Summary
Cancer stamceller (CSCs) påverkar tumör återfall på grund av chemoresistance. Vi har optimerat ett protokoll för urval och expansion av CSCs från äggstockscancer cellinjer. Genom att behandla celler med kemoterapeutiska cisplatin och odling i en stamcell främja mediernas vi berikar för icke-vidhäftande CSC kulturer.
Abstract
Cancer stamceller (CSCS) definieras som en delmängd av långsam cykling och odifferentierade celler som delar sig asymmetriskt för att alstra starkt proliferativa, invasiva, och kemoterapiresistenta tumörceller. Därför CSCs är en attraktiv population av celler för att rikta terapeutiskt. CSCs förutspås att bidra till ett antal olika typer av maligniteter inklusive de i blod, hjärna, lungor, mag-tarmkanalen, prostata, och äggstock. Isolera och berika en tumörcellpopulation för CSCs kommer det möjligt för forskare att studera egenskaper, genetik, och terapeutisk respons CSCs. Vi genererade ett protokoll som reproducerbart berikar för äggstockscancer CSCs från äggstockscancercellinjer (SKOV3 och OVCA429). Cellinjer är behandlade med 20 ^ iM cisplatin för 3 dagar. Överlevande celler isoleras och odlas i ett serumfritt stamcellmedium innehållande cytokiner och tillväxtfaktorer. Vi visar en anrikning av dessa renade CSCs genom att analysera de isolerade celler för kNown stamcellsmarkörer Oct4, Nanog och Prom1 (CD133) och cellytan uttryck av CD177 och CD133. Den CSCs uppvisar ökad chemoresistance. Denna metod för isolering av CSCs är ett användbart verktyg för att studera rollen av CSCs i chemoresistance och tumör återfall.
Protocol
1 Cell Culture och Fluorescerande märkning av äggstockscancer cellinjer
- Förbered SKOV3 media: McCoy-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 0,1 mM L-glutamin, 50 U / ml penicillin och 50 | ig / ml streptomycin. Bibehåll OVCA429 celler i minimalt essentiellt medium (MEM) kompletterat med 10% FBS, 1 mM natriumpyruvat, 0,1 mM L-glutamin, 50 U / ml penicillin och 50 | ig / ml streptomycin.
- Föröka SKOV3 och OVCA429 cellinjer i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% CO2. Odla cellerna till 40-50% konfluens.
- Generera celler uttryck rött fluorescerande protein (RFP) för att övervaka livsduglighet in vitro och in vivo.
- För att generera SKOV3-celler som uttrycker RFP, lägga lentivirala partiklar som uttrycker RFP och 10 | ig / ml polybren till SKOV3 media i frånvaro av penicillin och streptomycin för 72 tim.
- Efter 72 timmar, väljer för RFP positiva celler genom fluorescensaktiverad cell Sorting (FACS) enligt följande: Trypsinize RFP och icke-RFP-uttryckande celler, centrifugera vid 125 xg under 5 min, resuspendera cellerna vid 10 7 celler / ml i PBS innehållande 0,1% BSA. På en cellsorterare, använda icke-RFP celler för att bestämma sorteringsparametrarna. Då samlar celler som uttrycker höga RFP med hjälp av en 561 nm laser.
- Alternativt, om den lentivirala plasmiden uttrycker en antibiotikaresistent kassett, selektera för RFP-uttryckande celler genom odling i det lämpliga antibiotikumet (t.ex. 10 mg / ml blasticidin). OBS: Mängden lentivirala partiklar som måste användas kan variera per parti och celltyp. Korrekt lentivirala titem bör bestämmas för varje celltyp.
2. Anrikning av cancerstamceller
- Behandla SKOV3, SKOV3-RFP, eller OVCA429 cellinjer med 20 ^ M av cisplatin under 72 timmar. VARNING: Cisplatin är giftigt. Använd skyddskläder / handskar och undvik kontakt med hud och slemhinnor. Kasta inte cisplatin in avloppsvatten.
