Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Быстрое Генотипирование животных Круги путем создания первичных культурах мозга нейронов

doi: 10.3791/51879 Published: January 29, 2015
* These authors contributed equally

Summary

Мы описываем процедуры для маркировки и генотипирования новорожденных мышей и генерации первичных нейронов культур от них. Генотипирование является быстрым, эффективным и надежным, и позволяет для автоматического нуклеиновых кислот добычи. Это особенно полезно для неонатально летальных мышей и их культур, которые требуют предварительного завершения генотипирования.

Abstract

Высокое разрешение анализ морфологии и функции нейронов млекопитающих часто требует генотипирование индивидуальных животных с последующим анализом первичных культурах нейронов. Мы описываем набор процедур для: маркировка новорожденных мышей генотипировать, быстрый генотипирование, а также создание низкой плотности культуры мозга нейронов этих мышей. Индивидуальные мышей помечены татуировки, которая позволяет для долгосрочного идентификации прочного во взрослую жизнь. Генотипирование с помощью описанного протокола является быстрым и эффективным, а также позволяет для автоматического извлечения нуклеиновой кислоты с хорошей надежности. Это полезно в условиях, когда достаточно времени для обычного генотипирования недоступен, например, у мышей, которые страдают от новорожденных летальности. Первичные культуры нейронов генерируются при низкой плотности, что позволяет эксперименты изображений с высоким пространственным разрешением. Этот метод культура требует подготовки глиальных слоев фидерных до нейронов покрытия. Рrotocol применяется в полном объеме в мышиной модели в двигательные расстройства DYT1 дистонии (Е-torsinA плей-у мышей), а нейронные культуры готовят из гиппокампа, коры головного мозга и полосатом теле этих мышей. Этот протокол может быть применен к мышей с другими генетических мутаций, а также животных других видов. Кроме того, отдельные компоненты протокола могут быть использованы для изоляции суб-проектов. Таким образом, этот протокол будет иметь широкое применение не только в неврологии, но и в других областях биологических и медицинских наук.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Моделях грызунов генетических заболеваний оказались полезными в установлении физиологических функций нормальных белков и нуклеиновых кислот, а также в патофизиологических последствий дефектов в них. Примеры включают мышей, дефицитных по белков, участвующих в ключевых клеточных функций, а также мышиные модели заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. Тем не менее, некоторые генетические манипуляции могут привести к неонатальной смертности в ближайшее время или через несколько дней после рождения. В этих случаях, первичные культуры клеток являются важным инструментом, потому что живые клетки могут быть получены из эмбриональных или новорожденных щенков до смерти, они могут сохраняться в течение по крайней мере нескольких недель в пробирке, и в течение этого времени в начале развития нейронов может сопровождаться биохимические, функциональные и морфологические эксперименты. Для первичных культур, то может быть выгодно, чтобы пластины нейроны при низкой плотности; это позволяет визуализировать отдельные somata, дендриты, аксональные валы и нервных TERMIналов с высоким пространственным разрешением. Тем не менее, выживание и дифференциацию нейронов при низкой плотности, как правило, требует, чтобы они помещают на глиальных фидерного слоя, совместно культивировали с глиальных клеток в отсутствии физического контакта с ними, или культивировали в среде обусловлено глии 1.

Создание нейронных культур с низкой плотностью на глиальных слоев фидерных может зависеть от быстрого и надежного генотипирования заранее - в течение нескольких часов, в отличие от нескольких дней. Скорость особенно важно, когда генотип нейронов должно быть согласовано с, что из глиальной фидерного слоя, полученного заранее. В более практическом примере, это может быть необходимо, чтобы определить, какие щенки которых генотип для использования в генерирующих культур, чтобы оптимизировать эффективность эксперимента.

Здесь мы показываем, рабочий протокол, который был использован для быстрого, упрощенного и надежного генотипирования мыши в предыдущих публикациях 2-6. Хвосты мышь икоммерчески доступного набора используются. Этот протокол включает в себя пошаговое извлечение нуклеиновых кислот из тканей, и не требует ни стадии очистки нуклеиновой кислоты, ни использование окончания буфера ('универсальное решение »). Надежность этого метода генотипирования иллюстрируется представляя результаты серии тестов, когда различия вводятся в отношении исходного количества образцов, возраст животных и длину ампликонов ПЦР. Этот набор предлагает преимущества автоматизированной добычи и надежности.

Ради того, чтобы быть всеобъемлющим, использование татуировки для долгосрочного идентификации генотипированных мышей также показали. Татуировки достигается путем применения татуировки чернила в дерму кожи (под эпидермисом) 7. Процедура описана для татуировки подушечки лап новорожденных или 1 день старых мышей, хотя татуировки могут быть применены к другим частям тела, таких как хвосты и ног, а также AnimALS всех возрастов. Кроме того, процедуры будут продемонстрированы на покрытие и культивирование нейронов мыши при низкой плотности на основе оптимизированной подготовки различных типов глиальных фидерных слоях 2,8.

Мы используем генетический модель мыши наследуемого неврологического расстройства DYT1 дистонии - аутосомно-доминантное заболевание, движение, вызванное мутацией в гене TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. Кодируемый белок, torsinA, принадлежит к «АТФаз, связанных с различными клеточными деятельности" (AAA +) семейства белков, члены которого в целом выполняет шаперон-как функции, помогая в: разворачивания белка, белка-комплекс разборки, торговля мембраны и слияния пузырьков 10-13. Мутация в в рамке удаления кодона для глутаминовой кислоты, что может привести к проявлению "раннего начала обобщенной изолированные дистония» 14,15. Тем не менее, путьophysiological механизмы, ответственные за этого расстройства остаются плохо понял. В детонации в мышиной модели, мутантный аллель является Tor1a tm2Wtd, указанными ниже, как Tor1a & Delta; E. Гетерозиготная & Delta; Е-torsinA плей-у мышей являются жизнеспособными и генетически мимические пациентов-людей с DYT1 дистонии, в то время как гомозиготные стучать в мыши погибают после рождения 16,17, с задержкой в послеродовой смерти, пострадавших от генетического фона 18. Ранняя смерть гомозиготной нокаут-мышей требует, чтобы оба генотипирование животных и создание нейронных культур быстро завершена. В качестве другого примера генотипирования Tfap2a (транскрипционный фактор AP-2α, активизируя усилитель связывания белка 2α) будет использоваться. Белок, кодируемый этим геном играет важную роль в регулировании многочисленных клеточных процессов, таких как пролиферации, дифференцировки, выживания и апоптоза 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных, проведенные в этом исследовании, были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных из Университета Айовы мимо.

1. Долгосрочный Идентификация мышей с использованием Татуировка подушечки лап

  1. Остановите лапу с подушечек лап (подошвенной поверхности) с видом на экспериментатора. Держите лапу с большим и указательным пальцем. Будьте осторожны, чтобы не прищемить лапу.
    Примечание: Стабильный иммобилизации важно, чтобы гарантировать, что татуировки пигмента помещают в дерму лапы площадки, и, таким образом, является постоянным 7.
  2. Тампон подушечек лап с 70% этанола на марлевую губкой или тампоном.
  3. Смажьте маслом кожи на ватным аппликатором и аккуратно нажмите наконечником против поверхности подушечек лап несколько раз. Используйте только небольшое количество масла на кожу; если они присутствуют в больших количествах, это предотвратит пигмент татуировки от достижения кожу.
  4. Опустите кончики иглы татуировки в татуировки чернила непосредственно переддля татуировки. Используйте чистую, асептики и острые татуировок иглы, чтобы уменьшить боль и возможность заражения, а также для повышения эффективности татуировки.
  5. В то время как поверхность подушечек лап покрыта маслом кожи, нажмите кончики татуировки иглы вертикально и слегка против кожи в центре подушечек лап, и придать чернилам несколько раз. См таблицу материалов / Оборудование для получения информации о электрической системы татуировки.
  6. Спрей 70% этанола на марлевую губкой, слегка прижать ее лапой, чтобы удалить лишний пигмент татуировки на поверхности кожи, и проверить качество татуировки. Убедитесь, что середина подушечек лап имеет темный, круглое пятно, которое отличается от обычного пигментации кожи. Если татуировка не темный или достаточно большой для удобного просмотра, повторите предыдущие шаги для татуировок.

