Summary
Kræft stamceller (CSCS) er impliceret i tumor tilbagefald på grund kemoterapiresistens. Vi har optimeret en protokol for udvælgelse og udvidelse af CSCS fra ovariekræft cellelinjer. Ved at behandle celler med det kemoterapeutiske cisplatin og dyrkning i en stamcelle fremme medier vi berige for ikke-adhærente CSC kulturer.
Abstract
Kræft stamceller (CSCS) defineres som en delmængde af langsom cykling og udifferentierede celler, der deler asymmetrisk til at generere meget proliferativ, invasive, og kemoterapi tumorceller. Derfor cscs er en attraktiv population af celler til at målrette terapeutisk. Cscs forventes at bidrage til en række typer af maligniteter inklusive dem i blod, hjerne, lunger, mave-tarmkanalen, prostata og ovarie. Isolere og berige en tumorcellepopulation til CSCS vil give forskerne mulighed for at studere egenskaber, genetik, og terapeutisk respons CSCS. Vi genererede en protokol, der reproducerbart beriger for kræft i æggestokkene CSCS fra æggestokkene cancercellelinjer (SKOV3 og OVCA429). Cellelinjer behandlet med 20 pM cisplatin i 3 dage. Overlevende celler isoleres og dyrkes i et serumfrit stamceller medier indeholdende cytokiner og vækstfaktorer. Vi demonstrerer en berigelse af disse oprensede CSCS ved at analysere de isolerede celler for Known stamcellemarkører Oct4, Nanog, og Prom1 (CD133) og celleoverfladeekspression af CD177 og CD133. Den CSCS udstilling øget kemoterapiresistens. Denne metode til isolering af CSCS er et nyttigt redskab til at studere den rolle, CSCS i kemoterapiresistens og tumor tilbagefald.
Protocol
1. Celle Kultur og fluorescensmærkning af æggestokkene cancercellelinjer
- Forbered SKOV3 medier: McCoy medier suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 0,1 mM L-glutamin, 50 U / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin. Oprethold OVCA429 celler i minimale essentielle medier (MEM) suppleret med 10% FBS, 1 mM natriumpyruvat, 0,1 mM L-glutamin, 50 U / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin.
- Propagate SKOV3 og OVCA429 cellelinier i en befugtet inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. Grow celler til 40-50% sammenflydning.
- Generate celler, der udtrykker rødt fluorescerende protein (RFP) for at overvåge levedygtighed in vitro og in vivo.
- For at generere SKOV3-celler, der udtrykker RFP tilføje lentivirale partikler udtrykker RFP og 10 ug / ml polybren til SKOV3 medier i fravær af penicillin og streptomycin i 72 timer.
- Efter 72 timer, skal du vælge for RFP positive celler ved Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) som følger: Trypsinisér RFP og ikke-RFP udtrykkende celler centrifugeres ved 125 xg i 5 minutter, resuspender cellerne ved 10 7 celler / ml i PBS indeholdende 0,1% BSA. På en celle sorteringsanlæg, bruge ikke-RFP-celler til at bestemme sortering parametre. Derefter indsamle celler, der udtrykker høje RFP anvendelse af en 561 nm laser.
- Alternativt, hvis lentivirale plasmid udtrykker et antibiotikaresistens kassette, selektere for RFP udtrykkende celler ved dyrkning i det passende antibiotika (såsom 10 mg / ml Blasticidin). BEMÆRK: Mængden af lentivirale partikler, der skal anvendes, kan variere fra parti og celletype. Korrekt lentiviral titer bør bestemmes for hver celletype.
2. Berigelse af cancerstamceller
- Forkæl SKOV3, SKOV3-RFP eller OVCA429 cellelinjer med 20 pM af cisplatin i 72 timer. ADVARSEL: Cisplatin er giftig. Brug beskyttelsestøj / handsker og undgå kontakt med hud og slimhinder. Smid ikke cisplatin In spildevand.
- Forbered CSC medier: serumfrit DMEM / F12-medium suppleret med 5 ug / ml insulin, 10 ng / ml human rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF), 10 ng / ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF), 12 ng / ml leukæmiinhiberende faktor og 0,4% bovint serumalbumin (BSA).