- Förbered CSC media: serumfritt DMEM / F12-medium kompletterat med 5 | ig / ml insulin, 10 ng / ml human rekombinant epidermal tillväxtfaktor (EGF), 10 ng / ml basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF), 12 ng / ml leukemihämmande faktor , och 0,4% bovint serumalbumin (BSA).
- Trypsinize celler. Kultur överlevande celler i CSC medier.
OBS: Efter 2 dagar i kultur icke vidhäftande sfäroider bildas. - Ändra medier vart två dagar genom att samla mediet innehållande celler och centrifugering vid 125 xg under 5 min. Då suspendera pelleten i färskt CSC media. Kolla celler för livskraft varje 2 dagar genom att räkna celler och utföra trypanblåttuteslutning.
- Samla Därefter CSCs för ytterligare experiment genom att centrifugera 129 xg under 5 min och återsuspendera pelleten i fenol innehållande guanidinium thiocynate (RNA), fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, och 11,9 mM fosfatbuffert, pH 7,4) med 0,1% BSA (för flödescytometri), eller CSC media för att fortsättaodling av cellerna.
- Övervaka CSC cellmorfologin med hjälp av ett ljusmikroskop vid 20X och 40X förstoring.
3. CSC Karaktärisering via Gene Expression Analysis för Stem Cell Markers
- Samla tre beredningar av CSCs genom att samla mediet innehållande celler, centrifugering vid 129 xg under 5 min och återsuspendera pelleten i en lösning av fenol innehållande guanidinium thiocynate (andra metoder för RNA-extraktion kan användas).
- Förbered totalt RNA med hjälp TRIzol enligt tillverkarens protokoll. Syntetisera komplementärt DNA (cDNA) 0,1-1 mikrogram av RNA med hjälp av en kommersiellt tillgänglig cDNA omvänd transkription kit.
- Utför kvantitativ omvänt transkriberade polymeraskedjereaktion (QRT-PCR).
- Make up Master Mix för varje uppsättning primers innehållande QRT-PCR-blandning, primers, och vatten till totalt 8 l per prov (primers med olika fluoroforer kan förstärkas i samma väl). Till exempel, genereraren master mix för Oct4-FAM, Nanog-Hex, och GAPDH-CY5. Generera separat master Blandningar nestin och Prom1. Lägg 2 pl av cDNA-mall per prov.
OBS: För denna studie var QRT-PCR med användning av primers som anges i tabell 1. - Utför alla QRT-PCR i två exemplar för varje prov genom en realtids PCR termo kan detektera multipla fluoroforer. Inkludera utan strängar.
- Normalisera stamcells genuttryck till GAPDH uttryck för varje prov med hjälp av ΔΔC T-metoden.
- Make up Master Mix för varje uppsättning primers innehållande QRT-PCR-blandning, primers, och vatten till totalt 8 l per prov (primers med olika fluoroforer kan förstärkas i samma väl). Till exempel, genereraren master mix för Oct4-FAM, Nanog-Hex, och GAPDH-CY5. Generera separat master Blandningar nestin och Prom1. Lägg 2 pl av cDNA-mall per prov.
| Oktober-4-FAM | Primer 1: 5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 ' |
| Primer 2: 5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 ' | |
| FAM sond: 5'-CTTCCAAGC / ZEN / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 " | |
| Nanog-HEX | Primer 1: 5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 ' |
| Primer 2: 5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 ' | |
| HEX sond: 5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 ' | |
| GAPDH-CY5 | Primer 1: 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 ' |
| Primer 2: 5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 ' | |
| CY5 sond: 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 ' | |
| Nestin-FAM | Primer 1: 5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 ' |
| Primer 2: 5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 ' | |
| FAM sond: 5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 " | |
| CD133-HEX | Primer 1: 5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 ' |
| Primer 2: 5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 ' | |
| HEX sond: 5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3 |
Tabell 1. Primers som används för CSC karakterisering av QRT-PCR.
e_title "> 4. Analysera CSCs för cellytmarkörer CD117 och CD133- Harvest CSCs genom att samla media som innehåller celler och centrifugera vid 125 xg under 5 minuter. Lägg 500 | il av en icke-proteolytisk cell lösgör lösning för att bryta upp cellerna. Centrifugera cellerna vid 125 xg under 5 minuter för att avlägsna celllösgör lösning. Tvätta sedan cellerna två gånger med kall PBS.