2. генотипирование новорожденных мышей с помощью быстрого набора ПЦР Genotyping

  1. Лечить дистального конца хвоста мыши с 70% этанола, вырезать 5 мм или меньше хвостчаевые и передать его на трубе 8-трубки полосы типа, используемого для ПЦР. Используйте Во-лезвие для каждого щенка, чтобы избежать перекрестного загрязнения между образцами. В качестве альтернативы, использовать ножницы, но в этом случае, осторожно и тщательно удалить оставшуюся ткань на лопасти с использованием 70% этанола. Проверьте кровотечение. Если кровотечение происходит, оказать давление на отрезаемой части хвоста с марлевой губкой, пока кровотечение не остановилось.
  2. Добавить 200 мкл экстракционного раствора ДНК в каждой ПЦР пробирки, содержащей образец. См таблицу материалов / Оборудование по своему составу и информацию о наборе.
  3. Поместите полосу пробки в ПЦР термоциклер, и начать добычу ДНК с помощью следующей программы: 1 цикл при 55 ° С в течение 10 мин, 1 цикл при 95 ° С в течение 10 мин, а выдержка при температуре 4 ° С.
    Примечание: Это то же самое ПЦР термоциклер, который затем используется для ПЦР.
  4. После выделения ДНК закончена, снимите полосками из термоциклера ай инвертировать 5 раз.
  5. Передача 4 мкл раствора (экстракта ДНК) каждого образца неиспользованной трубки из полосы 8-трубки, и смешать с: 10 мкл 2X PCR Ready Mix II, 2 мкл смешанного вперед и обратного праймеров (рекомендуется 0,5 мкм, см таблицу материалов / Оборудование для последовательностей), и 4 мкл нуклеазы без H 2 O, для каждого образца. Спин кратко (например, 3 сек), используя настольный центрифуги. Держите труб на льду во все времена, за исключением во время эксплуатации.
  6. Выполните Амплифицируйте. Увидеть Таблица Материалы / Оборудование для термической программы.
  7. Обнаружение амплифицированных продуктов ДНК. Загрузите полную реакционного раствора из ПЦР (20 мкл) непосредственно в скважине агарозном геле. Загрузка маркеров молекулярной массы в отдельную лунку. Применить электрическое поле.
  8. Приобретать флуоресцентные изображения полос в ультрафиолетовом свете.

3. Первичная культура мозга мыши Нейронс на глиальные фидерного слоя

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры для вскрытия головного мозга и клеток диссоциации (3.1) являются общими для всех последующих процедур. Процедуры для мыши глиальных культур (3,2), крысы глиальные культуры (3,3) и мышь нейронов культуры (3,4) описаны отдельно после этого.