- Trypsinisér cellerne. Kultur overlevende celler i CSC medier.
BEMÆRK: Efter 2 dage i kultur ikke-klæbende sphæroider vil dannes. - Skift medier hver 2 dage ved at indsamle medier indeholdende cellerne og centrifugering ved 125 xg i 5 minutter. Så pellet resuspenderes i frisk CSC medier. Kontroller cellerne for levedygtighed hver 2 dage ved at tælle celler og udførelse trypanblåteksklusion.
- Derefter indsamle cscs til yderligere eksperimenter ved centrifugering 129 xg i 5 minutter, og resuspendere pelleten i phenol indeholdende guanidinium thiocynate (RNA), phosphatbufret saltvand (PBS: 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, og 11,9 mM phosphatpuffer, pH 7,4) med 0,1% BSA (for flowcytometri) eller CSC medier for at fortsættedyrkning af cellerne.
- Overvåg CSC cellemorfologien ved hjælp af et lysmikroskop ved 20X og 40X forstørrelse.
3. CSC Karakterisering via genekspressionsanalyse til stamcellemarkører
- Saml 3 præparater af CSCS ved at indsamle medier, som indeholder celler, centrifugering ved 129 xg i 5 minutter, og opblandes pellet i en opløsning af phenol indeholdende guanidinium thiocynate (kan der anvendes andre metoder til RNA-ekstraktion).
- Forbered samlede RNA under anvendelse af TRIzol ifølge producentens protokol. Syntese af komplementært DNA (cDNA) fra 0,1 til 1 pg RNA ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt cDNA Revers transkription kit.
- Udfør kvantitativ revers transkriberet polymerasekædereaktion (QRT-PCR).
- Fyldes op mester mix for hvert sæt af primere indeholdende QRT-PCR-blanding, primere, og vand til i alt 8 pi per prøve (primere med forskellige fluoroforer kan forstærkes i det samme godt). For eksempel generereren master mix til Oct4-FAM, Nanog-Hex, og GAPDH-CY5. Generer separate masterblandinger for Nestin og Prom1. Tilsæt 2 ul cDNA-skabelon per prøve.
BEMÆRK: Til denne undersøgelse blev QRT-PCR udført under anvendelse af primere, der er opført i tabel 1. - Udfør alle QRT-PCR i to eksemplarer for hver prøve ved anvendelse af en real time PCR thermocycler stand til at detektere flere fluoroforer. Medtag kontroller uden skabelon.
- Normalisér stamceller genekspression til GAPDH udtryk for hver prøve ved hjælp af metode ΔΔC T.
- Fyldes op mester mix for hvert sæt af primere indeholdende QRT-PCR-blanding, primere, og vand til i alt 8 pi per prøve (primere med forskellige fluoroforer kan forstærkes i det samme godt). For eksempel generereren master mix til Oct4-FAM, Nanog-Hex, og GAPDH-CY5. Generer separate masterblandinger for Nestin og Prom1. Tilsæt 2 ul cDNA-skabelon per prøve.
| Oct-4-FAM | Primer 1: 5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 ' |
| Primer 2: 5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 ' | |
| FAM sonde: 5'-CTTCCAAGC / ZEN / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 ' | |
| Nanog-HEX | Primer 1: 5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 ' |
| Primer 2: 5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 ' | |
| HEX sonde: 5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 ' | |
| GAPDH-CY5 | Primer 1: 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 ' |
| Primer 2: 5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 ' | |
| CY5 sonde: 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 ' | |
| Nestin-FAM | Primer 1: 5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 ' |
| Primer 2: 5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 ' | |
| FAM sonde: 5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 ' | |
| CD133-HEX | Primer 1: 5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 ' |
| Primer 2: 5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 ' | |
| HEX sonde: 5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3 |
Tabel 1. Primere anvendt CSC karakterisering af QRT-PCR.
e_title "> 4. Analyse CSCS for celleoverflademarkører CD117 og CD133- Harvest cscs ved at indsamle medier indeholdende cellerne og centrifugering ved 125 xg i 5 min. Tilsæt 500 pi af en ikke-proteolytisk celle løsrivelse løsning at opbryde celler. Centrifuger cellerne ved 125 xg i 5 minutter for at fjerne celle løsrivelse løsning. Vask derefter cellerne to gange med kold PBS.
- Inkuber i normal vækst medier i 1 time forud for mærkning af celler. Spin ned celler i 5 minutter ved 129 x g. Resuspender celler i PBS med 0,1% BSA med anti-CD133-PE og anti-CD117-FITC.
- Fix celler natten over i 1% paraformaldehyd. Forsigtig: Paraformaldehyd er giftig (formodet kræftfremkaldende). Gør i stinkskab og brug inden for en uge.
- Udfør flowcytometri at analysere CD117 (med et anti-CD117 konjugeret til FITC) og CD133 (med anti-CD133 konjugeret til PE) celleoverfladeekspression på et flowcytometer. Indsamle data om celler i FL1- (til FITC) og FL3 (til PE) kanaler. Generer porte for celler, der udtrykker bådeFITC og PE. Generer et punktdiagram med 4 kvadranter (FITC- og PE-FITC + PE-, FITC- PE +, og FITC + og PE +) og bestemme antallet af celler i hver kvadrant.
5. Analyse CSCS for terapeutisk respons
- Plade 5.000 celler per brønd (SKOV3, SKOV3-RFP SKOV3 CSC og SKOV3-RFP cscs) på plader med 96 brønde natten over.
- Behandling med cisplatin (0, 1, 10, 100 og 1.000 uM) eller paclitaxel (0, 0,01, 0,1, 1, 10 og 100 uM) i 96 timer.
- Udfør MTT (3 (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) cellelevedygtighedsassay.
- Plate 5.000 celler pr 100 pi per brønd på en 96-brønds plade (plade celler i to eksemplarer, og omfatter kun mediet kontrolbrønde).
- Efter 24 timer tilsættes 10 ul 10 mg / ml MTT. Der inkuberes ved 37 ° C i 2-4 timer (indtil bundfald).
- Tilsæt 100 pi MTT opløsningsmiddel 4 mM HCI, 0,1% NP-40 i isopropanol. Inkuber i 15 min i mørke.
- Læs pladerne ved 570 nm på en plade reader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere, at vi isolerede CSCS fra epitelovariecancer cellelinjer hjælp cisplatinbehandlingen, vi først købte billeder af cellelinier før behandling og efter valget. Vi brugte lysmikroskopi at fange billeder af vedhængende (ubehandlet) SKOV3 og OVCA429 celler og SKOV3 og OVCA429 CSCS (figur 1). Cscs vises rundt og ikke bundet til vævskulturpladerne (figur 1 og 2). Vi viser desuden, at SKOV3-celler transduceret med RFP bevarer deres fluorescens efter isolering af de cscs viser, at cellerne er levedygtige (figur 2B).
Levedygtige CSC kulturer blev vurderet for deres reaktion på medicinsk behandling. Cscs vist øget resistens over for cisplatin (især ved 100 uM) og paclitaxel (10 uM) (figur 3). CSCS er ofte kendetegnet ved deres ekspression af stamceller gener. Ekspression af CD133 (også kendt som Prom1) Blev Nestin, Nanog og Oct4 undersøgt. CD133 var signifikant induceret i SKOV3 CSC kulturer i forhold til ubehandlede (kontrol) celler (figur 4A). CD133 blev også induceret i CSC kulturer i forhold til ubehandlede kontroller med 16 gange og 13 gange i OVCA429 og OVCA429-RFP-celler (data ikke vist). I indledende forsøg Oct4, Nanog, og Nestin var forhøjet i SKOV3 CSC kulturer i forhold til ubehandlede, men resultaterne var ikke statistisk signifikant (figur 4A). Ved at gentage disse forsøg Oct4 og nanog steg i SKOV3 CSCS forhold til forældrekontrol celler (figur 4b). Oct4 blev øget med 4,7 gange og 8 gange i OVCA429 og OVCA429-RFP celler efter CSC berigelse protokol (ikke vist). Endelig SKOV3 cscs udviser øget celleoverfladeekspression af CSC markør CD117 (figur 5). Afslutningsvis denne metode giver mulighed for udvælgelse af levedygtige kugleformede CSCS (udtrykker stamcellemarkører) i kræft i æggestokkenecellelinier ved selektion med cisplatin og vækst i stamceller medier.