- Inkubera i normalt tillväxtmedium för en h före märkning celler. Centrifugera ner cellerna under 5 min vid 129 x g. Resuspendera cellerna i PBS med 0,1% BSA med anti-CD133-PE-och anti-CD117-FITC.
- Fix celler över natten i 1% paraformaldehyd. Varning: Paraformaldehyd är giftigt (misstänkt cancerframkallande). Gör i dragskåp och använd inom en vecka.
- Utför flödescytometri för att analysera CD117 (med en anti-CD117 konjugerad till FITC) och CD133 (med anti-CD133 konjugerad till PE) cellyteexpression på en flödescytometer. Samla data om celler i FL1 (för FITC) och FL3 (för PE) kanaler. Generera grindar för celler som uttrycker bådaFITC och PE. Generera ett punktdiagram med fyra kvadranter (FITC- och PE, FITC + PE, FITC- PE + och FITC + och PE +) och bestämma antalet celler i varje kvadrant.
5. Analysera CSCs för terapeutiskt svar
- Plate 5000 celler per brunn (SKOV3, SKOV3-RFP, SKOV3 CSC och SKOV3-RFP CSCS) på 96-brunnars plattor över natten.
- Behandla med cisplatin (0, 1, 10, 100 och 1000 ^ iM) eller paklitaxel (0, 0,01, 0,1, 1, 10, och 100 ^ iM) för 96 tim.
- Utför MTT (3 (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) cellviabilitet analysen.
- Plate 5000 celler per 100 l per brunn på en 96-brunnar (platta celler i två exemplar och inkludera media bara kontrollera brunnar).
- Efter 24 timmar, tillsätt 10 ìl av 10 mg / ml MTT. Inkubera vid 37 ° C under 2-4 timmar (tills fällning bildas).
- Lägg 100 | il MTT lösningsmedel 4 mM HCl, 0,1% NP-40 i isopropanol. Inkubera i 15 minuter i mörker.
- Läs plattorna vid 570 nm på en tallrik rEader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att visa att vi isolerade CSCs från äggstockscancer cellinjer med hjälp av cisplatinbehandling, först köpte vi bilder av cellinjer före behandling och efter valet. Vi använde ljusmikroskop för att ta bilder av vidhäftande (obehandlad) SKOV3 och OVCA429 celler och SKOV3 och OVCA429 CSCs (Figur 1). CSCs visas runt och inte är knutna till de vävnadsodlingsplattor (figur 1 och 2). Vi visar vidare att SKOV3-celler transducerade med RFP behåller sin fluorescens efter isolering av de CSCs demonstrerar att cellerna är livsdugliga (Figur 2B).
Livskraftiga CSC kulturer bedömdes för deras svar på läkemedelsbehandling. CSCs visat någon ökad resistens mot cisplatin (speciellt vid 100 M) och paklitaxel (10 M) (Figur 3). CSCs karakteriseras ofta av deras uttryck av stamcellsgener. Uttryck av CD133 (även känd som Prom1), Var nestin, Nanog och Oct4 undersöktes. CD133 signifikant induceras i SKOV3 CSC kulturer jämfört med obehandlade (kontroll)-celler (Figur 4A). CD133 också induceras i CSC kulturer jämfört med obehandlade kontroller med 16-faldigt och 13-faldigt i OVCA429 och OVCA429-RFP-celler (data visas ej). I initiala experiment Oct4, Nanog, och nestin var förhöjda i SKOV3 CSC kulturer jämfört med obehandlade, men resultaten var inte statistiskt signifikant (Figur 4A). Efter att upprepa dessa experiment Oct4 och Nanog ökat i SKOV3 CSCs jämfört med föräldrakontroll celler (Figur 4B). Oct4 ökade med 4,7 gånger och 8 gånger i OVCA429 och OVCA429-RFP celler efter CSC anrikningsprotokoll (visas ej). Slutligen ökade SKOV3 CSCs uppvisar cellyteexpression av CSC markören CD117 (Figur 5). Sammanfattningsvis ger denna metod för val av livskraftiga sfäroida CSCs (uttrycker stamcellsmarkörer) i äggstockscancercellinjer efter valet med cisplatin och tillväxt i stamcellsmedier.