  1. Мозг Вскрытие и сотовых Dissocaiation
    1. Пожертвовать одним мыши или крысы щенка путем обезглавливания, быстро удалить мозг, и поместить его в раствор Хэнкса (см таблицу 1 для определения состава) + 20% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) в 35 мм блюдо (хранили на льду).
    2. Разрежьте мозг через срединной линии на два полушария. Удалить область интереса (например, кора головного мозга, полосатом теле и гиппокампе) от каждого полушария головного мозга. Удалить мозговых оболочек и крупных кровеносных сосудов с поверхности. Вырезать область мозга, в 4-10 тонкими ломтиками с помощью хирургического ножа.
    3. Промыть срезах мозга в 15 мл центрифужную пробирку, когда именно"Решение + 20% FBS, затем 3 раза с Хэнкса 'H Хэнкс решение (т.е. без сыворотки) (все при 4 ° С). Для полоскания, добавить 5-10 мл раствора, пусть мозг ломтики оседают на дне пробирки, аспирации раствора из верхней части, а также добавить свежий раствор. Закончить полоскания процедуру аспирации решение.
    4. Фильтр 2 мл трипсина раствора, содержащего пищеварения (см таблицу 1 для композиции) с помощью шприца 3 мл и шприцевой фильтр 0,2 мкм, и фильтрат добавляют непосредственно в пробирку, содержащую в срезах мозга. Пусть трипсинизации продолжаться в течение 13 мин при комнатной температуре.
    5. Нейтрализовать раствор трипсина, первый путем аспирации большинство из них, а затем добавлением 7-10 мл раствора Хэнкса + 20% FBS (4 ° С).
    6. Промыть срезах мозга, дважды раствором Хэнкса + 20% FBS, и затем три раза с раствором Хэнкса (т.е. без сыворотки) (все при 4 ° С). Закончить полоскания процедуру аспирации Solutиона.
    7. Фильтр 2 мл диссоциации раствора (см Таблицу 1 композиции) с помощью шприца 3 мл, шприц 0,2 мкм фильтр и добавить фильтрата непосредственно к трубе с кусочками мозга.
    8. Механически отделить клетки мягко растирая в 10-20 раз, до тех пор, видимые части ткани не исчезнут. Используйте ватными пробками, огневой полировкой пипетки Пастера и избежать пузырей во время растирания.
    9. Подождите 3 мин для маленьких кусочков, чтобы успокоиться.
    10. Передача большинство раствора (~ 1,5 мл, в результате чего какое-то решение внизу) в 15 мл центрифужную пробирку, которая содержит 3 мл раствора Хэнкса + 20% FBS, раствор (4 ° C), с помощью ватными пробками, пожаро- полированный пипетки Пастера. Не передавать весь раствор, так как включение любого осадка на дне, как правило, приводит к ухудшению культуры.
    11. Центрифуга 13 мин при ~ 185 г (~ 1100 оборотов в минуту) при 4 ° С.
    12. Аспирата супернатант осторожно,добавить 1 мл подогретого покрытие среды (37 ° С) к осадку и ресуспендируйте его, осторожно пипеткой несколько раз, используя ватными пробками, огневой полировкой пипетки Пастера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Три различных типов гальванических СМИ используются для различных целей культуры: покрытие средней-1 для мыши глиальных клеток, покрытие средней 2 для нейронов мыши и покрытие среднесрочные 3 для крыс нейронов и глиальных клеток (см Таблицу 1 композиций) ,
    13. Вынуть 10 мкл клеточной суспензии, смешать его с 10 мкл 0,4% трипанового синего раствора и измеряют плотность живых клеток с использованием либо гемоцитометра или автоматизированный счетчик клеток.
  2. Мышь Глиальные культуры
    1. Вымойте покровные, чтобы помочь установить здоровые культуры клеток мыши.
      1. Погрузитесь покровные стекла (круглые, диаметром 12 мм) в 70% -ной азотной кислоты в стеклянную чашку Петри. Защищать от света с помощью алюминиевой фольги, и положите его на орбитальном шейкере O / N.
      2. Промойте стекло coversliPS В чашке Петри, по крайней мере в три раза дистиллированной водой. Погружают их в дистиллированной воде. Поместите блюдо на орбитальном шейкере O / N.
      3. Высушите покровные на Ватман 150 мм фильтровальной бумаги в кабинете биологической безопасности.
      4. Автоклав покровные.
      5. Поместите покровные в культуральной чашке 24-а.
    2. Этикетка и генотипов новорожденных мышей в соответствии с шагами 1 и 2.
    3. Получите клетки мозга от щенков мыши, в соответствии со стадией 3.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование коры головного мозга характерно для подготовки мышь глиальных фидерного слоя. Тем не менее, другие области мозга, такие как гиппокамп и полосатое тело, будет работать после соответствующей регулировки плотности клеток из-за различных чисел и выходов клеток из различных регионов.
    4. Добавить ~ 4 мл предварительно нагретого покрытие средней 1 до конечной клеточной суспензии (~ 1 мл). Для предварительного подогрева питательной среды, поместите решение в культуральной инкубатора (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, кпозволяют значения температуры и рН стабилизируется.
    5. Передача клеточной суспензии без покрытия T25 культуры колбу, используя ватными пробками, огневой полировкой пипетки Пастера. Колбу помещают в культуральную инкубаторе.
    6. В один день в пробирке (DIV), промыть культивируемые клетки в колбы Т25 дважды покрытие среднего 1 (4 ° С). Поместить колбу обратно в инкубатор. Выполнение промывки путем аспирации среды внутри колбы полностью с помощью пастеровской пипетки, добавляя ~ 5 мл свежей среды и осторожно наклоняя колбу несколько раз в вихревое движение.
    7. В 6-9 DIV (т.е., за день до трипсинизации и покрытие на стеклах, на этапах 3.2.8-3.2.13), поместите 100 мкл материала покрытия с белками внеклеточного матрикса (табл материалов / оборудования для комментариев о Материал покрытия) на покровные стекла в культуральной чашке, и место культуры блюдо в культуре инкубатора.
    8. В 7-10 DIV, когда клетки 20-40% сливной (пространственно непрерывными), Trypsinize их.
      1. Промыть колбу один раз, путем аспирации все решение в колбу и добавления ~ 13 мл раствора Хэнкса (4 ° C), осторожно наклонить колбу несколько раз в вихревое движение, и аспирации решение полностью.
      2. Добавить 40 мкл раствора ДНКазы (конечная концентрация, 750 единиц / мл) с 4 мл раствора трипсина-ЭДТА, проходят раствора через шприцевой фильтр 0,2 мкм, и фильтрат добавляют непосредственно к клеткам в колбе.
      3. Пусть трипсинизации протекать в течение 13 мин при 37 ° С в инкубаторе.
      4. Нейтрализовать трипсина путем добавления раствора 2 мл 100% FBS (4 ° C) в колбу.
      5. Передача трипсином клетки в 15 мл центрифужную пробирку с использованием 5- до 10-мл пипетки, добавьте ~ 4 мл раствора Хэнкса + 20% FBS (4 ° С), центрифуге при ~ 185 г и 4 ° С в течение 13 мин и аспирации супернатант.
    9. Ресуспендируют осадок в 1 мл предварительно Wärmed покрытие среднего 1.
    10. Измерьте плотность клеток в соответствии со стадией 3.1.13.
    11. Аспирируйте материал покрытия полностью из стекла покровные, и пластины ~ 50 мкл ресуспендированных глиальных клеток на покровные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки установит глиальных фидерного слоя.
    12. Место культуры блюдо с покровные в инкубаторе.
    13. 20-60 мин позже, добавьте 1 мл подогретого покрытие среднего 1 в каждую лунку, и поместите блюдо обратно в инкубатор. Примечание: Во время покрытие среду добавляют, это будет полезно использовать другой пипетки, чтобы нажать на периферию покровного стекла (там, где нет никаких покрытием клетки), так что покровное не будет плавать в среде.
    14. В 1 DIV в глиальных фидерного слоя (то есть, на покровным стеклом), заменить жидкость с 1 мл предварительно нагретого покрытие среднего 1, путем аспирации всех раствора в скважине, а затем заполняя его свежей средой.
    15. В 2-3 DIV глиальных фидерного слоя при челLs 80-100% сплошности, добавить ингибитор митотической (10 мкл смеси 5-фтор-2'-дезоксиуридина + уридина; конечные концентрации 81,2 и 204,8 мкм соответственно) на каждую лунку, чтобы ингибировать репликацию ДНК и, следовательно, подавить пролиферацию глиальных клеток.
    16. В 7-9 DIV, когда клетки 90-100% сливной (1-2 ч до посева нейронов на глиальные фидерного слоя), заменить культуральной среды с предварительно нагревают покрытие средней 2 (37 ° С).
      ПРИМЕЧАНИЕ: нейроны будут высевали на тот же день, используя шаг 3,4.
  3. Крыса Глиальные культуры
    1. Шерсть культуры колбу Т25 с одной и той же материала покрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо для последующего удаления без прикрепленных клеток на стадии 3.3.5.
      1. Добавить 2,0 мл покрывающего материала в колбу и колбу помещают в культуральную инкубаторе.
      2. После 2-3 ч, аспирации материала покрытия полностью, таким образом, что пол становится сухой колбе.
    2. Получите клеткиот крысят, согласно шагу 3.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CA3-CA1 область гиппокампа используется для подготовки глиальных подачи крыса слой. Тем не менее, другие области мозга, такие как коры головного мозга и полосатое тело, будет работать после корректировки на различия в плотности клеток из-за различных чисел и выходов клеток из различных регионов.
    3. Добавить ~ 4 мл подогретого покрытие среднего 3 до конечной суспензии клеток (~ 1 мл).
    4. Передача клеточной суспензии в покрытой культуральной колбы Т25, используя закрытые ватными пробками, огневой полировкой пипетки Пастера. Поместить колбу в культуральной инкубатор (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C).
    5. В 2-3 DIV, когда клетки на 20-40% сплошности, удалить не соблюдают или слабо прилипшие клетки, закрыв крышку плотно, встряхивая колбу энергично ~ 10 раз, аспирации раствора и добавление 4-5 мл обшивки средне-3 (при 4 ° С). Повторите эту процедуру один раз. Проверьте культивируемых клеток по всей колбы этаже (например,с помощью фазового контрастного микроскопа), чтобы подтвердить, что те, которые появляются нейронов (т.е. те, для которых внешний обод тела клетки появляется фаза-яркий) полностью удаляются. Повторите процедуру так часто, как необходимо удалить эти клетки, а затем вернуться колбу в инкубатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: сила и общее число «трясет», необходимых могут отличаться среди отдельных экспериментаторов. Важно то, чтобы не держать общее количество коктейлей, чтобы заданное количество, но, чтобы подтвердить, что нейронные клетки, как будут устранены.
    6. В 6-8 DIV, когда клетки 90-100% сливающиеся, прохождение глиальных клеток от trypsinizing их, как в шаге 3.2.8.
    7. После центрифугирования, ресуспендируют осадок в 1 мл посева средний-3 (4 ° C), добавляют 10 мл металлизированный средний-3 (4 ° С), передать трипсином клетки к не-покрытием T75 колбу, и культура их в инкубатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крыса глиальные клетки пассировать дважды; В отличие от мыши глиальные клетки аре пассировать только один раз, потому что они становятся нездоровыми после нескольких пассажей. Крыса глиальные клетки будут пассируют в колбах Т75, которые не покрыты любым материалом покрытия. Покрытие обеспечивает крысы глиальные клетки расти слишком быстро, и выход многих ресничных клеток (предполагаемые эпендимные клетки), которые разрушают нейронов условиях культивирования позже.
    8. В 17-19 DIV глиальных культуры в колбе (т.е. через 11 дней после пересева и один день до обработки трипсином и покрытие на покровные с шагом 3.3.9-3.3.14), поместить 100 мкл покрывающего материала на неумытых покровные стекла ( круглый, диаметр 12 мм) в культуральной чашке, и место культуры блюдо в культуре инкубатора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для глиальных культур крысы, разница не была замечена в результатах культуры с или без промывки покровные.
    9. В 18-20 DIV глиальных культуры в колбе (т.е. через 12 дней после пересева), подготовить глиальных фидерного слоя по trypsinizing культивируемых клеток, в соответствии с стEP 3.2.8.
    10. Во центрифугированием, аспирации материала покрытия полностью из покровные стекла.
    11. После центрифугирования, ресуспендируют осадок в 1 мл посева средний-3 (4 ° C), и измерить плотность клеток, в соответствии со стадией 3.1.13.
    12. Регулировка глиальных плотность 10 4 живых клеток / мл, и пластины 100 мкл суспензии клеток глии на покровные стекла с покрытием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки установит глиальных фидерного слоя.
    13. Место культуры блюдо с покровные в инкубаторе в течение 20-60 мин.
    14. Добавить 1 мл посева на среднесрочную 3 (4 ° С) в каждую лунку, и поместите блюдо обратно в инкубатор.
    15. В 3-4 DIV глиальных фидерного слоя, когда клетки на покровное 40-80% сливной, добавить 1 мл подогретого ростовой среде (см Таблицу 1 состава), который содержит цитозин β-D-арабинофуранозида ( AraC, конечная концентрация 4 мкМ), чтобы остановить распространение глиальных клеток. Plate нейронс при 7-9 DIV глиальных фидерного слоя, когда клетки 60-80% сливной, используя шаг 3,4.
  4. Мышь нейронные культуры
    1. Этикетка и генотипов новорожденных мышей в соответствии с шагами 1 и 2.
    2. Используйте щенков мыши для шага 3.1.
    3. Отрегулируйте плотность живых клеток суспензии ~ 2,0 х 10 5 клеток / мл, с помощью подогретого покрытие среднего-2 для высева на мышь глиальных клеток, или с использованием покрытие среднего 3 для высева на крыс глиальных клеток.
    4. Пластина клеток на глиальных фидерного слоя, осторожно добавив клеточной суспензии в культуральной среде в каждой лунке. Примечание: объем клеточной суспензии, чтобы быть добавленной будет определяться целевой количества клеток в культуре хорошо. Например, пластины ~ 60 мкл клеточной суспензии, чтобы достичь 12000 клеток / лунку.
    5. Обратите внимание, что никаких изменений решение не требуется после того, как нейроны покрытием. Быть осторожным, чтобы избежать испарения раствора из лунок в течение культуры, путем увлажнения внутреннего диаметраF культуры инкубатора.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В качестве примера применения этого протокола, показательные результаты показаны для маркировки мышей татуировки, надежной генотипирования в различных экспериментальных условиях, а также создание первичных нейронов культур на глиальных слоев фидерных.

Татуировка

Новорожденные щенки были помечены на подушечках лап с использованием системы нанесения татуировки ('новорожденного "на рисунке 1). Этикетки оставались хорошо видны на 3 недели ("3-недельного возраста») и 32-недельного возраста ('32 -недельный-старый '). Индивидуальный мыши могут быть однозначно определены путем комбинации татуировки на четырех лапах (номера 1-16) и к информации о животных клетке, или более сложных схем нумерации (не показан).

Генотипирование

Один представитель пример генотипирования показано (рис 2). Ген Tor1a дикого типа (Tor1a (Tor1a + / Е) и гомозиготных (Tor1a & Delta; Е / Е) & Delta; Е-torsinA нокаут у мышей амплифицировали из геномной ДНК, выделенной из хвостовой клипов новорожденных детенышей. Генотипирование в этом конкретном примере на основе присутствии одного 34-базовой пары LoxP сайта в мутантной аллели Tor1a после успешного Cre рекомбинации и делеции устойчивости к неомицину кассеты 16,18.

