दौर coverslip पर ~ 10,000 glial कोशिकाओं का उपयोग करते हुए ~ सेल निलंबन के 50 μl है10 5 कोशिकाओं / एमएल। आमतौर पर तैरनेवाला में मापा घनत्व अपेक्षाकृत स्थिर है और समायोजन की आवश्यकता नहीं है। विभिन्न क्षेत्रों से अधिक घनत्व में कन्वर्ट करने के लिए, उपयोगी जानकारी coverslip के 1.20 सेमी की एक व्यास और 1.13 सेमी 2 का एक क्षेत्र है कि है। इस प्रकार, ~ 10,000 कोशिकाओं / coverslip के = ~ 8800 कोशिकाओं / एक coverslip पर 2 सेमी।

चूहे glial संस्कृति (कदम 3.3.12) के लिए, चढ़ाना घनत्व ~ 1x10 4 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर सेल निलंबन के ~ 100 μl का उपयोग कर, प्रत्येक 12 मिमी दौर coverslip पर ~ 1000 glial कोशिकाओं है। इस प्रकार, 1000 कोशिकाओं / coverslip के = ~ 900 कोशिकाओं / एक coverslip पर 2 सेमी।

कम घनत्व माउस न्यूरोनल संस्कृति (कदम 3.4.4) के लिए, चढ़ाना घनत्व 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 2000 के बीच और 48,000 कोशिकाओं के बीच है। चूहे glial कोशिकाओं पर न्यूरॉन्स चढ़ाना जब ठेठ मान रहे हैं: 10,000-24,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से मस्तिष्क cortical न्यूरॉन्स के लिए, 12,000-24,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से सीए 3-सीए 1 हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स और 2 के लिएअच्छी तरह से striatal न्यूरॉन्स के लिए 4,000-48,000 कोशिकाओं /। माउस glial कोशिकाओं पर चढ़ाना है, जब संख्या कम है, उदाहरण के लिए, 2000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से करने के लिए सीए 3-सीए 1 hippocampal न्यूरॉन्स। एक तरफ ध्यान दें के रूप में, एक चूहे glial फीडर परत पर चूहा सीए 3-सीए 1 hippocampal न्यूरॉन्स चढ़ाना के लिए, चढ़ाना घनत्व / अच्छी तरह से 1,000-6,000 कोशिकाओं है। एक coverslip पर घनत्व के लिए एक अच्छी तरह से में घनत्व परिवर्तित करने के लिए, उपयोगी जानकारी तल पर आंतरिक अच्छी तरह व्यास 1.56 सेमी है और अपने क्षेत्र 1.91 सेमी 2 है। इस प्रकार, उदाहरण के लिए, 12,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह = 7100 कोशिकाओं / coverslip के = 6300 कोशिकाओं को एक coverslip पर / 2 सेमी। ये घनत्व उच्च संकल्प सेलुलर इमेजिंग के लिए अपेक्षाकृत विरल न्यूरॉन्स संवर्धन के उद्देश्य से चुने गए हैं। शोधकर्ताओं का सबसे अच्छा उनकी प्रयोगात्मक उद्देश्य के अनुरूप है कि उनकी संख्या का चयन करना चाहिए।