Figur 1. Morfologi av SKOV3 och OVCA429 celler och cancerstamceller (CSCs) valda från SKOV3 och OVCA429 celler. Faskontrastmikroskopi skildrar SKOV3 och OVCA429 celler (vidhäftande) som är obehandlad och har valts ut för CSCs (sfäroid).
Figur 2 Anrikning för CSCs ger icke-vidhäftande sfäroider. (A) SKOV3-celler obehandlade och berikad för CSCs (60X förstoring). (B) SKOV3-RFP celler som är obehandlade (a och b) eller anrikat för CSCs (c d). Vänster paneler skildra fas kontrast och höger sida skildra fluorescens. Original förstoring 40X. Skala bar = 400 mikrometer.
Figur 3 CSCs uppvisar ökad chemoresistance jämfört med obehandlade cellinjer. SKOV3 (A och B) och SKOV3-RFP (C och D), SKOV3 CSCS (A och B) och SKOV3-RFP CSCs (C och D) behandlades med diverse koncentrationer av cisplatin (A och C) eller paklitaxel (Taxol) (B och D). 96 h efter behandling MTT-analys utfördes. Experiment utfördes i n≥3 och statistik beräknades med Two Way ANOVA; * P <0,05, *** p < ;. 0,0005 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Stamcell markör expression i CSCs jämfört med obehandlade celler. QRT-PCR-analys utfördes för SKOV3 (kontroll) och SKOV3 CSCs. (A) CD133 (Prom1), nestin, Nanog, och Oct4 (normaliserad till GAPDH). ( B) En ytterligare experiment som visar att de SKOV3-RFP CSCs erhållits från detta protokoll avkastning celler med förhöjd Oct4 och Nanog jämfört med obehandlade celler. Resultaten normaliserades med GAPDH uttryck. N = 3 och statistik beräknades med hjälp av studenter t-test; ** P <0,02, *** p <0,002.
5 "fo: content-width =" 5in "src =" / filer / ftp_upload / 51891 / 51891fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 5 Flödescytometri Analys av stamcellsmarkörer i SKOV3 celler och SKOV3 CSCs ensam eller omvandlade eller utan RFP. CD133, CD117 och CD133 / CD117 uttryck i (A) SKOV3 (obehandlad / kontroll)-celler, (B) SKOV3 CSCs, (C) SKOV3-RFP obehandlade celler, och (D) SKOV3-RFP CSCs. Experiment utfördes i tre exemplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CSCs som är resistenta mot behandling kan vara ansvarig för återfall efter behandling av primärtumör. Karakterisering av CSCs kan leda till förbättrade behandlingsmetoder för äggstockscancer. De kritiska parametrarna i upprättandet av kemoterapiresistent CSCs använder ovanstående protokoll är tidslängden behandling med kemoterapi och koncentrationen av kemoterapi. Vid användning av protokollet i Ma et al. Det visade sig att efter 7 dagars behandling med cisplatin och paklitaxel, inga livsdugliga celler återstod 4. Genom att minska behandlingen till 3 dagar (med 20 iM cisplatin istället för 40 ^ M cisplatin och 10 iM paklitaxel), livskraftiga kemoterapiresistenta celler och CSCs utvecklas. Längden och dosen av behandlingen kan behöva ändras för olika äggstockscancercellinjer.
Den största begränsningen av detta protokoll är längden att CSCs förblir livskraftiga. Med hjälp av detta protokoll, de CSCs förblir lönsamt för mindre än en vecka. Därför the typer av experiment och analyser för CSCs måste noga tidsinställda.