Геномную ДНК экстрагировали с минимальными практического времени, и многие образцы были обработаны одновременно. Объемы добычи оставались постоянными, и поэтому никакой корректировки объема не было необходимости приспосабливаться к изменениям в условиях испытания. Надежность генотипирования был протестирован в соответствии с четырех условий, как подробно описано ниже.

Во-первых, эффект от различий в размере исходной ткани исследовали (рисунок 3). Хвосты разной длины былиполучены из гетерозиготных & Delta; E-torsinA плей-у мышей (Tor1a + / Е) при отъеме в возрасте (~ 3 недели). Длина хвоста от 2 до 5 мм, диапазон, как правило, рекомендуется в протоколах генотипирования, дал тот же результат генотипирования высокого качества. Два полосы соответствуют дикого типа и мутантных аллелей (Tor1a + и Tor1a & Delta; E, соответственно).

Во-вторых, последствия изменчивости возраста животных были рассмотрены (рисунок 4). Хвосты были получены из новорожденных, 3-недельного возраста и ~ 24-недельного возраста гетерозиготных & Delta; Е-torsinA нокаут у мышей (Tor1a + / Е). Гомозиготы не используется, потому что они умирают через несколько дней после рождения 16-18. Двух ожидаемых полосы для дикого типа и мутантные гены Tor1a были видны, независимо от возраста животных (рис 4А). Общая применимость этого результата была протестирована с помощью второй ген, Tfap2a 19 в диком-тYpe мышей (Tfap2a + / +) (рис 4б).

В-третьих, эффекты различий в длине ампликонов ПЦР были испытаны (рисунок 5). Для этой цели различные пары праймеров, были синтезированы для данного гена, таким образом, что амплифицированные ДНК имеют разную длину пар оснований. Ген Tfap2a последовательно обнаружены с различными длинами Amplicon.

В-четвертых, два метода выделения ДНК сравнивают (Рисунок 6). В одном способе, были использованы PCR полосы трубы и термоциклер ПЦР (описано в стадии 2). Это автоматизированная, параллельно несколькими трубками метод извлечения ('Auto' на рис 6). Поскольку множество труб может быть одновременно обработаны в формате полосы, и машина используется ПЦР с программой, чтобы работать в четырех шагов температуры, нет необходимости передавать трубы, вручную изменить температуру при экстракции, или использовать несколько кусковоборудования. Таким образом, можно легко обрабатывать множество образцов. Это было по сравнению со вторым методом, основанным на ручном, экстракции ("Manual" на фиг.6) одной трубки. Это использует индивидуальные ПЦР пробирок и отдельные машины не-ПЦР (тепловые блоки и водяные бани), чтобы контролировать температуру во время извлечения ДНК. В этом случае, несколько, одиночные трубы были перемещены в новой температуре после каждого этапа, требуя несколько аппаратов регуляторы температуры. В обоих случаях, ген Tor1a анализировали дикого типа, гетерозиготных и гомозиготных & Delta; Е-torsinA нокаут-мышей (фиг.6А), и ген Tfap2a анализировали у мышей дикого типа (фиг.6В). Два протокола экстракции дали эквивалентные результаты генотипирования.

Таким образом, результаты, представленные на фиг 3 до 6 демонстрируют, что метод генотипирования является надежной, достижение надежные и воспроизводимые результаты, несмотря на ваriations в количестве тканей, животном возраста, длины ампликона, и протокола, используемого для экстракции.

Нейронов культур

Для культивирования нейронов мыши на фидерного слоя мыши глиальных, порядок процедур: (татуаж новорожденных мышей → генотипирование для глиальных культуры →) глиальных культуры → татуировка новорожденных мышей → генотипирование для нейронов культуры → нейронов культуры. Для культур, созданных на фидерного слоя крысы глиальных процедуры, изложенные в скобках пропускаются.

Мы рассмотрели поддерживающий эффект от предварительно семенами глиальных фидерного слоя на выживание нейронов и роста. Нейроны были получены из СА3-СА1 области гиппокампа, в моторной области коры головного мозга, полосатого тела и новорожденных мышей дикого типа. Они высевали при низкой плотности на крысу глиальных фидерного слоя, которые были получены от СА3-СА1 области гиппокампа и высевали до нейронов обшивки, в соответствии сСхема показана на рисунке 7 (упрощенное краткое изложение процедуры). Культуры низкой плотности являются оптимальными для визуализации отдельных дендритов, somata 4,6, нервных окончаний 2,3,5,8 и аксонов валы 5 с высоким пространственным разрешением. В клетки гиппокампа (содержащий как нейроны и глиальные клетки) высевали на покровные стекла с покрытием, либо с (фиг.8А), либо без предварительно установленной глиальных фидерного слоя (8В, С) и наблюдали фазового контраста оптики. В присутствии почти сливной глиальных фидерного слоя, нейроны (в каждой панели, наконечник стрелы показывает один представительный нейрон) были относительно диспергируют 3 и 7 дней после посева (дни в пробирке, DIV) (фиг.8А). Они также показали признаки хорошего здоровья, такие как явным отрывом нейронов somata, расширенных дендритов, отсутствие кластерного somata, и отсутствие в комплекте невриты (с высоким увеличением мнимойES во вкладках). В 14 DIV, эти нейроны образует плотную сеть характеризуется длительным невриты (дендритов и аксонов). Следует отметить, что глиальные пролиферации ингибируется до нейроны высевали при добавлении питательную среду, содержащую ингибитор митотической ARAC (этап 3.3.15).

В отличие от этого, в отсутствие глиальных фидерного слоя в момент посева гиппокампа нейронов, рост культивируемых нейронах гиппокампа была нарушена, даже в отсутствие AraC. В 3 DIV, глиальные клетки (входит в недавно посеянных клеток гиппокампа) не формируется сливающийся лист (звездочка в верхней панели рис 8B). Культуры показал некоторые признаки, которые не подходят для изучения формирования изображений с высоким разрешением, например, широких областях без основополагающих глиальные клетки (звездочка), наличие кластерного somata и наличие в комплекте нейритах в некоторых областях (данные не показаны). К 7 DIV, глиальные клетки сформировали сливающийся лист (средняя панель 8с). Howevэ-э, нейроны в меньшем количестве, чем когда нейроны помещали на предварительно установлено глиальных фидерного слоя. Выжившие нейроны также не было долго, образующего сеть невриты (вставка). В глиальные клетки были более неоднородны по кривизны и толщины, чем те, в культуре фидерного слоя, таким образом, появляется фаза-яркий. Для того чтобы проверить эффекты подавления пролиферации глиальных на нейронах, мы применили AraC, содержащих питательную среду. Когда AraC был добавлен на 3 или 7 DIV и клетки не культивировали до 14 DIV и наблюдали в этот день (8В и С, нижние панели), глиальные клетки покрывал большую часть поверхности покровного. Тем не менее, нейроны были еще мало, особенно когда AraC наносили на 7 DIV. Выжившие нейроны были только короткие процессы и не были широко связаны. Таким образом, позднее добавление AraC позволил равномерное глиальных слой форме, но не способствует нейронов жизнеспособность или нейритов; а неконтролируемого глиальных ростабыло пагубное воздействие на нейроны.

Эти данные показывают, что глиальные фидерного слоя является критическим для выживания и роста нейронов высевали при низкой плотности, и что глиальных слой должен присутствовать во время посева нейронов, а не позже в течение нейронов культуры. Аналогичные результаты были получены с использованием культур коры головного мозга (рис 9) и стриарные нейронов (Рисунок 10).

Качественное наблюдение о жизнеспособности нейронов была подтверждена количественного анализа. В частности, число выживших нейронов в 14 DIV подсчитывали на основе фазового контраста изображения культур (рисунок 11). Число было наибольшим для нейронов, культивируемых на глиальных фидерного слоя (т.е.. Наноситься на глиальных фидерного слоя). Количество было меньше в случае нейронов культивировали в отсутствие глиальных фидерного слоя. Число сократилось еще больше, когда клетки обрабатывали с AraC наболее позднее время. Эти различия были статистически значимыми, и были отмечены в культурах нейронов, полученных из всех трех областей мозга.

Типы выживших клеток были выявлены в 14 DIV в мыши гиппокампа культуры покрытием на гиппокампа подачи крыса слоя. Дважды иммуноцитохимия проводили с использованием антител против маркера нейронов, ассоциированный с микротрубочками белок 2 (map2), и астроцитов глиальных клеток маркера, глиальных фибриллярного кислого белка (GFAP). Клетки с продолжительностью процесса были положительными на MAP2, в то время как клетки в основной глиальной фидерного слоя были положительными на GFAP (два представительных полей изображений, 12А). Это окрашивание не артефакт конкретного сочетания первичных и вторичных антител, потому что такая же картина была получена при другой набор вторичных антител был использован (рис 12В).