चित्रा 1
चित्रा चूहों के 1. टैटू पंजा पैड। एनewborn चूहों पंजा पैड गोदने द्वारा चिह्नित किया गया था। वे (3 सप्ताह पुराने) उम्र के 3 हफ्तों में, गोदना (नवजात) के तुरंत बाद फोटो खिंचवाने और उम्र (32 सप्ताह पुराने) के 32 सप्ताह में किया गया था। लेबल वयस्कता भर में आसानी से दिखाई बने रहे। छवियाँ विभिन्न जानवरों से लिया गया था। वे एक ही पैमाने पर नहीं दिखाया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2. जंगली प्रकार की जीनोटाइपिंग (Tor1a / + +) विषमयुग्मजी (Tor1a / + ΔE) और समयुग्मक (Tor1a ΔE / ΔE) Tor1a जीन alleles के जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती में विश्लेषण किया गया तोड़े में चूहों। ΔE-torsinA रूपों, का उपयोग डीएनए नवजात पिल्ले की पूंछ से निकाली गई। टीबीमार सुझावों लंबाई में ~ 4 मिमी थे। डीएनए SYBR सुरक्षित डीएनए जेल दाग का उपयोग कर सना हुआ था। Tor1a जीन के लिए प्राइमरों और थर्मल साइकिल कार्यक्रम के बारे में जानकारी के लिए सामग्री / उपकरण की तालिका देखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
सामग्री शुरू की राशि में भिन्नता के संदर्भ में जीनोमिक डीएनए की चित्रा 3. जांच। अलग अलग लंबाई की पूंछ सुझावों इस्तेमाल किया गया। परीक्षित जानवरों तीन सप्ताह पुराने थे, विषमयुग्मजी ΔE-torsinA तोड़े में चूहों (Tor1a / + ΔE)। लेन दो प्रतियों में (बाएं से), 2, 3, 4 और 5 मिमी की पूंछ लंबाई का प्रतिनिधित्व करते हैं। पूंछ सुझावों अलग चूहों से प्राप्त किया गया। वाम-पंथी लेन में आणविक वजन आकार मार्कर के डीएनए की लंबाई का प्रतिनिधित्व100 आधार जोड़े की teps। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
पशु उम्र में भिन्नता के संदर्भ में जीनोमिक डीएनए 4. जांच चित्रा। (ए) Tor1a जीन। (बाएं से डुप्लिकेट में) ~ 24 सप्ताह पुरानी तीन सप्ताह पुरानी, ​​नवजात शिशु, और (ख): लेन निम्नलिखित चरणों में विषमयुग्मजी ΔE-torsinA तोड़े में चूहों (Tor1a / + ΔE) से प्राप्त पूंछ सुझावों का प्रतिनिधित्व करते हैं। Tfap2a जीन। (बाएं से डुप्लिकेट में) ~ 24 सप्ताह पुराने नवजात शिशु, 3 सप्ताह पुरानी है, और: लेन निम्नलिखित चरणों में जंगली प्रकार (Tfap2a / + +) चूहों से प्राप्त की पूंछ सुझावों का प्रतिनिधित्व करते हैं। दोनों जीनों पूंछ की लंबाई में ~ 4 मिमी से परिलक्षित किया गया। उम्मीद है और पीसीआर टुकड़ा 498 बीपी है। पीसीआर कार्यक्रम वा Tor1a जीन के लिए इस्तेमाल किया है कि के रूप में ही है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
पीसीआर amplicon की लंबाई में भिन्नता के संदर्भ में जीनोमिक डीएनए की चित्रा 5. जांच। Tfap2a जीन पीसीआर amplicon 498 बीपी की लंबाई (बाएं गलियों), 983 बी पी (मध्य गलियों) और 1990 बीपी (दाएं गलियों) के साथ विश्लेषण किया गया था डुप्लिकेट। जीन तीन सप्ताह पुरानी चूहों की पूंछ से परिलक्षित किया गया था। जेल की वाम-पंथी और दाएँ गलियों में आणविक वजन आकार मार्कर के क्रमश: 100 और 200 आधार जोड़े के चरणों में डीएनए लंबाई का प्रतिनिधित्व करते हैं। विभिन्न amplicons के लिए प्राइमरों के बारे में जानकारी के लिए सामग्री / उपकरण की तालिका देखें। 879fig5highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
डीएनए निष्कर्षण विधि में परिवर्तन के संदर्भ में जीनोमिक डीएनए के 6 चित्रा जांच। मार्गदर्शन के लिए परिणामों में, एकल ट्यूब निष्कर्षण (मैनुअल) और स्वचालित, समानांतर बहु-ट्यूब निष्कर्षण तरीकों (ऑटो) की तुलना कर रहे हैं। बाद विधि इस रिपोर्ट को भर में इस्तेमाल किया गया था। जीन पूंछ नवजात शिशुओं से एकत्र की लंबाई में ~ 4 मिमी, से परिलक्षित किया गया। ΔE-torsinA की नवजात पिल्ले (क) में Tor1a जीन दस्तक में चूहों। लेन (मैनुअल और स्वचालित) जंगली प्रकार, विषमयुग्मजी (मैनुअल और स्वचालित), और समयुग्मक चूहों (मैनुअल और स्वचालित) (बाएं से) से निकाले DNAs प्रतिनिधित्व करते हैं। तीन सप्ताह पुराने जंगली प्रकार चूहों में (बी) Tfap2a जीन। उम्मीद है और पीसीआर टुकड़ा 498 बीपी है।jove.com/files/ftp_upload/51879/51879fig6highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
Glial कोशिकाओं पहले संस्कृति में चढ़ाया जाता है के बाद चित्रा 7. माउस (ए) और चूहे (बी) glial फीडर परतों पर माउस न्यूरॉन्स चढ़ाना के लिए, प्रक्रियाओं का योजनाबद्ध चित्र सरलीकृत। संख्या दिनों की (इन विट्रो में दिन) संचयी दिनों के लिए उल्लेख बोतल। वे केवल एक मोटा अनुमान के रूप में सेवा करते हैं। व्यावहारिक जानकारी के लिए, प्रक्रियाएं खंड देखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

8 चित्रा
8 चित्रा सहायक प्रभावएक कम घनत्व संस्कृति में हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के विकास पर glial फीडर परत की। न्यूरॉन्स नवजात शिशु, जंगली प्रकार चूहों के हिप्पोकैम्पस के सीए 3-सीए 1 क्षेत्र से प्राप्त किया गया। (ए) माउस हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं लेपित गिलास coverslips, पर चढ़ाया गया जो हिप्पोकैम्पस के सीए 3-सीए 1 क्षेत्र से प्राप्त एक चूहे glial फीडर परत के साथ पूर्व वरीयता प्राप्त किया गया था। न्यूरॉन्स एक स्वस्थ तरीके से समान रूप से बिखरे थे। संस्कृति 3, 7 और 14 DIV पर मनाया गया। (बी, सी) माउस हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं कोई पूर्व स्थापित फीडर परत था जो लेपित गिलास coverslips, पर चढ़ाया गया था। संस्कृति 3 DIV (बी में शीर्ष पैनल) और ARAC इलाज के बिना 7 DIV (सी में मध्यम पैनल) में मनाया गया। संस्कृतियों के दूसरे सेट में, कोशिकाओं 3 DIV (बी में नीचे पैनल) और 7 DIV (सी में नीचे पैनल) में ARAC साथ इलाज किया गया, और 14 DIV में मनाया। सभी छवियों जिसका न्यूरॉन्स एक ही दिन पर चढ़ाया गया एक ही पिल्ला, से प्राप्त बहन संस्कृतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। विवरण के लिए पाठ देखें। प्रत्येक कक्ष के लिए, एक पूर्वएक न्यूरॉन की पर्याप्त एक सफेद नोक ने संकेत दिया और एक इनसेट में बढ़ाया है। न्यूरॉन्स जिसका परिधि चरण विपरीत प्रकाशिकी द्वारा देखे जाने पर उज्ज्वल दिखाई देता है सेल शरीर है, और वे भी मोटी प्रक्रिया है। तारक glial कोशिकाओं के बिना क्षेत्रों से संकेत मिलता है। संस्कृतियों (1x पर, यानी) एक मध्यवर्ती लेंस के बिना 20X उद्देश्य लेंस (0.45 की संख्यात्मक एपर्चर) के साथ चरण विपरीत प्रकाशिकी का उपयोग कर एक औंधा माइक्रोस्कोप पर लाइव imaged थे। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

