Il protocollo mira a ottimizzare la costruzione e la qualità del tissue microarrays per la ricerca biomarker. Esso comprende aspetti di pianificazione e progettazione, patologia digitale, l'annotazione diapositiva virtuale, e arraying tessuti automatizzato.
La ricerca di biomarker si basa su microarray tissutali (TMA). TMA sono prodotte da ripetute trasferimento di piccoli nuclei di tessuto da un blocco 'donatore' in un blocco 'destinatario' e poi utilizzato per una varietà di applicazioni biomarker. La costruzione di TMA convenzionale è alta intensità di manodopera, impreciso, e che richiede tempo. Qui, un protocollo utilizzando microarray di tessuti di nuova generazione (ngTMA) è delineato. ngTMA si basa su TMA pianificazione e progettazione, patologia digitale, e microarraying tessuti automatizzato. Il protocollo è illustrato con un esempio di 134 pazienti affetti da cancro colorettale metastatico. Aspetti istologici, statistici e logistiche sono considerati, ad esempio il tipo di tessuto, specifiche regioni istologiche, e tipi di cellule per l'inclusione nella TMA, il numero di macchie di tessuto, dimensione del campione, analisi statistica, e il numero di copie TMA. Vetrini istologici per ogni paziente vengono scansionati e caricati su una piattaforma digitale basata sul web. Lì, vengono visualizzati e annotated (marcato) utilizzando uno strumento di diametro 0,6-2,0 mm, più volte utilizzando diversi colori per distinguere le zone di tessuto. Blocchi donatori e 12 blocchi 'beneficiarie vengono caricati nello strumento. Diapositive digitali sono recuperati e abbinati alle immagini di blocco donatore. Arraying ripetuta delle regioni annotati viene automaticamente eseguita traduce in un ngTMA. In questo esempio, sei ngTMAs sono previsti contenente sei differenti tipi di tessuto / zone istologici. Due copie dei ngTMAs sono desiderati. Da tre a quattro diapositive per ogni paziente vengono controllati; 3 piste di scansione sono necessari ed eseguito durante la notte. Tutti i vetrini sono annotati; diversi colori sono utilizzati per rappresentare i diversi tessuti / zone, vale a dire il centro del tumore, invasione anteriore, tumore / stroma, metastasi linfonodali, metastasi epatiche, e tessuto normale. 17 annotazioni / caso sono fatti; tempo per l'annotazione è di 2-3 min / caso. 12 ngTMAs sono prodotti contenente 4556 punti. Tempo arraying è di 15-20 ore. Grazie alla sua precisione, flessibilità e velocità, ngTMA è un potentestrumento per migliorare ulteriormente la qualità del TMA utilizzato nella ricerca clinica e traslazionale.
Negli ultimi due decenni, microarrays tissutali (TMA) hanno avuto un impatto notevole sugli studi di indagine biomarker. TMA sono essenzialmente di tessuto "archivi" prodotti dalla cessione ripetuta di piccoli nuclei di tessuto, di solito variano nel formato 0,6-2,0 mm di diametro, dalla paraffina blocchi 'donatori' in un unico blocco TMA 'destinatario' (Figura 1) 1. Utilizzando una piccola dimensione nucleo, circa 500 punti diversi di tessuto da pochi o molti pazienti diversi possono essere disposte in una TMA 2.
L'uso di TMA per gli studi di biomarcatori prognostici o predittivi ha molti vantaggi. Si consideri l'esempio in cui l'espressione di un biomarcatore della proteina mediante immunoistochimica deve essere valutata in 450 pazienti. Invece di eseguire 450 colorazioni immunoistochimiche su 450 diapositive paziente sezionati dallo stesso numero di blocchi, piccoli nuclei di ciascun campione possono essere disposte su un unico TBlocco MA. Anche se più core sono presi da ogni singolo paziente, un numero minimo di blocchi sono prodotti. Questo ha l'effetto considerevole di diminuire drasticamente i costi e le altre risorse oltre a ridurre spreco di tessuto. Studi Inoltre questo permette opportunamente alimentato utilizzando un gran numero di tessuti da valutare nelle stesse condizioni sperimentali.
TMA ha molte applicazioni diverse. Ad esempio, possono essere utilizzati per studiare la morfologia, l'espressione della proteina, l'espressione di RNA e DNA aberrazioni seguenti colorazione con diversi coloranti o dopo immunoistochimica o cromogenico e addirittura ibridazione in situ fluorescente 3-7. Recenti studi hanno utilizzato anche TMA per testare variazione intra e interlaboratorio in protocolli di colorazione, stabilire la specificità o la sensibilità degli anticorpi per mutazioni genetiche specifiche, e per determinare la riproducibilità inter di espressione della proteina in collaborazioni internazionali <sup> 8-11.
La costruzione del tradizionale TMA utilizzando tessuti di derivazione paziente è una lunga procedura in più fasi (Figura 2). Si inizia con la ricerca di possibili casi opportuni e selezione di diapositive diagnostici provenienti dagli archivi presso un istituto di patologia, o di altro istituto, da dove vengono recuperati. Il patologo valuta ogni diapositiva per caso e seleziona la diapositiva più rappresentativo ai fini dello studio. Successivamente, la regione di interesse è contrassegnato con una penna direttamente sotto il microscopio. Questo è spesso difficile e imprecisa e si traduce solo in una "stima" di cui punzoni di tessuto devono essere prelevati da. Successivamente, i blocchi di paraffina corrispondenti a queste diapositive contrassegnate vengono recuperati dall'archivio. Un rapido confronto tra il blocco e la slitta è fatta. Utilizzando un Arrayer tessuto semi-automatico o fatti in casa, il blocco donatore è perforato nella regione stimata di interesse e trasferito in un blocco TMA destinatario. Costruzione di TMA utilizzando questa tecnica arraying è alta intensità di lavoro, che richiede tempo, impreciso, e inflessibile. Preparazione di una TMA di 475 punti in 3 copie è stimato a prendere circa 84 ore di lavoro.
Un nuovo approccio alla costruzione di TMA è stato recentemente introdotto dall'Istituto di Patologia, Università di Berna, che si basa su tre componenti: la pianificazione e la progettazione (o di consulenza), patologia digitale combinata con competenze in istologia e automatizzato TMA arraying 12. Insieme, questo concetto è chiamato prossima generazione di Tissue Microarray (ngTMA). Qui di seguito, un protocollo per ngTMA è descritto sulla base di un esempio di 134 pazienti con carcinoma colorettale metastatico. Qui, i tumori primari e metastasi linfonodali e metastasi epatiche devono essere schierati in ngTMAs per la successiva analisi dei biomarcatori. Inoltre, i piccoli nuclei di tessuto da ogni paziente si desiderano per il futuro estrazione degli acidi nucleici.
In questo lavoro, un protocollo per ngTMA è delineato. ngTMA è un concetto di nuova costituzione per microarraying tessuto che coinvolge pianificazione e progettazione, patologia digitale e presentazione di annotazione nonché automatizzata dei tessuti microarraying 12.
Rispetto alla microarraying tessuto convenzionale, ngTMA offre molti vantaggi. In una prima fase, la fase di programmazione e progettazione è critica. L'obiettivo è quello di rispondere a una domanda di ricerca mirata. Questo dovrebbe prendere in considerazione le questioni istologiche (per esempio, che le regioni e quanti punti posso desidera includere?), La pianificazione statistica (ad esempio, la dimensione del campione? Come analizzo i miei campioni più tardi?) E le considerazioni logistiche (ad esempio, come molti biomarcatori e quindi il numero di copie ngTMA?). Una specifica ngTMA è fatto per specifiche esigenze, sia che si tratti per lo screening biomarker e high-throughput o destinato a studiare specifici aspetti istologici su pochi cas ben selezionataes.
Uno, se non il, più importante svantaggio di microarraying tessuto tradizionale è la bassa precisione con cui sono fatte le marcature sui vetrini istologici. Lo studio di specifiche strutture istologiche, cellule o regioni è fatto quasi impossibile. ngTMA permette per alta precisione, perché le annotazioni vengono inseriti direttamente nelle diapositive digitali. Questo permette al ricercatore di selezionare con precisione le regioni da pugni, comprese le cellule specifiche. In questo esempio, varie zone all'interno dello stesso blocco di tessuto vengono perforati per arraying, come il centro del tumore, l'invasione anteriore e aree di interazione tumore / stroma evidenziato dalla presenza di piccoli gruppi di cellule tumorali o anche singole cellule. Questa precisione può essere raggiunto solo utilizzando ngTMA. In terzo luogo, perché le diapositive vengono sottoposti a scansione su una piattaforma digitale basata sul web, far scorrere la visualizzazione e l'annotazione può essere fatta attraverso il computer, piuttosto che con il microscopio. Il software arraying tessuto fornisce un facile da usareInterfaccia con un elevato grado di flessibilità, layout dunque diversi e design ngTMA può essere raggiunto. Poiché TMA costruzione viene eseguita automaticamente da perforazione, c'è poca necessità di hands-on manovra e la quantità di tempo per la costruzione è notevolmente ridotto. Il tempo per TMA costruzione in questo esempio è tra 24 ore. Utilizzando un approccio convenzionale TMA e la stima di 15 punzoni per ora, questo progetto avrebbe preso circa 304 ore.
ngTMA può essere applicato per studiare l'espressione della proteina, DNA o mRNA così come combinazioni di questi. Figura 9 illustra alcune di queste applicazioni potenziali biomarker. Immunoistochimica standard può essere applicato per determinare l'indice di proliferazione dei tumori mediante Ki-67. Un approccio combinato di indagare l'espressione proteica e l'amplificazione del DNA per i geni, come HER2 può essere utilizzato. I tessuti possono essere riuniti in un unico ngTMA per ridurre i costi, l'utilizzo dei tessuti e di altre risorses. Inoltre, mRNA ibridazione in situ per HER2 e altri geni può essere eseguita per identificare singoli mRNA trascritti in un gran numero di casi utilizzando un numero minimo di vetrini di tessuto. L'immunoistochimica di marcatori immunitari quali CD8 possono essere visualizzati nel contesto del microambiente tumorale. Doppia immunoistochimica può essere utilizzato anche per evidenziare particolari regioni di interesse come le interazioni tra cellule immunitarie (marcata in rosso) e le cellule tumorali marcate (in marrone) nella parte anteriore all'invasione dei tumori. Tale regione di interesse non avrebbe potuto essere catturato utilizzando microarraying tessuti convenzionali.
Tuttavia, questo protocollo contiene alcune limitazioni. La sfida più importante è la sovrapposizione tra il blocco donatore e diapositiva digitale. Diversi fattori possono influenzare questo passo. In primo luogo, l'ultima sezione dal blocco deve essere utilizzato per la scansione di diapositive. In molti casi, la H & E non è l'ultima sezione del blocco donatore, Rather è un immunoistochimica o altro macchia. In questo caso, anche un vetrino colorato può essere utilizzato fino a quando l'ultima macchia viene sottoposto a scansione e annotato o un nuovo H & E dovrebbe essere fatto. Si deve anche essere presa quando sezioni di tessuto sono stati fatti come i tessuti possono espandersi in bagno d'acqua che conduce alla corrispondenza impegnativo di scorrimento e blocco. In secondo luogo, al momento i progetti sono limitati a 12 destinatari TMA blocchi elaborati in una sola volta. Progetti più grandi che superano 12 TMA devono essere assegnati a un secondo nome di progetto. In terzo luogo, i blocchi donatori devono essere realizzati con stampi standard e cassette come lo strumento non si può regolare di varie dimensioni. Infine, blocchi donatori devono superare l'altezza minima (4 mm) per ottenere la foratura ottimale. In alcuni casi, questo richiede reembedding di tessuti.
Centinaia di pubblicazioni nel corso degli ultimi anni evidenziano la TMA come uno strumento prezioso per la ricerca di biomarcatori. TMA sono stati utilizzati per lo studio del polmone 13, del colon-retto 7, breast 14, 15 della prostata, del pancreas 16, della vescica 17, e 18 tumori gastrici, per citarne alcuni. Un numero crescente di autori ha combinato l'uso di TMA con analisi di immagine e significativi passi in avanti sono stati fatti in questa direzione 19-21. Tuttavia, accanto a una manciata di gruppi di ricerca che hanno pubblicato le idee innovative TMA 22-24, poca attenzione è stata data per ottimizzare la tecnica TMA stesso. Microarrayers tessuto automatizzati, come ad esempio l'ATA-27 da Estigen / Beecher forniscono progettazione del layout e opportuno e automatizzato punzonatura dei tessuti. Questo rappresenta però solo 1 aspetto del concetto ngTMA.
ngTMA è un sostanziale miglioramento rispetto alle tecniche microarraying tessuti convenzionali. Incorpora esperienza in istologia e design TMA con la flessibilità di patologia digitale e la precisione di annotazioni digitali con la velocità e l'affidabilità di costruzione automatizzata TMA. La combinazione di ngTMA e analisi di immagine per la valutazione di proteine e biomarcatori molecolari sarà un potente strumento per migliorare ulteriormente la qualità della ricerca clinica e traslazionale in futuro.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare il personale tecnico dell'Unità di Ricerca Traslazionale; Maria Economou, José Galván, Caroline Martello, Dominique Müller, Liliane Schöni e il Team Informatica presso l'Istituto di Patologia, Università di Berna.
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