В отличие от этого, когда тот же окрашивание PERFOrmed на культуре, состоящих только из глиальных фидерного слоя, то есть в отсутствие добавленных клеток мыши (два представительства полей изображения, 13А), клетки не были положительными для MAP2. Клетки фидерного слоя были последовательно положительным для GFAP. Для отрицательного контроля, как первичные антитела были исключены из процедуры иммуногистохимического (фиг.13В). Нет окрашивание не было обнаружено в этих образцах, хотя клетки присутствуют, как видно из проходящего света оптикой (дифференциального интерференционного контрастного, DIC) и ядерного окрашивания красителем Hoechst. Таким образом, неспецифическое окрашивание в map2 и GFAP каналов была очень слаба.

Эти иммуноцитохимические данные были проанализированы в количественном (рисунок 14). В каждом 8-битного изображения, интенсивность измеряется и отображается вдоль линии. Наложенные участки выявить окрашивание map2, когда клетки мыши (образцы, содержащие нейроны) культивировали на глиальных фидерного слоя (Neuron +глии +, первичное антитело (Ab 1 °) +), в то время как, например окрашивание отсутствовало в культурах только глиальных клеток-фидеров (Neuron -, глии + 1 ° АВ +). В качестве отрицательного контроля без первичных антител, окрашивание было незначительным в культурах только глиальных клеток-фидеров (Neuron -, глии + 1 ° Ab -). Окрашивание GFAP было очевидно в глиальных фидерного слоя, независимо от того, были ли высевали клетки мыши (Neuron + + глии, 1 ° АВ +) или нет (Нейрон -, глии + 1 ° АВ +). Опять же, окрашивание в отрицательном контроле было незначительным (Нейрон -, глии + 1 ° Ab -). Эти результаты показывают, что крысы глиальных слой фидера состоит в основном из астроцитов, и что нейроны присутствовали только тогда, когда были добавлены клетки мыши. Они также показывают, что нейроны, присутствующие в этих культурах возник исключительно из мыши.

Результаты Раздел онлайн-видео также показывает изображения DIC и map2 культивируемых нейронов высевали на глиальных фидерного слоя, Бого получают из гиппокампа области СА3-СА1 мышей дикого типа.

Для детального контроля клеточной культуре, рекомендуется, чтобы измерить плотность живых клеток, и для оценки общего качества вскрытия мозга и клеточных стадий диссоциации, так и для посева клеток на заранее определенной плотности. Ниже перечислены четыре комплекта Типичные измерения плотности. Однако следует отметить, что эти цифры могут варьировать в зависимости от условий культивирования и реагентов. Например, даже различные партии сыворотки от того же производителя может повлиять на результаты. Таким образом, эти цифры следует рассматривать общий показатель, а не абсолютный ориентир.

Для клеточного распада (шаг 3.1.13), типичные значения для плотности живых клеток, полученных из одного щенка являются: ~ 2 х 10 5 клеток / мл (мышь моторной коры и мышь CA3-CA1 гиппокампа), ~ 5 х 10 5 клеток / мл (мышь коры головного мозга и крысы CA3-CA1 гиппокампа) и ~ 1 х 10 6 CELLS / мл (мышь стриатуме). Во всех этих случаях фракции живых клеток было> 90% (жизнеспособность, определяется как отношение числа живых клеток в том, что из общего количества клеток). Моторная кора свободно определяется как область коры головного мозга, которая лежит непосредственно от спины к стриатуме 20. Для гиппокампа культур, являются предпочтительными собственно участками СА3 и СА1 области гиппокампа. Вся гиппокамп дополнительно включает в себя зубчатой ​​извилине, включение которых приводит к образованию больших нервных окончаний гранулярных клеток и вводит неоднородность в синаптических свойств 21. Полосатой культура включает в себя хвостатое-скорлупе и бледного шара, но не включает прилежащем ядре, или медиальной или боковой перегородки ядер в близлежащих структурах.

Для мыши глиальных культуры (шаг 3.2.11), покрытие плотность ~ 10000 глиальные клетки на каждой 12-мм выстрел покровное, используя ~ 50 мкл клеточной суспензии, при плотности ~ 2 х10 5 клеток / мл. Обычно плотность измеряли в супернатанте относительно постоянна и не требует регулировки. Чтобы преобразовать плотность более различных областях, полезная информация о том, что покровное имеет диаметр 1,20 см и площадь 1,13 см2. Таким образом, ~ 10000 клеток / покровное = ~ 8800 клеток / см 2 на покровное.

Для крыс глиальных культуры (шаг 3.3.12), покрытие плотность ~ 1000 глиальные клетки на каждой 12-мм выстрел покровное, используя ~ 100 мкл клеточной суспензии с плотностью ~ 1х10 4 клеток / мл. Таким образом, 1000 клеток / покровное = ~ 900 клеток / см 2 на покровное.

Для низкой плотности мыши нейронов культуры (этап 3.4.4), плотность покрытия составляет от 2000 до 48000 клеток на лунку 24-луночного планшета. Типичные значения при Покрытие нейронов на крыс глиальных клеток: 10,000-24,000 клеток / лунку для коры головного мозга нейронов, 12,000-24,000 клеток / лунку для CA3-СА1 гиппокампа нейронов и 24,000-48,000 клеток / лунку для полосатого нейронов. Когда покрытие на мыши глиальных клеток, число уменьшается, например, 2000 клеток / лунку для CA3-CA1 нейронов гиппокампа. Как примечание стороны, для обшивки крыса Ca3-CA1 гиппокампа нейронов на фидерного слоя крысы глиальных, покрытие плотность 1,000-6,000 клеток / лунку. Для преобразования плотности в хорошо плотности на покровное, полезная информация в том, что внутренний диаметр скважины на дне 1,56 см, а его площадь составляет 1,91 см 2. Так, например, 12000 клеток / лунка = 7100 клеток / покровное = 6300 клеток / см 2 на покровное. Эти плотности были выбраны с целью культивирования относительно редкие нейронов для клеточной визуализации с высоким разрешением. Исследователи должны выбрать свои номера, которые лучше всего отвечают их экспериментальные цели.