9 चित्रा
एक कम घनत्व संस्कृति में मस्तिष्क cortical न्यूरॉन्स के विकास पर glial फीडर परत चित्रा 9. सहायक प्रभाव। लेकिन सी की मोटर क्षेत्र से प्राप्त न्यूरॉन्स के साथ 8 चित्रा में के रूप में इसी तरह के परिणाम,erebral कॉर्टेक्स। एसी 8 चित्रा में उन लोगों के अनुरूप लेबल के तहत की स्थिति है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

10 चित्रा
10 चित्रा एक कम घनत्व संस्कृति में striatal न्यूरॉन्स के विकास पर glial फीडर परत का समर्थन प्रभाव। आंकड़े 8 और 9 के रूप में, लेकिन स्ट्रिएटम से प्राप्त न्यूरॉन्स के साथ इसी तरह के परिणाम। एसी 8 चित्रा में उन लोगों के अनुरूप लेबल के तहत की स्थिति है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 11. न्यूरोनल अस्तित्व पर glial फीडर परत का समर्थन प्रभाव। जीवित न्यूरॉन्स की संख्या चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत छवियों का उपयोग, 8 चित्रा में दिखाया गया प्रयोगों में गिना गया। 14 DIV के लिए छवियों को फिर यहाँ दिखाया गया है, लेकिन तीर के साथ गिना न्यूरॉन्स के उदाहरण की ओर इशारा कर रहे हैं। बार ग्राफ (प्रत्येक संस्कृति हालत के लिए 7-24 क्षेत्रों मतलब की मानक त्रुटि ± मतलब, एन =) छवि क्षेत्र (449.0 माइक्रोन एक्स 335.5 मीटर) प्रति न्यूरॉन्स की संख्या से पता चलता है। '(-), ARAC 3 div पर Glial फीडर परत' और 'Glial फीडर परत (-), ARAC 7 div पर' 'Glial फीडर परत (+)' (से * पी <0.05, ** तारांकनों का सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेदों का संकेत पी <0.01, अयुगल छात्र के टी -test)। सलाखों के ऊपर संख्या एकाधिक छवि क्षेत्रों के montages में मापा न्यूरोनल घनत्व संकेत मिलता है। छवियाँ थेएक 20x उद्देश्य लेंस का प्रयोग कर प्राप्त कर लिया। अधिग्रहण के पूर्वाग्रह से बचने के लिए सभी छवियों को एक coverslip के ऊपर से नीचे तक, एक पूर्ण खड़ी पट्टी साथ हासिल कर लिया और coverslip के अनुमानित केंद्र के माध्यम से गुजर रहे थे। व्यक्तिगत छवियों (ऊपर और नीचे एक छवि क्षेत्र के 1/4 जैसे, 06/01) कुछ ओवरलैप था। दो तरीकों के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया। एक में, न्यूरॉन्स व्यक्तिगत न्यूरॉन्स एक बार से अधिक नहीं गिना गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए छवियों बारी में गिना रहे थे। जिसके परिणामस्वरूप संख्या बार ग्राफ उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया। दूसरी विधि में, एक ही असेंबल व्यक्तिगत छवियों से बनाया गया था। वे फ़ोटोशॉप का उपयोग कर मैन्युअल रूप से छवि समग्र संपादक का या सिले थे। montages के भी एक ही न्यूरॉन्स के कई मायने बाहर रखा गया है। जिसके परिणामस्वरूप संख्या सलाखों के ऊपर सूचीबद्ध हैं। दोनों तरीकों में, किसी भी कोशिकाओं शामिल नहीं किया था कि coverslip के परिधि में व्यापक क्षेत्रों निकाल दिए गए थे। वे उज्ज्वल दिखाई दिया कि सेल शरीर था प्रकोष्ठों न्यूरॉन्स के रूप में गिना गयाचरण विपरीत माइक्रोस्कोपी, साथ ही विस्तारित सेलुलर प्रक्रियाओं के द्वारा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 12
Neuronal संस्कृतियों में सेल प्रकार के 12 चित्रा Immunocytochemical पहचान। संस्कृति हालत चित्रा 8A के नीचे-बाएं छवि से मेल खाती है। न्यूरॉन्स जंगली प्रकार चूहों के हिप्पोकैम्पस के सीए 3-सीए 1 क्षेत्र से प्राप्त किया है, और जंगली प्रकार चूहों के हिप्पोकैम्पस के सीए 3-सीए 1 क्षेत्र से उत्पन्न एक glial फीडर परत पर चढ़ाया गया था। संवर्धित कोशिकाओं neuronal मार्कर MAP2 के लिए immunocytochemistry, और astrocytic glial सेल मार्कर GFAP के द्वारा विश्लेषण किया गया। अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी, 14-17 imaged क्षेत्रों के सामान्य आकृति विज्ञान प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया गया थान्यूरॉन्स के बाद दिन glial फीडर परत पर चढ़ाया गया था। (ए) के तीन रंग धुंधला हो जाना, परमाणु मार्कर Hoechst 33,342 डाई के साथ counterstaining भी शामिल है। दो प्रतिनिधि छवि क्षेत्रों दिखाए जाते हैं। (बी) के दो रंग धुंधला हो जाना, अलग fluorophores के साथ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के विभिन्न संयोजनों के साथ। 2 CaCl, 2 125 सोडियम क्लोराइड, 2 KCl, 2 2 MgCl, 30 ग्लूकोज़, 25 HEPES, पीएच 7.4: इन प्रयोगों में, संवर्धित कोशिकाओं Tyrode का समाधान (मिमी में, युक्त में 4% paraformaldehyde और 4% sucrose के साथ तय किया गया 5 एम NaOH के साथ समायोजित, ~ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए समायोजन के बिना 310 mOsm)। Tyrode समाधान के साथ धोया जा रहा है के बाद, वे 10 मिनट के लिए Tyrode के समाधान में 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ permeabilized थे। वे फिर से Tyrode के समाधान के साथ धोया और फिर आरटी पर 60 मिनट के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) (अवरुद्ध समाधान) में 2% सामान्य बकरी सीरम के साथ अवरुद्ध किया गया। इसके बाद वे खरगोश पाली के साथ इलाज किया गयाक्लोनल विरोधी MAP2 एंटीबॉडी (AB5622; अवरुद्ध समाधान में 400x कमजोर पड़ने), और माउस मोनोक्लोनल विरोधी GFAP कॉकटेल (NE1015; 1,000x कमजोर पड़ने) हे / एन (15-21 घंटा) 4 डिग्री सेल्सियस पर। पीबीएस के साथ washes के बाद, कोशिकाओं (अवरुद्ध समाधान में 500x कमजोर पड़ने) एलेक्सा Fluor 405 के साथ संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश और विरोधी माउस आईजीजी एंटीबॉडी, एलेक्सा Fluor 488 (1,000x) या 60 के लिए एलेक्सा Fluor 568 डाई (500x) के साथ incubated रहे थे आरटी पर मि। वे पीबीएस के साथ धोया और पीबीएस में सीधे मनाया गया। कुछ संस्कृतियों में, उपरोक्त प्रक्रिया में अंतिम धोने के बाद, कोशिकाओं आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल Hoechst 33342 के साथ इलाज किया गया है, और अवलोकन से पहले पीबीएस के साथ धोया। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा।

