Das Protokoll zielt auf die Optimierung der Konstruktion und Qualität der Gewebe-Mikroarrays für Biomarker-Forschung. Es umfasst Aspekte der Planung und Design, digitale Pathologie, virtuellen Schiebe Anmerkungen und automatisierte Gewebeanordnungs.
Biomarker-Forschung setzt auf Tissue Microarrays (TMA). TMA durch wiederholte Übertragung von kleinen Gewebekernen aus einem "Spender"-Block in eine "Empfänger"-Block erzeugt und dann für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet Biomarker. Die Konstruktion von herkömmlichen TMA ist arbeitsintensiv, ungenau und zeitaufwendig. Hier wird ein Protokoll mit der nächsten Generation Tissue Microarrays (ngTMA) skizziert. ngTMA auf TMA Planung und Design, digitale Pathologie und automatisierte Gewebemikroarray-basierte. Das Protokoll wird am Beispiel von 134 Patienten mit metastasiertem Kolorektalkarzinom dargestellt. Histologischen, statistische und logistische Aspekte berücksichtigt werden, wie der Gewebetyp, spezifische histologische Regionen und Zelltypen für die Aufnahme in der TMA die Anzahl von Gewebeflecken, Probengröße, statistische Analyse, die Anzahl der Kopien TMA. Histologischen Präparaten für jeden Patienten abgetastet und auf einem Web-basierten digitalen Plattform hochgeladen. Dort werden sie angezeigt und annotated (markiert) mit einem 0,6-2,0 mm Durchmesser Werkzeug, mehrere Male mit verschiedenen Farben, um Gewebebereiche zu unterscheiden. Spenderblöcke und 12 "Empfänger"-Blöcke in das Gerät geladen. Digitale Folien werden abgerufen und an Spenderblock Bilder abgestimmt. Wiederholt Anordnungs von kommentierten Regionen wird automatisch durchgeführt, was zu einer ngTMA. In diesem Beispiel sind sechs ngTMAs geplant, die sechs verschiedenen Gewebetypen / histologische Zonen. Zwei Kopien der ngTMAs sind erwünscht. Drei bis vier Schieber für jeden Patienten abgetastet werden; 3 Scan-Durchläufe nötig sind und über Nacht durchgeführt. Alle Folien sind kommentiert; verschiedenen Farben werden verwendet, um die verschiedenen Gewebe / Zonen, nämlich Tumorzentrum, Invasionsfront, Tumor / Stroma, Lymphknotenmetastasen, Lebermetastasen und Normalgewebe darstellen. 17 Anmerkungen / Fall gemacht werden; Zeit für Annotation 2-3 min / Fall. 12 ngTMAs sind enthalten 4.556 Spots produziert. Anordnen Zeit ist 15-20 Stunden. Aufgrund seiner Präzision, Flexibilität und Geschwindigkeit, ist ein leistungsfähiges ngTMAWerkzeug, um die Qualität der TMAs weiter zu verbessern in der klinischen und translationalen Forschung.
In den letzten zwei Jahrzehnten haben Tissue Microarrays (TMA) einen bemerkenswerten Einfluss auf die Biomarker-Untersuchung Studien hatten. TMAs sind im wesentlichen Gewebe "Archive" durch die wiederholte Übertragung von kleinen Gewebekerne, in der Regel in einer Größe von 0,6 bis 2,0 mm Durchmesser hergestellt, aus Paraffin eingebettet "Spender"-Blöcke in einem einzigen TMA "Empfänger"-Block (Abbildung 1) 1. Mit einem kleinen Kerngröße, können etwa 500 verschiedene Gewebeflecken aus wenige oder viele verschiedene Patienten in einen TMA 2 angeordnet werden.
Die Verwendung von TMA für prognostische oder prädiktive Biomarkerstudien hat viele Vorteile. Man betrachte das Beispiel, wo die Expression eines Proteins Biomarker durch Immunhistochemie ist an 450 Patienten ausgewertet. Anstatt der Durchführung 450 immunhistochemische Färbungen auf 450 Patienten Folien aus der gleichen Anzahl von Blöcken unterteilt, können kleine Kerne von jeder Probe auf einem einzigen T angeordnet werden,MA-Block. Auch wenn mehrere Kerne werden von jedem einzelnen Patienten entnommen werden eine minimale Anzahl von Blöcken erzeugt. Das hat den erheblichen Einfluss von Kosten und anderen Ressourcen drastisch abnehm sowie die Verringerung Gewebe Verschwendung. Zusätzlich ermöglicht dies angemessen versorgt Studien unter Verwendung einer großen Anzahl von Geweben unter den gleichen experimentellen Bedingungen ausgewertet werden.
TMAs haben viele verschiedene Anwendungen. Zum Beispiel können sie verwendet werden, um die Morphologie, Proteinexpression, RNA-Expression und DNA-Aberrationen folgenden Färbung mit verschiedenen Farbstoffen zu untersuchen, oder nach Immunhistochemie oder chromogene und selbst Fluoreszenz in situ Hybridisierung 3-7. Jüngste Studien haben auch den inner TMAs und Ring Variation in Färbeprotokollen testen, stellen Spezifität oder Sensitivität von Antikörpern für bestimmte Gen-Mutationen und die Interobserver Reproduzierbarkeit der Proteinexpression in internationalen Kooperationen bestimmen <sup> 8-11.