Рисунок 1
Рисунок 1. татуированные подушечки лап мышей. Newborn мышей были помечены татуировкой подушечки лап. Они были сфотографированы сразу после татуировки (новорожденных), в 3-недельного возраста (3-недельных) и в 32-недельном возрасте (32-недельного возраста). Этикетки остались хорошо видны в течение взрослой жизни. Изображения были взяты из различных животных. Они не показаны в том же масштабе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2. генотипирование дикого типа (Tor1a + / +), гетерозиготных (Tor1a + / Е) и гомозиготных (Tor1a & Delta; Е / Е) & Delta; Е-torsinA нокаут у мышей. Генные аллели Tor1a были проанализированы в дикого типа и мутанта формы, с использованием ДНК, выделенную из хвостов новорожденных детенышей. TСоветы Айыл были ~ 4 мм в длину. ДНК окрашивали с использованием SYBR Safe ДНК гель пятно. См Таблицу материалы / Оборудование для информации о праймеров и программы термоциклирования для гена Tor1a. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Были использованы Рисунок 3. Обнаружение геномной ДНК в контексте изменения количества исходного материала. Задние концы разной длины. Подопытных животных были 3-недельных, гетерозиготных & Delta; Е-torsinA плей-у мышей (Tor1a + / Е). Дорожки представляют собой длины хвоста 2, 3, 4 и 5 мм, в двух экземплярах (слева направо). Кончики хвост были получены из различных мышей. Размер маркеры молекулярной массы в крайней левой полосе представляют длины ДНК в SТЭЦ на 100 пар оснований. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Обнаружение геномной ДНК в контексте изменения животного возраста. Гена (А) Tor1a. Дорожки представляют хвост советы, полученные от гетерозиготных & Delta; Е-torsinA нокаут-мышей (Tor1a + / Е) на следующих этапах: новорожденных, 3-недельных и ~ 24-недельных (в двух экземплярах слева) (B). Tfap2a ген. Дорожки представляют хвост советы, полученные от дикого типа (Tfap2a + / +) мышей на следующих этапах: новорожденный, 3-недельных и ~ 24-недельных (в двух экземплярах слева). Оба гена были амплифицированы из хвостов ~ 4 мм в длину. Ожидаемый ПЦР-фрагмент 498 п.н.. Программа ва ПЦР š же, что и для гена Tor1a. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Определение геномной ДНК в контексте изменения длины ампликона ПЦР. Ген Tfap2a анализировали с помощью ПЦР длины ампликона 498 п.н. (слева линий), 983 б.п. (средний полос) и 1990 б.п. (правых полосах) в дубликаты. Ген амплифицировали из хвостов 3-недельных мышей. Размер маркеры молекулярной массы в крайнем левом и правых полос на геле представляют длины ДНК с шагом 100 и 200 пар оснований, соответственно. См Таблицу материалы / Оборудование для получения информации о праймеров для различных ампликонов. 879fig5highres.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6
Рисунок 6. Обнаружение геномной ДНК в контексте изменения способа экстракции ДНК. Результаты для руководства, добыча однотрубные (Manual) и автоматизированных, параллельные методы извлечения нескольких ламп (Авто) сравниваются. Последний метод был использован в данном отчете. Гены были усилены из хвостов ~ 4 мм в длину, собранные от новорожденных. () Гена Tor1a у новорожденных щенков & Delta; E-torsinA плей-у мышей. Дорожки представляют ДНК, извлеченные из образцов дикого типа (ручной и автоматической), гетерозиготных (ручной и автоматической), и гомозиготной мышей (ручной и автоматической) (слева направо). (B) гена Tfap2a в 3-недельных мышей дикого типа. Ожидаемый ПЦР-фрагмент 498 п.н..jove.com/files/ftp_upload/51879/51879fig6highres.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7
Рисунок 7. Упрощенная, схематическое изображение процедур для посева нейронов мыши на мыши (А) и крысы (B) глиальные слоев подачи. Количество дней (дней в пробирке) относятся к кумулятивным дней после глиальные клетки сначала высевали в культуры колбы. Они служат только в качестве грубой оценки. Для практичных деталей, см процедур раздел. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 8
Рисунок 8. поддерживающий эффектглиальных фидерного слоя на рост нейронов гиппокампа в низкой плотности культуры. Нейроны были получены из СА3-СА1 гиппокампа новорожденных мышей дикого типа. (А) мышей гиппокампа клетки высевали на покровные стекла с покрытием, которое был предварительно высевали слоем подачи крысы глиальных полученной из СА3-СА1 гиппокампа. Нейроны были рассеяны равномерно в здоровом образе. Культуры, которые наблюдались на 3, 7 и 14 DIV. (B, C) ​​мыши гиппокампа клетки высевают на стекла с покрытием покровные, которые не имели заранее установленной слой подачи. Культуры, которые наблюдались на 3 DIV (верхняя панель в B) и 7 DIV (средняя панель в C) без лечения AraC. В других наборов культур, клетки обрабатывают в AraC 3 DIV (нижняя панель в В) и 7 (DIV в нижней панели С), и наблюдается при 14 DIV. Все изображения представляют родственные культуры, полученные из одной и той же щенка, чьи нейроны помещали в тот же день. Подробности в тексте. Для каждой панели, эксдостаточно нейрона обозначается белой стрелкой и увеличивается в вставке. Нейроны имеют клеточные тела которых по периметру появляется яркий при просмотре фазоконтрастных оптики, и они также имеют толстые процессов. Звездочки указывают областях без глиальных клеток. Культуры были обследованы в прямом эфире на инвертированный микроскоп с помощью фазового контраста оптики с 20-кратным объективом (числовая апертура 0,45) без промежуточной линзы (т.е. при 1x). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 9
Рисунок 9. Поддерживающий эффект глиальных фидерного слоя на рост коры головного мозга нейронов в низкой плотности культуры. Аналогичные результаты, как на рисунке 8, но с нейронами, полученными из двигательной области сerebral коры. Условия, при меток AC соответствуют тем, на рисунке 8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 10
10. Поддерживающая эффект глиальных фидерного слоя на рост полосатого тела нейронов в низкой плотности культуры. Аналогичные результаты, как на фиг.8 и 9, но с нейронов, полученных из полосатого тела. Условия, при меток AC соответствуют тем, на рисунке 8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

11. Поддерживающая эффект глиальных фидерного слоя на выживание нейронов. Число выживших нейронов подсчитывали в экспериментах, показанных на фиг.8, с использованием изображений, полученных с помощью фазово-контрастной микроскопии. Изображения для 14 DIV показаны здесь снова, но с наконечниками указывая на примеры, считая нейронов. Гистограмма показывает количество нейронов в области изображения (449,0 мкм х 335,5 мкм) (среднее ± стандартная ошибка среднего, N = 7-24 полей для каждого состояния культуры). Звездочки указывают статистически значимых различий 'глиальных фидерного слоя (-), AraC 3 DIV "и" глиальных фидерного слоя (-), AraC 7 DIV' с 'глиальных фидерного слоя (+) "(* р <0,05, ** р <0,01, непарный Студенческая т -test). Цифры над столбиками указывают на нейронную плотность, измеренную в монтажи нескольких полей изображения. Изображения былиполучены с помощью 20X объектив. Чтобы избежать смещения сбора, все изображения были получены вдоль полной вертикальной полосы, из верхней части к нижней части покровного и проходящей через приблизительно в центре покровного стекла. Отдельные изображения были некоторые перекрытий (например, 1/6 до 1/4 поля изображения в верхней и нижней). Два метода были использованы для анализа. В одном нейроны были подсчитаны в чередующихся изображений, чтобы обеспечить, что отдельные нейроны не были подсчитаны более чем один раз. Полученные цифры были использованы, чтобы генерировать гистограмму. Во втором способе, один монтаж был создан из отдельных изображений. Они были сшиты с помощью образа Microsoft Composite Editor или вручную с помощью Photoshop. В монтажи также исключены нескольким пунктам одних и тех же нейронов. Полученные цифры приведены выше баров. В обоих методах, широкие области на покровное периферии, что не содержат каких-либо клеток были исключены. Клетки подсчитывали нейронами, если они имели клеточных тел, которые появились яркиефазово-контрастной микроскопии, а также расширенных клеточных процессов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 12
Рисунок 12. Иммуноцитохимическая идентификация типов клеток в нейронных культур. Условия культивирования соответствует левом нижнем изображении фиг.8А. Нейроны были получены из СА3-СА1 гиппокампа у мышей дикого типа, и высевали на глиальных слой фидера, генерируемого из СА3-СА1 области гиппокампа крыс дикого типа. Культивируемые клетки были проанализированы с помощью иммуногистохимии для нейронального маркера MAP2, и астроцитов глиальных клеток маркера GFAP. Дифференциальный интерференционный контраст (DIC) микроскопии выявить общую морфологию отображаемого поля, 14-17дней после нейронов высевали на глиальных фидерного слоя. окрашивание (а) три цвета, в том числе counterstaining с ядерным маркером Hoechst 33342 краситель. Два представительства поля изображения показаны. Окрашивание (B) Двухцветный, с различными комбинациями вторичных антител, конъюгированных с различными флуорофоров. В этих экспериментах, культивируемые клетки фиксировали 4% параформальдегидом и 4% сахарозы в растворе Тирода (содержащий, в мм: 125 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 30 D-глюкозы, 25 HEPES, рН 7,4 регулируется с 5 M NaOH, ~ 310 мОсм без регулировки) в течение 30 мин при 4 ° С. После промывания раствором Тирода, они были проницаемыми с 0,1% тритона Х-100 в растворе Тирода в течение 10 мин. Они были снова промывают раствором Тирода а затем блокируют 2% нормальной козьей сывороткой в ​​фосфатно-солевом буфере (PBS) (блокирующий раствор) в течение 60 мин при комнатной температуре. После этого их обрабатывали кролика полианти-клонального антитела МАР2 (AB5622; 400x разбавления в блокирующем растворе), и мышиных моноклональных анти-GFAP коктейль (NE1015; 1,000x разведение) O / N (15-21 ч) при 4 ° С. После промывки раствором PBS, клетки инкубировали с козьим анти-кролик и анти-мышь IgG антитела, конъюгированного с Alexa Fluor 405 (500x разбавления в блокирующем растворе), Alexa Fluor 488 (1,000x) или Alexa Fluor 568 красителя (500x) в течение 60 мин при комнатной температуре. Они промывали PBS и наблюдать непосредственно в PBS. В некоторых культурах, после последней промывки в вышеуказанных процедур, клетки обрабатывали Hoechst 33342 в 0,5 мкг / мл в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре и промывают PBS до наблюдения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенное фигура.

