Protokollen har til formål at optimere konstruktionen og kvaliteten af væv microarrays til biomarkør forskning. Det omfatter aspekter af planlægning og design, digital patologi, virtuel dias kommentering, og automatiseret væv opstillingsindretningen.
Biomarkør forskning bygger på væv mikroarrays (TMA). TMA'erne produceres ved gentagen overførsel af små væv kerner fra en "donor" blokken i en "modtager" blok og derefter anvendes til en bred vifte af biomarkør applikationer. Opførelsen af konventionelle TMA'erne er arbejdskrævende, upræcise, og tidskrævende. Her er en protokol ved hjælp af næste generation Tissue Microarrays (ngTMA) skitseres. ngTMA er baseret på TMA planlægning og design, digital patologi og automatiseret væv microarraying. Protokollen er illustreret ved hjælp af et eksempel på 134 metastatiske kræftpatienter kolorektal. Histologiske, statistiske og logistiske aspekter i betragtning, såsom den vævstype, specifikke histologiske regioner og celletyper til optagelse i TMA, antallet af væv pletter, stikprøvestørrelse, statistisk analyse, og antallet af TMA eksemplarer. Histologiske dias for hver patient bliver scannet og uploadet på en web-baseret digital platform. Der er de ses og annotated (markeret) med en diameter på værktøj 0,6-2,0 mm, flere gange med forskellige farver til at skelne vævsområder. Donor blokke og 12 »modtager« blokke er indlæst i instrumentet. Digitale dias hentes og matches til donorblokken billeder. Gentagen opstillingsindretningen af kommenterede regioner udføres automatisk resulterer i en ngTMA. I dette eksempel er seks ngTMAs planlagt indeholdende seks forskellige vævstyper / histologiske zoner. To eksemplarer af de ngTMAs ønskes. Tre til fire dias for hver patient scannes; 3 SCAN løber er nødvendig og udført natten. Alle objektglas kommenteret; forskellige farver bruges til at repræsentere de forskellige væv / zoner, nemlig tumor center, invasion foran, tumor / stroma, lymfeknudemetastaser, levermetastaser, og normalt væv. 17 anmærkninger / tilfælde er lavet; tid til anmærkning 2-3 min / sag. 12 ngTMAs produceres indeholdende 4.556 pletter. Gruppering tid er 15-20 timer. På grund af sin præcision, fleksibilitet og hastighed, ngTMA er en kraftfuldredskab til yderligere at forbedre kvaliteten af TMA'erne anvendes i klinisk og translationel forskning.
I løbet af de sidste to årtier, har væv mikroarrays (TMAS) havde en bemærkelsesværdig indflydelse på biomarkør efterforskning undersøgelser. TMA'erne er hovedsagelig væv "arkiver" fremstillet ved gentagen overførsel af små væv kerner, typisk varierer i størrelse fra 0,6 til 2,0 mm i diameter, fra paraffin indlejret "donor" blokke i en enkelt TMA »modtager« blok (Figur 1) 1. Ved hjælp af en lille kerne størrelse, kan cirka 500 forskellige væv pletter fra få eller mange forskellige patienter grupperes i en TMA 2.
Brugen af TMA'erne for prognostiske eller prædiktive biomarkør studier har mange fordele. Betragt eksemplet, hvor ekspression af et protein biomarkør ved immunhistokemi skal evalueres på 450 patienter. Snarere end at udføre 450 immunhistokemiske pletter på 450 patient objektglas sektionerede fra det samme antal blokke, kan små kerner fra hver prøve grupperes på en enkelt TMA blok. Selv om flere kerner er taget fra hver enkelt patient, fremstilles et minimum antal af blokke. Dette har den store effekt på drastisk faldende omkostninger og andre ressourcer samt reducere vævsspild. Derudover dette tillader passende drevne undersøgelser under anvendelse af en lang række væv, der skal vurderes under de samme eksperimentelle betingelser.
TMA'erne har mange forskellige anvendelser. For eksempel kan de anvendes til at undersøge morfologien proteinekspression, RNA-ekspression og DNA aberrationer efter farvning med forskellige farvestoffer eller efter immunhistokemi eller kromogen og endda fluorescens in situ hybridisering 3-7. Nylige undersøgelser har også brugt TMA'erne at teste intra og interkalibrering variation i farvningsprotokoller etablere specificitet eller sensitivitet af antistoffer til specifikke genmutationer, og at bestemme interobserver reproducerbarhed af protein udtryk i internationale samarbejder <sup> 8-11.