चित्रा 13
चित्रा 13. Immunocytochemical glial फीडर परत संस्कृतियों में सेल प्रकार की पहचान। चित्रा 12 में के रूप में चूहे glial फीडर परतों की बहन संस्कृतियों, लेकिन माउस न्यूरॉन्स की चढ़ाना के बिना। (ए) चित्रा 12A में वर्णित immunocytochemical प्रक्रियाओं का उपयोग धुंधला। दो प्रतिनिधि छवि क्षेत्रों। दिखाया ए में वर्णित immunocytochemical प्रक्रियाओं का उपयोग glial फीडर परत (बी) धुंधला है, लेकिन प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ छोड़े गए हैं। आंकड़े 12A और 13A, बी के सभी MAP2 छवियों को एक ही इमेजिंग शर्तों के तहत हासिल किया गया है, और तीव्रता की तुलना अनुमति देने के लिए एक ही छवि के विपरीत पर दिखाए जाते हैं। उसी प्रक्रिया आंकड़े 12A और 13A, बी में GFAP छवियों के लिए इस्तेमाल किया गया। glial फीडर परत संस्कृति चित्रा 12 में संस्कृतियों के रूप में एक ही दिन में उतारी थी। इस प्रकार glial फीडर परतों में 13 के समय की एक ही राशि के लिए इन विट्रो में सुसंस्कृत थे आंकड़े> छ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 14
Immunocytochemical धुंधला हो जाना 14. तीव्रता चित्रा। लाइन्स आंकड़े 12 और 13 में दिखाया गया चित्र पर तैयार किया गया है, और इन के साथ तीव्रता साजिश रची गई थी। Insets चित्रा 12A की शीर्ष पंक्ति में छवियों को दिखाने के लिए। तीन शर्तों थे: प्राथमिक एंटीबॉडी (न्यूरॉन + glia + 1 ° ab +) के साथ एक चूहे फीडर परत और धुंधला पर माउस कोशिकाओं (युक्त न्यूरॉन्स) की 1) चढ़ाना, 2) glial फीडर परत केवल (कोई न्यूरोनल चढ़ाना) और प्राथमिक एंटीबॉडी (न्यूरॉन - glia + 1 ° ab +) के साथ धुंधला हो जाना, और 3) glial फ़ीड(- glia + 1 ° एबी - न्यूरॉन) एर केवल (कोई न्यूरोनल चढ़ाना) और धुंधला प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना परत। माउस कोशिकाओं (कंडीशंस 1 बनाम 2) चढ़ाया, और glial धुंधला (GFAP) संस्कृतियों (कंडीशंस 1 बनाम 2) के दोनों सेट में मौजूद था केवल जब neuronal धुंधला (MAP2) उपस्थित थे। Immunocytochemical धुंधला हो जाना दोनों को प्राथमिक एंटीबॉडी (कंडीशंस 1 बनाम 3) के लिए विशिष्ट था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

समाधान
TAE बफर (50x समाधान)
Tris आधार, 486 जी
हिमनदों एसिटिक एसिड, 114.2 मिलीलीटर
0.5 एम EDTA, पीएच 8.0, 200 मिलीलीटर
2 एल के लिए कुल मात्रा लाने के लिए आसुत जल जोड़ें
एक रासायनिक धूआं हुड में अप करें।
उपयोग करने से पहले 50 गुना पतला।
हैंक्स 'समाधान
हैंक्स 'बैलेंस्ड साल्ट, कैल्शियम क्लोराइड, मैग्नीशियम सल्फेट और सोडियम बाइकार्बोनेट के बिना (1 एल के लिए)
3 NaHCO, 350 मिलीग्राम (अंतिम एकाग्रता 4.17 मिमी)
HEPES, 2.38 ग्राम (अंतिम एकाग्रता, 10 मिमी)
5 एम NaOH का उपयोग कर 7.4 पीएच को समायोजित करें।
(Osmolarity किसी भी समायोजन के बिना ~ 290 mOsm के लिए जाता है) सुक्रोज का उपयोग कर 310 mOsm को परासारिता समायोजित करें।
1 एल के लिए कुल मात्रा लाने के लिए आसुत जल जोड़ें
(मस्तिष्क के ऊतकों की ट्रिप्सिन इलाज के लिए) पाचन समाधान
सोडियम क्लोराइड, 800.6 मिलीग्राम (अंतिम एकाग्रता, 137 मिमी)
KCl, 37.3 मिलीग्राम (चinal एकाग्रता, 5 मिमी)
ना 2 HPO 4 · (7H 2 ओ), 187.6 मिलीग्राम (अंतिम एकाग्रता, 7 मिमी)
HEPES, 595.8 मिलीग्राम (अंतिम एकाग्रता, 25 मिमी)
ग्लूकोज, 97.3 मिलीग्राम (अंतिम एकाग्रता, 5.4 मिमी)
5 एम NaOH का उपयोग कर पीएच 7.2 करने के लिए समायोजित करें।
Osmolarity किसी भी समायोजन के बिना ~ 310 mOsm जाता है।
100 मिलीलीटर के लिए कुल मात्रा लाने के लिए आसुत जल जोड़ें।
सही उपयोग से पहले, trypsin के 20 मिलीग्राम DNase की और 20 μl (10 मिलीग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता) पाचन समाधान के 2 मिलीलीटर (750 इकाइयों / एमएल के अंतिम एकाग्रता) जोड़ें।
(मस्तिष्क के ऊतकों के यांत्रिक हदबंदी के लिए) हदबंदी समाधान
हैंक्स 'समाधान
MgSO 4 · (7H 2 ओ), 295.1 मिलीग्राम (अंतिम concentratiपर, 11.97 मिमी)
सुक्रोज का उपयोग कर 310 mOsm को परासारिता समायोजित करें।
कुल मात्रा 100 मिलीलीटर है।
सही उपयोग से पहले, DNase हदबंदी समाधान के 2 मिलीलीटर (750 इकाइयों / एमएल के अंतिम एकाग्रता) के 20 μl जोड़ें।
(माउस glial कोशिकाओं के लिए) मध्यम एक चढ़ाना
Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM), 449.5 मिलीलीटर
MITO + सीरम भरनेवाला, 0.5 मिलीग्राम
FBS के, 50 मिलीलीटर
कुल मात्रा 500 मिलीलीटर है।
चढ़ाना मध्यम-2 (माउस न्यूरॉन्स के लिए)
Neurobasal-ए, 485 मिलीलीटर
B27, 10 मिलीलीटर
GlutaMAX-मैं, 5 मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता, 2 मिमी)
कुल मात्रा 500 मिलीलीटर है।
चढ़ाना मध्यम-3 (चूहा न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं के लिए)
(फिनोल लाल बिना सदस्य,) न्यूनतम आवश्यक मीडिया
ग्लूकोज, 2.5 जी (अंतिम एकाग्रता, 27.8 मिमी)
3 NaHCO, 100 मिलीग्राम (अंतिम एकाग्रता, 2.38 मिमी)
Transferrin, 50 मिलीग्राम
FBS के, 50 मिलीलीटर
GlutaMAX-मैं, 5 मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता, 2 मिमी)
इंसुलिन, 12.5 मिलीग्राम
कुल मात्रा 500 मिलीलीटर है।
मध्यम विकास (चूहा न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं के लिए)
(फिनोल लाल के बिना) सदस्य
ग्लूकोज, 2.5 जी (अंतिम एकाग्रता, 27.8 मिमी)
3 NaHCO, 100 मिलीग्राम (अंतिम एकाग्रता, 2.38 मिमी)
Transferrin, 50 मिलीग्राम
FBS के,25 मिलीलीटर
GlutaMAX-मैं, 1.25 मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता, 0.5 मिमी)
B27 या NS21 {चेन, 2008 # 2399}, 10 मिलीलीटर
Cytosine β-डी arabinofuranoside (ARAC), 0.56 मिलीग्राम (अंतिम एकाग्रता, 4 माइक्रोन)
कुल मात्रा 500 मिलीलीटर है।
सामान्य टिप्पणी
वे सुसंस्कृत glial कोशिकाओं और न्यूरॉन्स (संदर्भ में 70, 71) पर साइटोटोक्सिक प्रभाव डालती सकता है क्योंकि हमारी संस्कृति मीडिया एंटीबायोटिक दवाओं शामिल नहीं है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण संस्कृति से संबंधित काम में प्रक्रियाओं बाँझ का पालन करना पड़ता है।
रसायनों की विस्तृत स्रोतों के लिए अभिकर्मकों की तालिका देखें।

तालिका 1. समाधान

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल पूंछ सुझावों से चूहों जीनोटाइपिंग के लिए, / लेबल चूहों की पहचान करने के गोदने के लिए प्रक्रियाओं में शामिल हैं, और कम घनत्व पर संवर्धन माउस मस्तिष्क न्यूरॉन्स के लिए। 6-8 पिल्ले का उपयोग करते हुए प्रयोगों के एक दौर में, इन प्रक्रियाओं को आम तौर पर 6-7 घंटे के कुल में क्रमशः ~ 0.5 घंटा, ~ 4 घंटा और ~ 2 घंटा, की आवश्यकता होती है। (Glial फीडर परतों की पूर्व तैयारी के अपवाद के साथ) एक ही दिन काम से भी कम समय में - यह neuronal संस्कृतियों का चढ़ाना पिल्ले 'जन्म के समय से सभी आवश्यक प्रक्रियाओं को पूरा करने के लिए एक एकल प्रयोगकर्ता के लिए यह व्यावहारिक बनाता है।