Рисунок 13
Рисунок 13. IMMUnocytochemical определение типов клеток, в глиальных культур фидерного слоя. Сестринские культур крысы глиальных слоев фидерных как показано на рисунке 12, но без покрытия нейронов мыши. (А) Окрашивание с использованием процедур, описанных Иммуноцитохимическая на рисунке 12А. Два представительных полей изображений показаны. (В) Окрашивание в глиальных слой фидера с использованием иммуноцитохимических процедур, описанных в A, но с первичными антителами опущено. Все изображения map2 на рисунках 12А и 13А, В были приобретены в рамках одних и тех же условий формирования и показаны в то же контрастность изображения для возможности сравнения интенсивности. Те же процедуры были использованы для изображений GFAP в рисунках 12А и 13А, В. Глиальных культура подачи слой отображается на тот же день, что и культур на рисунке 12. Таким образом, глиальные слои фидерные в 13, культивировали в пробирке за тот же промежуток времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 14
Рисунок 14. Интенсивность иммуноцитохимического окрашивания. Линии были нарисованы на изображениях, показанных на фиг 12 и 13, и интенсивности вдоль них был построена. На врезках изображений в верхней строке рис 12A. Три условия были: 1) покрытие из мышиных клеток (нейронов), содержащие на крысу фидерного слоя и окрашивания с первичными антителами (Neuron + + глии, 1 ° АВ +), 2) глиальных фидерного слоя только (не нейронов покрытия) и окрашивание с первичными антителами (Neuron -, глии + 1 ° Ab +), и 3) глиальных кормаэ не слой только (не нейронов покрытия) и окрашивание без использования первичных антител (нейроны -, глии +, 1 ° Ab -). Нейронов окрашивание (МАР2) присутствовал только тогда, когда клетки мыши высевали (1 условия против 2), и глиальных окрашивание (GFAP) присутствует в обоих наборах культур (1 условиях против 2). Иммуноцитохимическое окрашивание специфическими для обоих первичных антител (условия 1 против 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

РЕШЕНИЯ
TAE буфер (50x раствор)
Трис-основание, 486 г
Ледяную уксусную кислоту, 114,2 мл
0,5 М ЭДТА, рН 8,0, 200 мл
Добавить дистиллированную воду, чтобы принести общий объем до 2 л
Макияж в химическом вытяжном шкафу.
Развести в 50 раз перед использованием.
Решение Хэнкса
Сбалансированные Соли Хэнкса, без хлорида кальция, сульфат магния и бикарбонат натрия (1 л)
Раствором NaHCO 3, 350 мг (конечная концентрация 4,17 мМ)
HEPES, 2,38 г (конечная концентрация 10 мМ)
Доведения рН до 7,4 с помощью 5 М NaOH.
Отрегулируйте осмолярности до 310 мОсм использованием сахарозы (Осмолярность, как правило, ~ 290 мОсм без каких-либо корректировок).
Добавить дистиллированную воду, чтобы принести общий объем до 1 л
Переваривание раствор (для обработки трипсином мозговой ткани)
NaCl, 800,6 мг (конечная концентрация 137 мМ)
KCl, 37,3 мг (FИнал концентрация, 5 мМ)
Na 2 HPO 4 · (7H 2 O), 187,6 мг (конечная концентрация 7 мм)
HEPES, 595,8 мг (конечная концентрация 25 мМ)
Глюкоза, 97,3 мг (конечная концентрация 5,4 мМ)
Доведения рН до 7,2 с помощью 5 М NaOH.
Осмолярность, как правило, ~ 310 мОсм без каких-либо корректировок.
Добавить дистиллированную воду, чтобы довести общий объем до 100 мл.
Непосредственно перед использованием, добавить 20 мг трипсина (конечная концентрация 10 мг / мл) и 20 мкл ДНКазы (конечная концентрация 750 единиц / мл) в 2 мл раствора варки.
Диссоциации раствора (для механической диссоциации ткани головного мозга)
Решение Хэнкса
MgSO 4 · (7H 2 O), 295,1 мг (конечная Концентрацна 11,97 мМ)
Отрегулируйте осмолярности до 310 мОсм использованием сахарозы.
Общий объем составляет 100 мл.
Непосредственно перед использованием, добавить 20 мкл ДНКазы (конечной концентрации 750 единиц / мл), 2 мл раствора диссоциации.
Покрытие среднего-1 (для мыши глиальных клеток)
Игла в модификации Дульбекко (DMEM), 449,5 мл
МИТО + Сыворотка Extender, 0,5 мл
FBS, 50 мл
Общий объем составляет 500 мл.
Покрытие среднего 2 (для нейронов мыши)
Neurobasal-A, 485 мл
B27, 10 мл
GlutaMAX-я, 5 мл (конечная концентрация 2 мМ)
Общий объем составляет 500 мл.
Покрытие среднего 3 (для крыс нейроны и глиальные клетки)
Минимальная Essential СМИ (MEM без фенола красного)
Глюкоза, 2,5 г (конечная концентрация, 27,8 мМ)
Раствором NaHCO 3, 100 мг (конечная концентрация, 2,38 мМ)
Трансферрина, 50 мг
FBS, 50 мл
GlutaMAX-я, 5 мл (конечная концентрация 2 мМ)
Инсулин, 12,5 мг
Общий объем составляет 500 мл.
Среда роста (для крыс нейроны и глиальные клетки)
MEM (без фенолового красного)
Глюкоза, 2,5 г (конечная концентрация, 27,8 мМ)
Раствором NaHCO 3, 100 мг (конечная концентрация, 2,38 мМ)
Трансферрина, 50 мг
FBS,25 мл
GlutaMAX-я, 1,25 мл (конечная концентрация 0,5 мМ)
B27 или NS21 {Чен, 2008 # 2399}, 10 мл
Цитозин β-D-арабинофуранозида (AraC), 0,56 мг (конечная концентрация, 4 мкм)
Общий объем составляет 500 мл.
Общие замечания
Наша культура СМИ не содержат антибиотики, потому что они могут оказывать цитотоксическое воздействие на культуру клеток глии и нейронов (ссылка 70, 71). Это делает его особенно важно придерживаться процедур стерилизации в области культуры, связанных с работой.
Смотрите таблицу реагентов для подробных источников химических веществ.

Таблица 1. Решения

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Протокол, представленные здесь включает в себя процедуры для татуировки для обозначения / определить мышей, для генотипирования мышей из хвостовой советы, и для культивирования нейронов мозга мыши при низкой плотности. В одном раунде экспериментов с использованием 6-8 щенков, эти процедуры, как правило, требуют ~ 0,5 ч, ~ 4 ч и ~ 2 ч, соответственно, в общей сложности 6-7 часов. Это делает его практичным для одного экспериментатора, чтобы завершить все процедуры, необходимые с момента рождения щенков »к обшивке нейронов культур - менее чем за один рабочий день (за исключением предварительной подготовки глиальных слоев фидерных).

Татуировка

Долгосрочный идентификация животных является необходимым для целей разведения и научных исследований, таких как анализ гистологии, функции клеток и поведения животных. Татуировка новорожденных животных является предпочтительным, поскольку он может быть проведена быстро и продолжается в течение большей части жизни животного 7,22-25. Tattooing на подушечки лап могут быть лучше, чем ног отсечения 23 по отношению к сохранению проверяемые поведения, например, в виде суспензии или захвата 22,26, хотя некоторые исследования не отмечено таких недостатков (например, 25). Там не было ни одного случая, матерей или отклонить дроблении щенков после нанесения татуировки. Для других методов долгосрочного идентификации животных, см недавние обзоры 7,23,24.

Генотипирование

Важнейшей особенностью в нашей протокола является использование метода быстрой генотипирования. Хотя подобные методы генотипирования были описаны в предыдущих докладах (например, 27,28), система, описанная здесь имеет по крайней мере два усовершенствования. Во-первых, она может выдержать определенные изменения в количестве исходной ткани, возраста животных и длины ампликонов. Таким образом, успешное генотипирование может быть достигнуто с использованием мышей в возрасте 1 день и, как старые, как 6 месяцев, и может быть осуществлена ​​с использованиемШирокий ассортимент пар праймеров. Во-вторых, этот метод не требует остановки решение для стадии экстракции ДНК. Это исключает чрезмерное обработки труб и пипетирования, а также позволяет автоматизировать параллельный несколькими трубками процесса с машиной ПЦР. Число образцов можно масштабировать до (например, 96 образцов), но легко и одновременно обработаны. Кроме того, тип образца не ограничивается хвостовых клипов; Другие типы проб, которые могут быть использованы, включают уха ударов, ног вырезки, целые ранних эмбрионов, и плаценты тканей 2-4,29,30. Различных видов животных могут быть также использованы. Таким образом, процедуры генотипирования надежны (повторяемые с низкой дисперсией внутри анализа) и воспроизводимым (низкий между анализа дисперсии между запусками или между лабораторий), и имеют преимущество высокой масштабируемости.