Opførelsen af traditionelle TMA'erne hjælp patient-deriverede væv er en lang multi trin procedure (figur 2). Det begynder med en søgning efter mulige relevante tilfælde og udvælgelse af diagnostiske slides fra arkiverne på et institut for patologi, eller andet institut, hvorfra de skal hentes. Patologen evaluerer hvert dias pr sag og vælger den mest repræsentative dias i forbindelse med undersøgelsen. Dernæst regionen af interesse markeret ved hjælp af en pen direkte under mikroskop. Dette er ofte udfordrende og upræcise og resulterer kun i en "vurdering" af hvor væv slag skal tages fra. Næste hentes, paraffinblokkene svarer til disse markerede dias fra arkivet. En hurtig sammenligning mellem blok og slide er lavet. Ved hjælp af en semi-automatiseret eller hjemmelavet væv arrayer er donorblokken udstanset i det anslåede område af interesse og overføres til en modtager TMA blok. Konstruktion af TMA'erne bruge denne Opstillingsindretningen teknik er arbejdskrævende, tidskrævende, upræcise og ufleksible. Forberedelse af en TMA af 475 pladser i 3 eksemplarer skønnes at tage omkring 84 timers arbejde.
En ny tilgang til opførelsen af TMA'erne nylig blev indført ved Patologisk Institut, University of Bern, der bygger på tre elementer: planlægning og design (eller rådgivning), digital patologi kombineret med ekspertise i histologi og automatiseret TMA arraying 12. Tilsammen er dette koncept kaldet næste generation Tissue Microarray (ngTMA). Nedenfor er en protokol til ngTMA beskrives ud fra et eksempel med 134 patienter med metastatisk kolorektal cancer. Her primære tumorer samt lymfeknudemetastaser og levermetastaser skal klædt i ngTMAs til efterfølgende biomarkør analyse. Derudover er små væv kerner fra hver patient ønskes til fremtidig nukleinsyre ekstraktion.
I dette papir, er en protokol til ngTMA skitseret. ngTMA er et nyetableret koncept for væv microarraying involverer planlægning og design, digital patologi og dias kommentering samt automatiseret væv microarraying 12.
Sammenlignet med konventionel væv microarraying, ngTMA byder på mange fordele. I et første trin, planlægning og projektering fase er kritisk. Der er fokus på at besvare en målrettet forskning spørgsmål. Dette bør tage hensyn til de histologiske emner (f.eks, hvilke regioner og hvor mange pletter ønsker jeg at indeholde?), Den statistiske planlægning (f.eks prøve størrelse? Hvordan kan jeg analyserer mine prøver senere?) Og logistiske overvejelser (fx hvordan mange biomarkører og dermed hvor mange ngTMA kopier?). Et specifikt ngTMA er lavet til specifikke behov, uanset om det er for biomarkør screening og højt gennemløb eller beregnet til at undersøge specifikke histologiske aspekter på kun få godt valgt cases.
En, hvis ikke den vigtigst ulempe ved konventionel væv microarraying er den lave nøjagtighed, hvormed markeringer på de histologiske rutschebaner fremstilles. Studiet af specifikke histologiske strukturer, celler eller områder gøres næsten umuligt. ngTMA muliggør høj nøjagtighed fordi anmærkninger placeres direkte på de digitale dias. Dette gør det muligt for forskeren at netop vælge de regioner, der kan stanses, herunder særlige celler. I dette eksempel er forskellige områder inden for samme vævsblok udstanset til gruppering, såsom tumor centrum, invasionen foran og områder af tumor / stroma interaktion fremhævet af tilstedeværelsen af små tumor celleklynger eller endda enkelte celler. Denne nøjagtighed kan kun opnås ved hjælp af ngTMA. For det tredje fordi dias scannes på en web-baseret digital platform, glide visning og indsætning af kommentarer kan ske via computeren end med mikroskopet. Vævet opstillingsindretningen software giver en brugervenliggrænseflade med en høj grad af fleksibilitet, således forskellige layouts og design ngTMA kan opnås. Da TMA konstruktion udføres automatisk ved boring, er der ikke meget behov for hands-on manøvrering og mængden af tid til byggeri er reduceret betydeligt. Tiden for TMA byggeri i dette eksempel her er mellem 24 timer. Ved hjælp af en konventionel TMA tilgang og estimering 15 slag per time, ville dette projekt tage cirka 304 timer.
ngTMA kan anvendes til at studere protein-ekspression mRNA eller DNA såvel som kombinationer af disse. Figur 9 viser flere af disse ansøgninger til potentielle biomarkører. Standard immunhistokemi kan anvendes til at bestemme proliferationsindeks af cancere under anvendelse af Ki-67. Kan anvendes en kombineret tilgang til at undersøge protein-ekspression og DNA forstærkning for gener, såsom HER2. Væv kan samles på en enkelt ngTMA at reducere omkostningerne, brug væv og andre ressourcepersonersek. Desuden kan kromogent mRNA in situ-hybridisering til HER2, og andre gener udføres for at identificere en enkelt mRNA-transkripter i en lang række tilfælde anvender et minimalt antal væv lysbilleder. Immunhistokemi immune markører, såsom CD8 kan visualiseres i forbindelse tumormikromiljøet. Dobbelt immunhistokemi kan også bruges til at fremhæve bestemte områder af interesse såsom samspillet mellem immunceller (mærket med rødt) og tumorceller (mærket i brun) ved invasionen forsiden af kræft. En sådan et område af interesse kunne ikke være blevet taget med konventionel væv microarraying.
Ikke desto mindre denne protokol indeholder nogle begrænsninger. Den vigtigste udfordring er overlapningen mellem donor blok og digital dias. Adskillige faktorer kan påvirke dette trin. For det første bør der anvendes den nyeste afsnit fra blokken for dias scanning. I mange tilfælde, H & E er ikke den sidste sektion af donorblokken rather er en immunhistokemisk eller anden farve. I dette tilfælde også en farvede objektglas kan anvendes, så længe den sidste pletten scannes og kommenteret eller en ny H & E skal foretages. Man skal også træffes, når vævssnit bliver lavet som væv, kan ekspandere i vandbad, som fører til udfordrende matchning af dias og blok. For det andet, i øjeblikket projekter er begrænset til 12 modtagerlande TMA blokke behandles på en enkelt gang. Større projekter, der overstiger 12 TMA'erne skal overdrages til et andet projekt navn. For det tredje skal donorblokkene gøres ved hjælp af faste forme og kassetter som instrumentet kan ikke tilpasse sig til forskellige størrelser. Endelig skal donorblokke overstige den minimale højde (4 mm) for at opnå optimal boring. I nogle tilfælde kræver dette reembedding af væv.
Hundredvis af publikationer i de sidste par år, fremhæver TMA som et uvurderligt værktøj for biomarkør forskning. TMA'erne er blevet brugt til at studere lunge 13, kolorektal 7 breast 14, prostata 15, bugspytkirtel 16, blære 17, og gastriske 18 cancer, for at nævne et par stykker. Et stigende antal forfattere har kombineret brugen af TMA'erne med billedanalyse og betydelige fremskridt der gøres i denne retning 19-21. Men ved siden af en håndfuld af forskergrupper, der har offentliggjort innovative TMA idéer 22-24, lidt opmærksomhed er givet til at optimere TMA teknikken selv. Automatiserede væv microarrayers såsom ATA-27 ved Estigen / Beecher gør giver layout design og hensigtsmæssigt og automatiseret væv stansning. Dette udgør dog kun 1 aspekt af ngTMA konceptet.
ngTMA er en væsentlig forbedring i forhold til konventionelle væv microarraying teknikker. Det inkorporerer ekspertise i histologi og design TMA med fleksibiliteten i digital patologi og præcision af digitale anmærkninger med den hastighed og pålidelighed af automatiserede TMA konstruktion. Kombinationen af ngTMA og billedanalyse til evaluering af protein og molekylære biomarkører vil være et effektivt redskab til yderligere at forbedre kvaliteten af den kliniske og translationel forskning i fremtiden.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke teknisk personale af Translationel Research Unit; Mary Economou José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni og Informatik Team på Patologisk Institut, University of Bern.
Pannoramic 250 Flash II | 3DHistech | Slide scanner | |
TMA Grandmaster | 3DHistech | Tissue Microarrayer | |
Pannoramic Viewer | 3DHistech | free | Slide viewing software |
Case Center | 3DHistech | Digital slide platform |