गोदना

ऊतक विज्ञान, सेल समारोह और पशुओं के व्यवहार का विश्लेषण करती है जैसे जानवरों के लंबे समय तक पहचान प्रजनन और इस तरह के वैज्ञानिक अध्ययन के प्रयोजनों के लिए आवश्यक है। यह तेजी से बाहर ले गए और जानवर के जीवन 7,22-25 के ज्यादा के लिए रहता किया जा सकता है क्योंकि नवजात जानवरों गोदना लाभदायक है। टीपंजा पैड पर attooing, निलंबन में उदाहरण के लिए, परीक्षण योग्य व्यवहार के संरक्षण या 22,26 उत्साहित करने के लिए सम्मान के साथ 23 कतरन पैर के अंगूठे की तुलना में बेहतर हो सकता है कुछ अध्ययनों से इस तरह की कमी का उल्लेख किया नहीं है, हालांकि (जैसे, 25)। खारिज या गोदने के बाद पिल्ले cannibalizing माताओं का कोई उदाहरण नहीं थे। जानवरों के लंबी अवधि के पहचान के अन्य तरीकों के लिए, हाल ही में समीक्षा 7,23,24 देखते हैं।

जीनोटाइपिंग

हमारे प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण सुविधा के लिए एक तेजी से जीनोटाइपिंग विधि का इस्तेमाल होता है। इसी तरह जीनोटाइपिंग विधियों पिछली रिपोर्टों (जैसे, 27,28) में वर्णित किया गया है, यहाँ वर्णित प्रणाली में कम से कम दो सुधार किया है। सबसे पहले, यह शुरू करने के ऊतक, जानवरों की उम्र, और amplicon लंबाई की राशि में कुछ भिन्नताओं को बर्दाश्त कर सकते हैं। इस प्रकार, सफल जीनोटाइपिंग एक दिन के रूप में युवा के रूप में और छह महीने पुरानी है जितनी पुरानी चूहों का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, और एक का उपयोग किया जा सकता हैप्राइमर जोड़े की व्यापक रेंज। दूसरा, इस विधि का डीएनए निष्कर्षण कदम के लिए एक स्थान पर समाधान की आवश्यकता नहीं है। यह अत्यधिक ट्यूब से निपटने और pipetting समाप्त, और एक पीसीआर मशीन के साथ इस प्रक्रिया के समानांतर बहु-ट्यूब स्वचालन की अनुमति देता है। नमूनों की संख्या को बढ़ाया जा सकता है (उदाहरण के लिए, 96 नमूने) अभी तक आसानी से और एक साथ संसाधित। इसके अलावा नमूना प्रकार पूंछ क्लिप करने के लिए ही सीमित नहीं है; इस्तेमाल किया जा सकता है कि अन्य प्रकार नमूना कान घूंसे, पैर के अंगूठे की कतरनों, पूरे जल्दी भ्रूण, और अपरा ऊतकों 2-4,29,30 शामिल हैं। विभिन्न जानवरों की प्रजातियों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रकार जीनोटाइपिंग प्रक्रियाओं विश्वसनीय (कम इंट्रा-परख विचरण के साथ repeatable) और (रनों के बीच या प्रयोगशालाओं के बीच अंतर-परख विचरण कम) प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं, और उच्च scalability का लाभ दिया है।

कुछ सावधानी परिणामों की उम्मीद की गुणवत्ता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है कि ध्यान दें। सबसे पहले, डीएनए निष्कर्षण के दौरान, प्रोटोकॉल में एक बड़े बदलाव का परिणाम नीचा कर सकते हैं।उदाहरण के लिए, डीएनए निष्कर्षण समाधान की मात्रा में उल्लेखनीय कमी (जैसे, कदम 2.2 में 200 से 100 μl से) अभी भी जीनोटाइपिंग की अनुमति देता है, लेकिन यह विश्वसनीयता को कम करने और पीसीआर परिणामों में भिन्नता हो सकती है। इस तरह की स्थितियों के तहत, यह 4 से 2 μl डीएनए निकालने की मात्रा को कम करने, और पीसीआर प्रतिक्रियाओं (2.5 कदम) के दौरान मात्रा बदलने के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए 2 से 4 μl से एच 2 ओ की मात्रा बढ़ाने के लिए सिफारिश की है। पूंछ उसके समग्र संरचना को बनाए रखने जाएगा और पूरी तरह से विघटित नहीं किया जाएगा दूसरा, हालांकि डीएनए निष्कर्षण के अंत में, समाधान, तुरंत ज्यादातर मामलों में centrifugation बिना पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, ट्यूबों के वर्णित उलटा ऊतक (2.4 कदम) से जीनोमिक डीएनए अलग कर के प्रयोजन के लिए आवश्यक है। यह बाद के शामिल किए जाने के अनिर्णायक पीसीआर परिणामों को बढ़ावा मिलेगा, क्योंकि ट्यूब के नीचे मलबे को छोड़कर शीर्ष, समाधान के स्पष्ट हिस्सा है, उपयोग करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। इनचरणों का कम से कम समय और प्रयास के साथ प्रभावी हो जाएगा। समान रूप से अच्छे परिणाम सक्रिय रूप से (व्युत्क्रम की जगह में) नमूना vortexing द्वारा प्राप्त किया जा सकता centrifugation और सतह पर तैरनेवाला के उपयोग के द्वारा पीछा किया। तीसरा, डीएनए निष्कर्षण के बाद, डीएनए लंबी अवधि (जैसे,> दो सप्ताह) के लिए भंडारित किया जा सकता है। यह एक microcentrifuge (जैसे, 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000-13,000 जी), नई ट्यूबों के लिए supernatants हस्तांतरण, और -80 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान का उपयोग कर समाधान अपकेंद्रित्र करने के लिए सिफारिश की है। संग्रहीत निकालने जीनोटाइपिंग के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, जब संक्षिप्त विगलन के बाद नमूना अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला का उपयोग करें।