Следует отметить, что некоторые осторожность требуется для достижения ожидаемое качество результатов. Во-первых, в процессе экстракции ДНК, большое изменение в протоколе может ухудшить результаты.Например, значительное снижение объема ДНК экстракционного раствора (например, от 200 до 100 мкл на этапе 2,2) все еще ​​позволяет генотипирование, но это может уменьшить надежность и привести к изменению результатов ПЦР. В таких условиях, рекомендуется сократить объем экстракта ДНК от 4 до 2 мкл, а также увеличить объем H 2 O от 2 до 4 мкл, чтобы компенсировать изменение объема при реакции ПЦР (шаг 2.5). Во-вторых, в конце экстракции ДНК, раствор может быть использован для ПЦР сразу же, без центрифугированием в большинстве случаев, хотя хвост сохранит свою общую структуру и не будет полностью разлагается. Тем не менее, описано инверсия труб является существенным для целей диссоциации геномной ДНК из ткани (шаг 2,4). Важно также, чтобы использовать верхнюю часть, ясно раствора, за исключением обломков на дне пробирки, потому что включение последнего приведет к неоднозначные результаты ПЦР. Этишаги будут эффективными с минимальными затратами времени и усилий. В равной степени хорошие результаты могут быть получены путем активного вортексе образца (вместо инверсий) с последующим центрифугированием и использование супернатанта. В-третьих, после экстракции ДНК, ДНК можно хранить в течение длительного срока (например,> две недели). Рекомендуется центрифугировать раствор с помощью микроцентрифуге (например, 3,000-13,000 г при 4 ° С в течение 2 мин), супернатанты передачи в новые пробирки и хранить их при температуре -80 ° С. Когда сохраняется экстракт, используемый для генотипирования, кратко центрифуги образца после оттаивания, и использовать супернатант.

Нейронов культур

Другим важным признаком нашего протокола является использование в глиальных фидерного слоя для создания нейронных культур с низкой плотностью нанесения покрытия. Как правило, в первичных культурах нейронов головного мозга млекопитающих, клетки высевают с относительно высокой плотностью, на покровных покрытием без глиил фидерного слоя (например, 31-39). Когда плотность покрытия нейронов уменьшается с помощью этого метода, начальная отсутствие глиальных листа приводит к ухудшению роста нейронов и дендритов расширения (панели В, С на фиг 8-10), как сообщалось ранее 40-42, вероятно, из-за плохого глиальных рост 43,44.

Успешные, нейронные культуры низкой плотности могут быть получены по крайней мере, три основных типа методов. В одном подходе, Neurobasal среда используется в качестве питательной среды. Это делает возможным культуры нейронов в отсутствие глиальных фидерного слоя, и может быть использовано для низкой плотности нейрональных культур 45,46. Во втором подходе ("Banker типа" и его модификации), глиальные клетки совместно культивируют с нейронов в той же скважине, но физически отделена от них. В этом контексте глиальные клетки обеспечивают "трофической поддержки" для нейронов без контакта с ними напрямую1,41,42,47-49. В третьем подходе, нейроны помещают на предварительно установленном глиальных слой фидера, который поддерживает роста нейронов (например, 50-53) (Рисунки 8-10). В частности, нейроны мозга мыши высевают на глиальных фидерного слоя, полученного из мышей и крыс 8,34,54 41,55,56.

Мы предпочитаем последний из трех подходов к культуре низкой плотности, потому что Neurobasal среда может влиять на выживаемость нейронов 57, астроцитов глиальные клетки будет иметь важное значение в регулировании нервных функций 8,58, и физический контакт между нейронами и глиальных клеток может быть важно. Процедуры для культивирования мыши и крысы глиальные клетки похожи 59,60, но мы изменили их немного, чтобы приспособить для более быстрого роста в пробирке крысы против мыши глиальных клеток. Процедуры для крыс культуре клеток были изменены с 61-63. Использование глиальных подачи Лег для нейронов культур с низкой плотностью приводит к необходимости выполнять быстрый генотипирование, для того, чтобы соответствовать генотип фидерного слоя, что и нейронов в период между родами щенков »и неонатальной смертности или конца окне культура (1 -2 послеродовые дней).

Культура низкой плотности на глиальных фидерного слоя также важный метод, когда кто-то пытается культуры нейронов малых ядер в мозге (например, норадреналина-рилизинг-голубого пятна, и дофамина-рилизинг-черной субстанции). Эти зародыши содержат лишь небольшое количество нейронов и неизбежно получением культур с низкой плотностью 64-67.

Первичные культуры которые обычно получают в лаборатории с СА3-СА1 области гиппокампа, в моторной области коры головного мозга и полосатое тело мышей. Те же процедуры могут быть использованы для получения нейронов культур представляющих другие области мозга, например весь гиппокампе (в т.ч.uding зубчатой ​​извилины), и все коре головного мозга. Крысы нейроны из областей мозга, таких как гиппокамп и голубого пятна культивируют в Аналогичным образом, с помощью устройства подачи глиальных крысы слой. Эти нейроны, культивированные, как правило, используют в 1-4 недели в пробирке, с точным возраста культуры в зависимости от целей эксперимента. Следует отметить, что некоторые нейроны культивировали на глиальных фидерного слоя могут выживать в течение более чем 10 недель 34,68.

Одним из потенциальных проблем нейрональных культур с низкой плотностью в том, что нейронные свойства могут отличаться от тех, в культурах с высокой плотностью или в нейронах на месте. Сравнение этих систем обеспечивает интересную возможность изучить, как развитие нейронов и созревание страдают от многочисленных факторов, таких как плотность нейронов, растворимых факторов, секретируемых из нейронов, нейрон-к-нейрона контакта, и глиальных-нейронов взаимодействий.

Таким образом, tattooiнг на основе маркировки мышь длительный способ генотипирование является быстрым, и способ культивирования позволяет покрытие нейронов мыши при низкой плотности. Протокол, описанный здесь, может быть применена во всей своей полноте в других видов животных, несущих другие генетические мутации. Кроме того, отдельные этапы протокола могут быть использованы для других целей. Таким образом, протокол может быть использован в широком спектре приложений на основе потребностей экспериментаторов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS - tattooing
Machine Cleanser Animal Identification and Marking Systems, Inc. NMCR3 This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent Animal Identification and Marking Systems, Inc. NDAR4 This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment Animal Identification and Marking Systems, Inc. NBP01
Skin Prep Applicator Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSPA1 Q-tip.
Skin Prep solution Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSP01 This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format) EZ BioResearch LLC G2001-100
2X PCR Ready Mix II EZ BioResearch LLC G2001-100 A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial VWR BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade rpi A20090-500  We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA) Fisher BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl Dot Scientific Inc UG104-96RS  Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl Dot Scientific Inc UG2020-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl Dot Scientific Inc UG2812-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp EZ BioResearch LLC L1001 We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp EZ BioResearch LLC L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder GIBCO-Invitrogen 10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml  USA Scientific 1402-2900 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual  rpi 145660 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural USA Scientific 1605-0000 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO GIBCO-Invitrogen S33102
Tris base rpi T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement GIBCO-Invitrogen 17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated BD falcon 353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml BD falcon 353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml BD falcon 353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml BD falcon 352095
Countess (cell number counter) chamber slides GIBCO-Invitrogen C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) Sigma-Aldrich C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC) Sigma-Aldrich G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm Pyrex 3160-101
Distilled water GIBCO-Invitrogen 15230-147
DNase Type II Sigma-Aldrich D4527-200KU Stock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate GIBCO-Invitrogen 10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 569-0020
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO-Invitrogen 26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0 Carolina 633017
GlutaMAX-I GIBCO-Invitrogen 35050-061
Hanks' Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma-Aldrich H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent Sigma-Aldrich 258148-100 ML
Insulin Sigma-Aldrich I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka) Sigma-Aldrich 63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free BD Biosciences 356237 This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM) GIBCO-Invitrogen 51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml BD Biosciences 355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate BD falcon 353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate BD falcon 353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid GIBCO-Invitrogen 10888-022
Nitric Acid VWR bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21  prepared in the lab Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”  Fisher 13-678-6A Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”  Fisher 13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0% Sigma-Aldrich P9333-500G
Serological pipet, 2 ml BD falcon 357507
Serological pipet, 5 ml  BD falcon 357543
Serological pipet, 10 ml BD falcon 357551
Serological pipet, 25 ml BD falcon 357525
Serological pipet, 50 ml  BD falcon 357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis Sigma-Aldrich 480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich Sigma-Aldrich 431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC) Sigma-Aldrich S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm Corning 431219
Syringe, 3 ml BD falcon 309585
Transferrin, Holo, bovine plasma Calbiochem 616420
Trypan Blue stain, 0.4% GIBCO-Invitrogen T10282 This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI Sigma-Aldrich T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%  GIBCO-Invitrogen 25200-056
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2 Merck Millipore AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail Merck Millipore NE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMS Animal Identification and Marking Systems, Inc. NEO–9 This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GT BIO–RAD 170–4405 Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800 ProteinSimple FluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal Cycler BIO-RAD PTC-1148EDU Our PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac Basic BIO-RAD 164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, Countess GIBCO-Invitrogen C10310 This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2 NUAIRE NU-425-400 This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket NUAIRE NU-4850
Horizontal Clean Bench NUAIRE NU-201-330 This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed Shaker Labnet S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge Fisher 46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793 (2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034 (2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245 (2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. e626 (2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. e3844 (2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87, (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895 (2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. e2373 (2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. e2389 (2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. e3634 (2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. e3965 (2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. e3257 (2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. e2111 (2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633 (2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).
Быстрое Генотипирование животных Круги путем создания первичных культурах мозга нейронов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).More

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter