Summary
Las células madre del cáncer (CSC) están implicados en la recidiva del tumor debido a la quimio-resistencia. Hemos optimizado un protocolo para la selección y expansión de células madre cancerosas de líneas celulares de cáncer de ovario. Mediante el tratamiento de las células con el cisplatino quimioterapia y cultivar en una célula madre promoción de los medios de comunicación que enriquecen las culturas CSC no adherentes.
Abstract
Células madre del cáncer (CSC) se definen como un subconjunto de ciclismo lento y células indiferenciadas que dividen asimétricamente para generar altamente proliferativa, invasiva, y las células tumorales quimiorresistentes. Por lo tanto, los CAC son una población de células atractivo para apuntar terapéuticamente. CSC se predice para contribuir a un número de tipos de tumores malignos, incluyendo las de la sangre, cerebro, pulmón, tracto gastrointestinal, próstata y ovario. Aislar y enriquecer una población de células tumorales de células madre cancerosas permitirá a los investigadores estudiar las propiedades, la genética, y la respuesta terapéutica de células madre cancerosas. Hemos generado un protocolo que enriquece de forma reproducible para los CSC de cáncer de ovario a partir de líneas celulares de cáncer de ovario (SKOV3 y OVCA429). Las líneas celulares se tratan con 20 M de cisplatino durante 3 días. Las células supervivientes son aislados y cultivados en un medio de células madre libre de suero que contiene citoquinas y factores de crecimiento. Se demuestra un enriquecimiento de estas células madre cancerosas purificadas mediante el análisis de las células aisladas para known marcadores de células madre Oct4, Nanog, y PROM1 (CD133) y la superficie celular expresión de CD177 y CD133. La exposición CSC incrementó chemoresistance. Este método para el aislamiento de células madre cancerosas es una herramienta útil para estudiar el papel de las células madre cancerosas en la quimiorresistencia y recidiva tumoral.
Protocol
1. Cultivo Celular y Marcaje fluorescente de líneas celulares de cáncer de ovario
- Preparar medios SKOV3: medios McCoy suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 0,1 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina, y 50 mg / ml de estreptomicina. Mantener OVCA429 células en medio mínimo esencial (MEM) suplementado con 10% FBS, piruvato sódico 1 mM, 0,1 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina.
- Propagar las líneas celulares SKOV3 y OVCA429 en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO 2. Se cultivan las células a 40-50% de confluencia.
- Generar células que expresan la proteína fluorescente roja (RFP) con el fin de controlar la viabilidad in vitro e in vivo.
- Para generar células que expresan SKOV3 RFP, añadir partículas lentivirales que expresan RFP y 10 g / ml de polibreno a los medios SKOV3 en ausencia de penicilina y estreptomicina durante 72 horas.
- Después de 72 horas, seleccione para RFP células positivas por fluorescencia de células activado Sorting (FACS) como sigue: trypsinize RFP y no las células que expresan RFP, centrifugar a 125 xg durante 5 min, se resuspenden las células en 10 7 células / ml en PBS que contenía 0,1% de BSA. En un clasificador de células, usar células no RFP para determinar los parámetros de clasificación. Luego recoger células que expresan altos RFP usando un láser de 561 nm.
- Alternativamente, si el plásmido lentiviral expresa un casete de resistencia a los antibióticos, seleccionar las células que expresan RFP mediante el cultivo en el antibiótico apropiado (por ejemplo, 10 mg / ml de blasticidina). NOTA: La cantidad de partículas lentivirales que necesita ser usada puede variar por lote y por tipo de célula. Lentiviral título adecuado debe determinarse para cada tipo de célula.
2. enriquecimiento de las células madre del cáncer
- Tratar SKOV3, SKOV3-RFP, o OVCA429 líneas celulares con 20 M de cisplatino durante 72 horas. PRECAUCIÓN: El cisplatino es tóxico. Use ropa de protección / guantes y evitar el contacto con la piel y las membranas mucosas. No se deshaga de cisplatino in de aguas residuales.
- Preparar medios CSC: suero libre de medio DMEM / F12 suplementado con 5 mg / ml de insulina, 10 ng / factor de crecimiento epidérmico humano recombinante ml (EGF), 10 ng / factor de crecimiento de fibroblastos básico ml (bFGF), 12 ng / ml del factor inhibidor de la leucemia , y 0,4% de albúmina de suero bovino (BSA).
- Células trypsinize. Cultura células supervivientes en los medios de CSC.
NOTA: Después de 2 días en cultivo esferoides no adherentes se formarán. - Cambio de medio cada 2 días mediante la recopilación de los medios de comunicación que contiene las células y centrifugar a 125 xg durante 5 min. Entonces resuspender el precipitado en los medios de comunicación CSC fresco. Compruebe las células para la viabilidad cada 2 días contando las células y la realización de exclusión con azul de tripano.