Neuronal संस्कृतियों

हमारे प्रोटोकॉल की एक और महत्वपूर्ण विशेषता एक कम चढ़ाना घनत्व में neuronal संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक glial फीडर परत का इस्तेमाल होता है। आमतौर पर, स्तनधारी मस्तिष्क न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृतियों में, कोशिकाओं को एक glia बिना लेपित coverslips पर, एक अपेक्षाकृत उच्च घनत्व के साथ चढ़ाया जाता हैएल फीडर परत (जैसे, 31-39)। न्यूरॉन्स की चढ़ाना घनत्व इस पद्धति का उपयोग कम हो जाता है, जब पहले से 40-42 रिपोर्ट के रूप में, glial चादर की प्रारंभिक कमी शायद कारण गरीब glial करने के लिए, गरीब न्यूरोनल विकास और वृक्ष के समान एक्सटेंशन (आंकड़े 8-10 में पैनल बी, सी) की ओर जाता है विकास 43,44।

सफल, कम घनत्व neuronal संस्कृतियों के तरीकों में से कम से कम तीन व्यापक प्रकार के द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है। एक दृष्टिकोण में, Neurobasal मध्यम एक संस्कृति के माध्यम के रूप में प्रयोग किया जाता है। यह एक glial फीडर परत के अभाव में संस्कृति न्यूरॉन्स के लिए यह संभव बनाता है, और कम घनत्व neuronal संस्कृतियों 45,46 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक दूसरा दृष्टिकोण ('बैंकर-प्रकार' और इसके संशोधन) में, glial कोशिकाओं में एक ही कुएं में न्यूरॉन्स के साथ सह सुसंस्कृत हैं, लेकिन शारीरिक रूप से उन लोगों से अलग हो रहे हैं। इस संदर्भ में glial कोशिकाओं उन्हें सीधे संपर्क के बिना न्यूरॉन्स के लिए 'पौष्टिकता समर्थन' प्रदान1,41,42,47-49। तीसरे दृष्टिकोण में, न्यूरॉन्स neuronal विकास (जैसे, 50-53) (आंकड़े 8-10) का समर्थन करता है कि एक पूर्व स्थापित glial फीडर परत पर चढ़ाया जाता है। विशेष रूप से, माउस मस्तिष्क न्यूरॉन्स चूहों 8,34,54 या चूहों 41,55,56 से तैयार एक glial फीडर परत पर चढ़ाया जाता है।

हम Neurobasal मध्यम न्यूरोनल अस्तित्व 57 प्रभावित कर सकते हैं, क्योंकि astrocytic glial कोशिकाओं न्यूरोनल कार्यों 8,58 को विनियमित करने में अनिवार्य हो जाएगा, कम घनत्व संस्कृति के लिए तीन दृष्टिकोण के आखिरी पसंद करते हैं, और न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं के बीच शारीरिक संपर्क किया जा सकता है मुख्य। माउस और चूहे glial कोशिकाओं संवर्धन के लिए प्रक्रियाओं 59,60 समान हैं, लेकिन हम माउस glial कोशिकाओं बनाम चूहे के और अधिक तेजी से इन विट्रो विकास के लिए समायोजित करने के लिए उन्हें थोड़ा संशोधित किया है। चूहे सेल संस्कृति के लिए प्रक्रियाओं 61-63 संशोधित किया गया है। एक glial फीडर लेय का उपयोगकम घनत्व neuronal संस्कृतियों के लिए आर 1 (यह आवश्यक हो, तेजी से जीनोटाइपिंग प्रदर्शन पिल्ले 'जन्म और नवजात मृत्यु या संस्कृति खिड़की के अंत के बीच की अवधि के भीतर न्यूरॉन्स की है कि फीडर परत के जीनोटाइप मैच के लिए आदेश में करने के लिए बनाता है -2 प्रसव के बाद दिन)।

एक मस्तिष्क (जैसे, norepinephrine रिहा ठिकाना coeruleus, और डोपामाइन रिहा सब्सटेंशिया निग्रा) में छोटे नाभिक की संस्कृति न्यूरॉन्स की कोशिश करता है जब एक glial फीडर परत पर कम घनत्व संस्कृति भी एक महत्वपूर्ण तरीका है। उन नाभिक न्यूरॉन्स की केवल एक छोटा सा संख्या में होते हैं और अनिवार्य रूप से कम घनत्व संस्कृतियों 64-67 उपज होगा।