Ytterligare karakterisering av CSCs måste genomföras. Det skulle vara bra att jämföra denna metod för CSCs till andra metoder för CSC generation att avgöra likheten och skillnaden mellan dessa celltyper. Jämförelse av markörer stamceller, svar på behandlingen, och bästa systemet för in vivo analys behöver genomföras mellan olika metoder för att generera / val av CSCs. Det har föreslagits att det finns olika typer av CSCs med olika uttrycksmönster stamceller markörer och olika prognos för patienter 10-12, vilket ytterligare definition av vilken typ av CSCs genereras av detta protokoll kan bidra till att avgöra hur de relaterar till den mänskliga malignitet . Slutligen, för att noggrant visa att CSCs isolerade från detta protokoll är slutgiltiga CSCs, celler måste injiceras i nedsatt immunförsvar möss i en begränsande spädningsanalys. DettaAnalysen visar att CSCs kan generera äggstockstumörer vid en låg densitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy | Life Technologies | 16600-108 | Warm to 37 °C prior to use |
| DMEM / F12 serum free | Life Technologies | 11320-033 | Warm to 37 °C prior to use |
| Minimal Essential Media | Life Technologies | 42360032 | Warm to 37 °C prior to use |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Blasticidin | Life Technologies | R21001 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | T7402-5MG | Caution: Toxic. Use precautions |
| pLenti-suCMV-Rsv | Gentarget | LVP023 | BSL2 approval needed |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Human Recombinant EGF | Cell Signaling Technology | 8916LC | |
| bFGF | BD biosciences | 354060 | |
| LIF | Santa Cruz | sc-4988A | |
| Bovine Serum Albumin | Roche | 03 116 956 001 | |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| IQ Multiplex Powermix | BioRad | 1725849 | |
| Accumax | Millipore | ||
| Primers | Integrated DNA Technology | individually designed and ordered (see protocol for sequnces) | |
| Anti-CD133 PE | Milenyl | 130-098-826 | Primer/probe sets are light sensitive |
| CD117-Biotin | Miltenly | 130-098-570 | |
| AntiBiotin-FITC | Miltenly | 130-098-796 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh. |
| Trypsin | Life Technologies | 25300062 | |
| MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) | Sigma-Aldrich | 25200-072 | |
| EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope | Advanced Microscopy Group | ||
| Biorad CFX96 C1000 System | Biorad | ||
| Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Spectramax 340PC384 | Molecular Devices |
References
- Pennington, K., Pulaski, H., Pennington, M., Liu, J. R. Too Much of a Good Thing: Suicide Prevention Promotes Chemoresistance in Ovarian Carcinoma. Curr Cancer Drug Targets. 10, 575-583 (2010).
- Thigpen, T. A rational approach to the management of recurrent or persistent ovarian carcinoma. Clin Obstet Gynecol. 55, 114-130 (2012).
- Burgos-Ojeda, D., Rueda, B. R., Buckanovich, R. J. Ovarian cancer stem cell markers: prognostic and therapeutic implications. Cancer letters. 322, 1-7 (2012).
- Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42, 593-602 (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3, 730-737 (1997).
- Alison, M. R., Lim, S. M., Nicholson, L. J. Cancer stem cells: problems for therapy. The Journal of pathology. 223, 147-161 (2011).
- Luo, X., Dong, Z., Chen, Y., Yang, L., Lai, D. Enrichment of ovarian cancer stem-like cells is associated with epithelial to mesenchymal transition through an miRNA-activated AKT pathway. Cell proliferation. 46, 436-446 (2013).
- Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line. Molecular and cellular biochemistry. 363, 257-268 (2012).
- Abubaker, K., et al. Short-term single treatment of chemotherapy results in the enrichment of ovarian cancer stem cell-like cells leading to an increased tumor burden. Molecular cancer. 12, 24 (2013).
- Conic, I., Dimov, I., Tasic-Dimov, D., Djordjevic, B., Stefanovic, V. Ovarian epithelial cancer stem cells. ScientificWorldJournal. 11, 1243-1269 (2011).
- Liu, K. C., et al. Ovarian cancer stem-like cells show induced translineage-differentiation capacity and are suppressed by alkaline phosphatase inhibitor. Oncotarget. 4 (12), 2366-2382 (2013).
- Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncology reports. 23, 1277-1284 (2010).