- Luego recoger CSC para experimentos adicionales por centrifugación 129 xg durante 5 min y resuspender el sedimento en fenol que contiene tiocianato de guanidinio (ARN), solución salina tamponada con fosfato (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, y 11,9 mM de tampón de fosfato, pH 7,4) con 0,1% de BSA (por citometría de flujo), o los medios de comunicación CSC para continuarcultivar las células.
- Controle la morfología celular CSC utilizando un microscopio óptico a 20x y 40x aumentos.
3. CSC Caracterización mediante análisis de expresión génica de marcadores de células madre
- Recoger 3 preparaciones de células madre cancerosas mediante la recopilación de medios que contienen células, centrifugar a 129 xg durante 5 min, y resuspender el precipitado en una solución de fenol que contiene tiocianato de guanidinio (otros métodos para la extracción de ARN se pueden utilizar).
- Preparar el ARN total usando TRIzol según el protocolo del fabricante. Sintetizar ADN complementario (ADNc) 0,1-1 g de ARN usando un kit de transcripción inversa de ADNc disponibles comercialmente.
- Realizar transcripción inversa reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (QRT-PCR).
- Maquillaje mezcla maestra para cada conjunto de cebadores que contenían la mezcla de QRT-PCR, cebadores, y agua a un total de 8 l por muestra (cebadores con diferentes fluoróforos se pueden amplificar en el mismo pocillo). Por ejemplo, generaruna mezcla maestra para Oct4-FAM, Nanog-Hex, y GAPDH-CY5. Generar mezclas maestras separadas para Nestin y PROM1. Añadir 2 l de cDNA plantilla por muestra.
NOTA: Para este estudio, QRT-PCR se realizó usando los cebadores listados en la Tabla 1. - Realizar todos los QRT-PCR por duplicado para cada muestra utilizando un termociclador de PCR en tiempo real capaz de detectar múltiples fluoróforos. Incluya la plantilla no controles.
- Normalizar la expresión génica de células madre para la expresión de GAPDH en cada muestra usando el método ΔΔC T.
- Maquillaje mezcla maestra para cada conjunto de cebadores que contenían la mezcla de QRT-PCR, cebadores, y agua a un total de 8 l por muestra (cebadores con diferentes fluoróforos se pueden amplificar en el mismo pocillo). Por ejemplo, generaruna mezcla maestra para Oct4-FAM, Nanog-Hex, y GAPDH-CY5. Generar mezclas maestras separadas para Nestin y PROM1. Añadir 2 l de cDNA plantilla por muestra.
| Oct-4-FAM | Cebador 1: 5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 ' |
| Primer 2: 5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 ' | |
| FAM: 5'-CTTCCAAGC / ZEN / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 ' | |
| Nanog-HEX | Cebador 1: 5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 ' |
| Primer 2: 5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 ' | |
| Sonda HEX: 5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 ' | |
| GAPDH con Cy5 | Cebador 1: 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 ' |
| Primer 2: 5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 ' | |
| Sonda CY5: 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 ' | |
| Nestin-FAM | Cebador 1: 5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 ' |
| Primer 2: 5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 ' | |
| FAM: 5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 ' | |
| CD133-HEX | Cebador 1: 5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 ' |
| Primer 2: 5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 ' | |
| Sonda HEX: 5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3 |
Cuadro 1 Primers utilizados para la caracterización CSC por QRT-PCR.
e_title "> 4. CSC Análisis de Superficie Celular marcadores CD117 y CD133- CSC cosecha mediante la recopilación de los medios de comunicación que contiene las células y centrifugar a 125 xg durante 5 min. Añadir 500 l de una solución desprendimiento de células no proteolítica para romper las células-up. Centrifugar las células a 125 xg durante 5 min para eliminar la solución desprendimiento de las células. A continuación, lavar las células dos veces con PBS frío.
- Incubar en medio de cultivo normal durante 1 hora antes de células de etiquetado. Centrifugar las células durante 5 min a 129 x g. Resuspender las células en PBS con 0,1% de BSA con anti-CD133-PE y anti-CD117-FITC.
- Fijar las células durante la noche en paraformaldehído al 1%. Precaución: El paraformaldehido es tóxico (carcinógeno). Hacer en campana de extracción y utilizar dentro de una semana.
- Realizar citometría de flujo para analizar CD117 (con un anti-CD117 conjugado a FITC) y CD133 (anti-CD133 con conjugado a PE) expresión en la superficie celular en un citómetro de flujo. Recopilar datos sobre las células en el FL1 (FITC) y FL3 (PE) para los canales. Generar puertas para las células que expresan tantoFITC y PE. Generar un gráfico de puntos con 4 cuadrantes (FITC y PE, FITC + PE, PE FITC +, y + FITC y PE +) y determinar el número de células en cada cuadrante.
5. Analizando CSC para la respuesta terapéutica
- Placa de 5.000 células por pocillo (SKOV3, SKOV3-RFP, SKOV3 CSC y SKOV3-RFP CSC) en placas de 96 pocillos durante la noche.
- Tratar con cisplatino (0, 1, 10, 100, y 1.000 M) o paclitaxel (0, 0,01, 0,1, 1, 10 y 100 mM) durante 96 h.
- Realizar MTT (3 (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) ensayo de viabilidad celular.
- Placa de 5000 células por 100 l por pocillo en una placa de 96 pocillos (células de la placa por duplicado y los medios de comunicación incluyen sólo los pocillos de control).
- Después de 24 horas, añadir 10 l de 10 mg / ml de MTT. Incubar a 37 ° C durante 2-4 h (hasta que se forma un precipitado).
- Añadir 100 l de HCl mM MTT disolvente 4, 0,1% de NP-40 en isopropanol. Incubar durante 15 min en la oscuridad.
- Leer las placas a 570 nm en un plato reader.
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Representative Results
Para demostrar que se aislaron células madre cancerosas a partir de líneas celulares de cáncer de ovario epitelial utilizando el tratamiento con cisplatino, primero adquirimos imágenes de las líneas de células antes del tratamiento y después de la selección. Se utilizó microscopía de luz para capturar imágenes de adherente (no tratada) SKOV3 y OVCA429 células y SKOV3 y OVCA429 CSC (Figura 1). CSC aparecen redonda y no unido a las placas de cultivo de tejido (Figuras 1 y 2). Además, muestran que las células transducidas con SKOV3 RFP conservan su fluorescencia tras el aislamiento de las células madre cancerosas que demuestran que las células son viables (Figura 2B).
Culturas CSC viables fueron evaluados por su respuesta a la terapia con medicamentos. CSC demostró una mayor resistencia a cisplatino (particularmente a 100 M) y paclitaxel (10 M) (Figura 3). CSC se caracterizan a menudo por su expresión de genes de células madre. Expresión de CD133 (también conocido como PROM1), Nestin, Nanog, y Oct4 fue examinado. CD133 se indujo significativamente en cultivos SKOV3 CSC en comparación con las células no tratadas (control) (Figura 4A). CD133 también se indujo en cultivos de CSC en comparación con los controles no tratados por 16 veces y 13 veces en las células OVCA429 y OVCA429-RFP (datos no presentados). En los experimentos iniciales Oct4, Nanog, y Nestin fueron elevados en culturas SKOV3 CSC en comparación con no tratados, pero los resultados no fueron estadísticamente significativos (Figura 4A). Al repetir estos experimentos Oct4 y Nanog aumentaron en SKOV3 CSC comparación con las células de control parental (Figura 4B). Oct4 se incrementó en 4,7 veces y 8 veces en las células OVCA429 y OVCA429-RFP siguiendo el protocolo de enriquecimiento CSC (no mostrado). Por último, SKOV3 CSC presentan un aumento de la expresión de la superficie celular de la CSC marcador CD117 (Figura 5). En conclusión, este método permite la selección de células madre cancerosas viables esferoide (que expresan marcadores de células madre) en el cáncer de ovariolíneas celulares de la selección con cisplatino y el crecimiento en medios de células madre.
Figura 1. Morfología de SKOV3 y OVCA429 células y las células madre del cáncer (CSC) seleccionado de SKOV3 y OVCA429 células. Microscopía de contraste de fase representa a SKOV3 y OVCA429 células (adherente) que no están tratados y han sido seleccionados para CSC (esferoide).
Figura 2. enriquecimiento para los CAC produce esferoides no adherentes. Células (A) SKOV3 no tratada y enriquecida para células madre cancerosas (60X aumentos). Células SKOV3-RFP que no están tratados (B) (A y B) o enriquecida para células madre cancerosas (c d). Paneles de la izquierda muestran imágenes de contraste de fase y paneles de la derecha muestran la fluorescencia. Aumento original 40X. Barra de escala = 400 micras.