प्राथमिक संस्कृतियों नियमित हिप्पोकैम्पस, सेरेब्रल कॉर्टेक्स के मोटर क्षेत्र और चूहों के स्ट्रिएटम के सीए 3-सीए 1 क्षेत्र से हमारी प्रयोगशाला में तैयार कर रहे हैं। उसी प्रक्रिया का उदाहरण पूरे हिप्पोकैम्पस (incl के लिए, अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करने neuronal संस्कृतियों को तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैदांतेदार गाइरस) और पूरे सेरेब्रल कॉर्टेक्स uding। ऐसे हिप्पोकैम्पस और ठिकाना coeruleus के रूप में मस्तिष्क क्षेत्रों से चूहा न्यूरॉन्स चूहे glial फीडर परत का उपयोग, इसी तरह फैशन में सुसंस्कृत हैं। ये सभ्य न्यूरॉन्स आमतौर पर प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर संस्कृति की सही उम्र के साथ, इन विट्रो में 1-4 सप्ताह में किया जाता है। यह एक glial फीडर परत पर सुसंस्कृत कुछ न्यूरॉन्स अधिक से अधिक 10 सप्ताह 34,68 के लिए जीवित रह सकते हैं कि नोट के है।

कम घनत्व न्यूरोनल संस्कृतियों में से एक संभावित समस्या न्यूरोनल गुण उच्च घनत्व संस्कृतियों में या बगल में न्यूरॉन्स में उन लोगों से अलग किया जा सकता है। इन प्रणालियों की तुलना में इस तरह के न्यूरोनल घनत्व, न्यूरॉन्स से स्रावित घुलनशील कारकों, न्यूरॉन-टू-न्यूरॉन से संपर्क करें, और glial-न्यूरोनल बातचीत के रूप में कई कारकों से प्रभावित हैं कैसे न्यूरोनल विकास और परिपक्वता का अध्ययन करने के लिए एक दिलचस्प अवसर प्रदान करता है।

सारांश में, tattooiएनजी आधारित माउस लेबलिंग लंबे समय तक चलने है, जीनोटाइपिंग विधि तेजी से है, और संस्कृति विधि कम घनत्व पर माउस न्यूरॉन्स चढ़ाना के लिए अनुमति देता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल अन्य आनुवंशिक परिवर्तन शरण अन्य जानवरों की प्रजातियों के लिए अपनी संपूर्णता में लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल के अलग-अलग चरणों अन्य उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रकार प्रोटोकॉल प्रयोगकर्ताओं की जरूरतों के आधार पर आवेदनों की एक विस्तृत सरणी में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS - tattooing
Machine Cleanser Animal Identification and Marking Systems, Inc. NMCR3 This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent Animal Identification and Marking Systems, Inc. NDAR4 This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment Animal Identification and Marking Systems, Inc. NBP01
Skin Prep Applicator Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSPA1 Q-tip.
Skin Prep solution Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSP01 This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format) EZ BioResearch LLC G2001-100
2X PCR Ready Mix II EZ BioResearch LLC G2001-100 A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial VWR BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade rpi A20090-500  We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA) Fisher BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl Dot Scientific Inc UG104-96RS  Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl Dot Scientific Inc UG2020-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl Dot Scientific Inc UG2812-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp EZ BioResearch LLC L1001 We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp EZ BioResearch LLC L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder GIBCO-Invitrogen 10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml  USA Scientific 1402-2900 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual  rpi 145660 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural USA Scientific 1605-0000 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO GIBCO-Invitrogen S33102
Tris base rpi T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement GIBCO-Invitrogen 17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated BD falcon 353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml BD falcon 353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml BD falcon 353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml BD falcon 352095
Countess (cell number counter) chamber slides GIBCO-Invitrogen C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) Sigma-Aldrich C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC) Sigma-Aldrich G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm Pyrex 3160-101
Distilled water GIBCO-Invitrogen 15230-147
DNase Type II Sigma-Aldrich D4527-200KU Stock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate GIBCO-Invitrogen 10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 569-0020
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO-Invitrogen 26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0 Carolina 633017
GlutaMAX-I GIBCO-Invitrogen 35050-061
Hanks' Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma-Aldrich H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent Sigma-Aldrich 258148-100 ML
Insulin Sigma-Aldrich I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka) Sigma-Aldrich 63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free BD Biosciences 356237 This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM) GIBCO-Invitrogen 51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml BD Biosciences 355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate BD falcon 353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate BD falcon 353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid GIBCO-Invitrogen 10888-022
Nitric Acid VWR bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21  prepared in the lab Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”  Fisher 13-678-6A Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”  Fisher 13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0% Sigma-Aldrich P9333-500G
Serological pipet, 2 ml BD falcon 357507
Serological pipet, 5 ml  BD falcon 357543
Serological pipet, 10 ml BD falcon 357551
Serological pipet, 25 ml BD falcon 357525
Serological pipet, 50 ml  BD falcon 357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis Sigma-Aldrich 480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich Sigma-Aldrich 431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC) Sigma-Aldrich S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm Corning 431219
Syringe, 3 ml BD falcon 309585
Transferrin, Holo, bovine plasma Calbiochem 616420
Trypan Blue stain, 0.4% GIBCO-Invitrogen T10282 This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI Sigma-Aldrich T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%  GIBCO-Invitrogen 25200-056
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2 Merck Millipore AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail Merck Millipore NE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMS Animal Identification and Marking Systems, Inc. NEO–9 This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GT BIO–RAD 170–4405 Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800 ProteinSimple FluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal Cycler BIO-RAD PTC-1148EDU Our PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac Basic BIO-RAD 164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, Countess GIBCO-Invitrogen C10310 This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2 NUAIRE NU-425-400 This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket NUAIRE NU-4850
Horizontal Clean Bench NUAIRE NU-201-330 This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed Shaker Labnet S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge Fisher 46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 95 AP2 जीनोटाइपिंग glial फीडर परत माउस पूंछ न्यूरोनल संस्कृति न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण पीसीआर टैटू torsinA
पशु की रैपिड जीनोटाइपिंग मस्तिष्क न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृतियों की स्थापना के द्वारा पीछा किया
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Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., … More

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).

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