Figur 1. Morfologi SKOV3 og OVCA429 celler og cancer stamceller (CSCS) udvalgt fra SKOV3 og OVCA429 celler. Fasekontrastmikroskopi skildrer SKOV3 og OVCA429 celler (klæbende), som er ubehandlet og er blevet udvalgt til CSCS (klumpformet).
Figur 2. berigning til CSCS giver ikke-klæbende sphæroider. (A) SKOV3-celler ubehandlet og beriget for cscs (60X forstørrelse). (B) SKOV3-RFP celler, som er ubehandlede (a og b) eller beriget for cscs (c d). Venstre paneler skildrer fasekontrast billeder og højre paneler skildrer fluorescens. Oprindelig forstørrelse 40X. Scale bar = 400 mikrometer.
Figur 3. cscs udviser øget kemoterapiresistens sammenlignet med ubehandlede cellelinier. SKOV3 (A og B) og SKOV3-RFP (C og D), SKOV3 cscs (A og B) og SKOV3-RFP cscs (C og D), blev behandlet med forskellige koncentrationer af cisplatin (A og C) eller paclitaxel (Taxol) (B og D). 96 timer efter behandling MTT-assayet blev udført. Eksperimenter blev udført i n≥3 og statistik blev beregnet ved hjælp af to Way ANOVA; * P <0,05, *** p < ;. 0,0005 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Spindel cellemarkør ekspression i cscs sammenlignet med ubehandlede celler. QRT-PCR-analyse blev udført for SKOV3 (kontrol) og SKOV3 cscs. (A) CD133 (Prom1), Nestin, Nanog, og Oct4 (normaliseret til GAPDH). ( b) et yderligere eksperiment viser, at de SKOV3-RFP CSCS fremstillet af denne protokol udbytte celler med forhøjet Oct4 og Nanog sammenlignet med ubehandlede celler. Resultaterne blev normaliseret med GAPDH udtryk. N = 3 og statistik blev beregnet ved hjælp af de studerende t-test; ** P <0,02, *** p <0,002.
5 "fo: indhold-width =" 5in "src =" / filer / ftp_upload / 51891 / 51891fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 5. Flowcytometri Analyse af stamceller cellemarkører i SKOV3-celler og SKOV3 cscs alene eller transducerede eller uden RFP. CD133, CD117 og CD133 / CD117 ekspression i (A) SKOV3 (ubehandlet / kontrol) celler, (B) SKOV3 cscs, (C) SKOV3-RFP ubehandlede celler, og (D) SKOV3-RFP CSCS. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CSCS, der er resistente over for behandling, kan være ansvarlig for tilbagefald efter behandling af primær tumor. Karakterisering af CSCS kan føre til bedre behandlinger for kræft i æggestokkene. De kritiske parametre i etableringen af kemoresistent CSCS hjælp af ovenstående protokol er timing længden af behandling med kemoterapi og koncentrationen af kemoterapi. Ved brug af protokollen i Ma et al. det blev konstateret, at efter 7 dages behandling med cisplatin og paclitaxel, forblev ingen levedygtige celler 4. Ved at reducere behandlingen til 3 dage (med 20 pM cisplatin i stedet for 40 uM cisplatin og 10 uM paclitaxel), levedygtige kemoresistent celler og CSCS udvikles. Længden og dosis af behandlingen kan være nødvendigt at ændre til forskellige ovariekræft cellelinier.
Den største begrænsning af denne protokol er den længde, at den CSCS forbliver levedygtige. Ved hjælp af denne protokol, de CSCS forbliver levedygtige i mindre end en uge. Derfor the typer af eksperimenter og analyser af de CSCS skal nøje timet.