Figura 3. CSC muestran una mayor resistencia a quimioterapia en comparación con las líneas de células no tratadas. SKOV3 (A y B) y SKOV3-RFP (C y D), SKOV3 CSC (A y B) y SKOV3-RFP CSC (C y D) fueron tratados con diversos concentraciones de cisplatino (A y C) o paclitaxel (Taxol) (B y D). Se realizó el ensayo de MTT 96 horas después del tratamiento. Los experimentos se realizaron en n≥3 y las estadísticas se calcularon utilizando dos vías ANOVA; * P <0,05, *** p < ;. 0.0005 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Stem expresión marcador de células en células madre cancerosas en comparación con las células no tratadas. Análisis de QRT-PCR se realizó durante SKOV3 (control) y SKOV3 CSC. (A) CD133 (PROM1), Nestin, Nanog, y Oct4 (normalizó a GAPDH). ( B) Un experimento adicional que demuestra que las células madre cancerosas SKOV3-RFP obtenida de este protocolo células de rendimiento con Oct4 y Nanog elevada en comparación con las células no tratadas. Los resultados fueron normalizados con la expresión de GAPDH. N = 3 y las estadísticas se calcularon utilizando la t de Student; ** P <0,02, *** p <0,002.
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Figura 5. Citometría de Flujo Análisis de marcadores de células madre en células SKOV3 y SKOV3 CSC solo o transducidas o sin RFP. CD133, CD117, CD133 y / expresión de CD117 en (A) células SKOV3 (no tratado / control), (B) células madre cancerosas SKOV3, (C) SKOV3-RFP células no tratadas, y (D) CSC SKOV3-RFP. Los experimentos se realizaron por triplicado. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
CSC que son resistentes a la terapia pueden ser responsables de la recaída después del tratamiento del tumor primario. Caracterización de las CSC puede conducir a mejores tratamientos para el cáncer de ovario. Los parámetros críticos en el establecimiento de las CSC quimiorresistentes utilizando el protocolo anterior son los plazos de la duración del tratamiento con quimioterapia y la concentración de la quimioterapia. Cuando se utiliza el protocolo de Ma et al. se encontró que después de 7 días de tratamiento con cisplatino y paclitaxel, no hay células viables permanecieron 4. Al reducir el tratamiento de 3 días (con 20 M cisplatino en lugar de 40 M 10 M cisplatino y paclitaxel), células quimiorresistentes viables y células madre cancerosas desarrollan. La duración y dosis del tratamiento pueden necesitar ser alterado por diferentes líneas celulares de cáncer de ovario.
La principal limitación de este protocolo es la longitud que las células madre cancerosas permanecen viables. El uso de este protocolo, las células madre cancerosas permanecen viables durante menos de una semana. Por lo tanto, THtipos correos de experimentos y análisis para el CSC deben ser cuidadosamente cronometrada.
Además de la caracterización de los CSC debe llevarse a cabo. Sería útil comparar este método de CSC a otros métodos de generación de CSC para determinar la similitud y la diferencia entre estos tipos de células. Comparación de los marcadores de células madre, la respuesta al tratamiento, y el mejor sistema para el análisis in vivo debe llevarse a cabo entre los diferentes métodos para generar / selección de células madre cancerosas. Se ha sugerido que existen diferentes tipos de células madre cancerosas con diferentes patrones de expresión de marcadores de células madre y diferente pronóstico para los pacientes de 10-12, por lo tanto una definición más precisa de qué tipo de células madre cancerosas son generados por este protocolo puede ayudar a determinar cómo se relacionan con la malignidad humana . Por último, a fin de demostrar rigurosamente que las células madre cancerosas aisladas a partir de este protocolo son definitivos CSC, las células necesitan para ser inyectado en ratones inmunocomprometidos en un ensayo de dilución limitante. Esteensayo demuestra que las CSC son capaces de generar tumores de ovario a una densidad baja.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy | Life Technologies | 16600-108 | Warm to 37 °C prior to use |
| DMEM / F12 serum free | Life Technologies | 11320-033 | Warm to 37 °C prior to use |
| Minimal Essential Media | Life Technologies | 42360032 | Warm to 37 °C prior to use |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Blasticidin | Life Technologies | R21001 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | T7402-5MG | Caution: Toxic. Use precautions |
| pLenti-suCMV-Rsv | Gentarget | LVP023 | BSL2 approval needed |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Human Recombinant EGF | Cell Signaling Technology | 8916LC | |
| bFGF | BD biosciences | 354060 | |
| LIF | Santa Cruz | sc-4988A | |
| Bovine Serum Albumin | Roche | 03 116 956 001 | |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| IQ Multiplex Powermix | BioRad | 1725849 | |
| Accumax | Millipore | ||
| Primers | Integrated DNA Technology | individually designed and ordered (see protocol for sequnces) | |
| Anti-CD133 PE | Milenyl | 130-098-826 | Primer/probe sets are light sensitive |
| CD117-Biotin | Miltenly | 130-098-570 | |
| AntiBiotin-FITC | Miltenly | 130-098-796 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh. |
| Trypsin | Life Technologies | 25300062 | |
| MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) | Sigma-Aldrich | 25200-072 | |
| EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope | Advanced Microscopy Group | ||
| Biorad CFX96 C1000 System | Biorad | ||
| Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Spectramax 340PC384 | Molecular Devices |
References
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