Yderligere karakterisering af cscs skal gennemføres. Det ville være nyttigt at sammenligne denne metode CSCS til andre metoder til CSC generation til at bestemme ligheden og forskellen mellem disse celletyper. Sammenligning af stamceller markører, respons på behandlingen, og bedste system til in vivo analyser skal gennemføres mellem forskellige metoder til at generere / udvælgelse af CSCS. Det er blevet foreslået, at der findes forskellige typer af CSCS med forskellige ekspressionsmønstre for stamceller markører og anderledes prognose for patienter 10-12, dermed yderligere definition af, hvad type CSCS genereres af denne protokol, kan hjælpe med at bestemme, hvordan de relaterer sig til menneskelig malignitet . Endelig, for at strengt påvise, at cscs isoleret fra denne protokol er en endelig cscs celler skal injiceres i immunkompromitterede mus en begrænsende fortynding assay. Detteassay demonstrerer, at cscs er i stand til at generere ovarietumorer ved en lav densitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy | Life Technologies | 16600-108 | Warm to 37 °C prior to use |
| DMEM / F12 serum free | Life Technologies | 11320-033 | Warm to 37 °C prior to use |
| Minimal Essential Media | Life Technologies | 42360032 | Warm to 37 °C prior to use |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Blasticidin | Life Technologies | R21001 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | T7402-5MG | Caution: Toxic. Use precautions |
| pLenti-suCMV-Rsv | Gentarget | LVP023 | BSL2 approval needed |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Human Recombinant EGF | Cell Signaling Technology | 8916LC | |
| bFGF | BD biosciences | 354060 | |
| LIF | Santa Cruz | sc-4988A | |
| Bovine Serum Albumin | Roche | 03 116 956 001 | |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| IQ Multiplex Powermix | BioRad | 1725849 | |
| Accumax | Millipore | ||
| Primers | Integrated DNA Technology | individually designed and ordered (see protocol for sequnces) | |
| Anti-CD133 PE | Milenyl | 130-098-826 | Primer/probe sets are light sensitive |
| CD117-Biotin | Miltenly | 130-098-570 | |
| AntiBiotin-FITC | Miltenly | 130-098-796 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh. |
| Trypsin | Life Technologies | 25300062 | |
| MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) | Sigma-Aldrich | 25200-072 | |
| EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope | Advanced Microscopy Group | ||
| Biorad CFX96 C1000 System | Biorad | ||
| Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Spectramax 340PC384 | Molecular Devices |
References
- Pennington, K., Pulaski, H., Pennington, M., Liu, J. R. Too Much of a Good Thing: Suicide Prevention Promotes Chemoresistance in Ovarian Carcinoma. Curr Cancer Drug Targets. 10, 575-583 (2010).
- Thigpen, T. A rational approach to the management of recurrent or persistent ovarian carcinoma. Clin Obstet Gynecol. 55, 114-130 (2012).
- Burgos-Ojeda, D., Rueda, B. R., Buckanovich, R. J. Ovarian cancer stem cell markers: prognostic and therapeutic implications. Cancer letters. 322, 1-7 (2012).
- Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42, 593-602 (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3, 730-737 (1997).
- Alison, M. R., Lim, S. M., Nicholson, L. J. Cancer stem cells: problems for therapy. The Journal of pathology. 223, 147-161 (2011).
- Luo, X., Dong, Z., Chen, Y., Yang, L., Lai, D. Enrichment of ovarian cancer stem-like cells is associated with epithelial to mesenchymal transition through an miRNA-activated AKT pathway. Cell proliferation. 46, 436-446 (2013).
- Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line. Molecular and cellular biochemistry. 363, 257-268 (2012).
- Abubaker, K., et al. Short-term single treatment of chemotherapy results in the enrichment of ovarian cancer stem cell-like cells leading to an increased tumor burden. Molecular cancer. 12, 24 (2013).
- Conic, I., Dimov, I., Tasic-Dimov, D., Djordjevic, B., Stefanovic, V. Ovarian epithelial cancer stem cells. ScientificWorldJournal. 11, 1243-1269 (2011).
- Liu, K. C., et al. Ovarian cancer stem-like cells show induced translineage-differentiation capacity and are suppressed by alkaline phosphatase inhibitor. Oncotarget. 4 (12), 2366-2382 (2013).
- Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncology reports. 23, 1277-1284 (2010).