Der Bau der traditionellen TMAs mit Patienten stammenden Gewebe ist eine lange Mehrschritt-Verfahren (Abbildung 2). Es beginnt mit der Suche nach möglichen geeigneten Fällen und Auswahl von Diagnose Dias aus dem Archiv in einem Institut für Pathologie, oder andere Institut, von wo sie abgerufen werden. Der Pathologe beurteilt die Folie pro Fall und wählt die Vertreter Rutsche für die Zwecke der Studie. Als nächstes wird der interessierende Bereich mit einem Stift unter dem Mikroskop direkt markiert. Dies ist oft schwierig und ungenau und führt nur zu einer "Schätzung", wo Gewebe Schläge vorgenommen werden soll. Danach werden die Paraffinblöcke entsprechend dieser markierten Folien aus dem Archiv abgerufen. Ein schneller Vergleich zwischen Block und Schieber gemacht. Mit einer halbautomatischen oder hausgemachte Gewebe Arrayer wird die Spenderblock im Kostenvoran Region von Interesse ausgestanzt und in einen Empfänger TMA Block übertragen. Konstruktion von TMA mit diesen Anordnungsverfahren ist arbeitsintensiv, zeitaufwendig, ungenau und unflexibel. Vorbereiten einer TMA von 475 Stellen in 3 Kopien wird auf etwa 84 Stunden Arbeit.
Planung und Design (oder Beratung), die digitale Pathologie kombiniert mit Know-how in der Histologie und automatisierte TMA Anordnen 12: Ein neuer Ansatz für den Bau von TMA wurde kürzlich durch das Institut für Pathologie der Universität Bern, die auf drei Komponenten beruht eingeführt. Gemeinsam wird dieses Konzept genannt nächste Generation Tissue Microarray (ngTMA). Im Folgenden wird ein Protokoll für ngTMA basierend auf dem Beispiel der 134 Patienten mit metastasiertem kolorektalem Karzinom beschrieben. Hier Primärtumoren sowie Lymphknotenmetastasen und Lebermetastasen sind in ngTMAs für nachfolgende Biomarker-Analyse angeordnet werden. Zusätzlich werden kleine Gewebekerne von jedem Patienten für zukünftige Nukleinsäureextraktion gewünscht.
In diesem Beitrag wird ein Protokoll für ngTMA beschrieben. ngTMA ist ein neu etabliertes Konzept zur Gewebemikroarray mit Planung und Design, digitale Pathologie und Dia-Annotation sowie automatisierte Gewebemikroarray-12.
Im Vergleich zu herkömmlichen Gewebemikroarray bietet ngTMA viele Vorteile. In einem ersten Schritt wird die Projektierungsphase kritisch. Der Schwerpunkt liegt auf der Beantwortung einer gezielten Fragestellung. Dies sollte berücksichtigt werden die histologischen Fragen (zB, welche Regionen und wie viele Flecken will ich gehören?), Die statistische Planung (zB Stichprobengröße? Wie kann ich meine Proben später zu analysieren?) Und logistische Überlegungen (zB wie viele Biomarker und daher, wie viele Kopien ngTMA?). Eine spezifische ngTMA wird für die spezifischen Bedürfnisse gemacht, ob es für Biomarker-Screening und High-Throughput-oder, um spezifische histologische Aspekte nur auf ein paar gut ausgewählte cas studierenES.
Eine, wenn nicht die, am wichtigsten Nachteil herkömmlicher Gewebemikroarray die geringe Genauigkeit, mit der Markierungen auf den histologischen Objektträgern hergestellt werden. Die histologische Untersuchung spezifischer Strukturen, Zellen oder Bereiche nahezu unmöglich gemacht. ngTMA ermöglicht hohe Genauigkeit, da Anmerkungen direkt auf den digitalen Objektträger platziert. Dies ermöglicht dem Forscher, genau Wählen Sie die Regionen gestanzt werden, einschließlich spezifischer Zellen. In diesem Beispiel sind die verschiedenen Bereiche innerhalb des gleichen Gewebeblock aus zum Ordnen tanzt, wie die Tumorzentrum der Invasionsfront und Bereiche der Tumor / Stroma-Wechselwirkung durch das Vorhandensein von kleinen Tumorzellhaufen oder sogar einzelne Zellen markiert. Diese Genauigkeit kann nur mit ngTMA erreicht werden. Drittens, weil Objektträger werden auf einem Web-basierten digitalen Plattform abgetastet gleiten Ansicht und Kommentierung durch den Computer nicht mit dem Mikroskop durchgeführt werden. Das Gewebe Anordnungs Software bietet eine benutzerfreundlicheSchnittstelle mit einem hohen Grad an Flexibilität und damit verschiedene Layouts und ngTMA Design erreicht werden kann. Da TMA Aufbau wird automatisch durch Bohren durchgeführt wird, gibt es wenig Notwendigkeit für praktische Manövrieren und die Zeit für die Konstruktion erheblich reduziert. Die Zeit für die TMA Bau in diesem Beispiel ist hier zwischen 24 Stunden. Bei Verwendung eines herkömmlichen TMA Ansatz und Schätzen 15 Schläge pro Stunde, wäre dieses Projekt etwa 304 Stunden zu nehmen.
ngTMA kann angewendet werden, um Protein-Expression, mRNA oder DNA sowie Kombinationen davon zu untersuchen. 9 veranschaulicht einige dieser Anwendungen potentielle Biomarker. Standard Immunhistochemie angewendet werden, um die Verbreitung von Krebserkrankungen unter Verwendung von Index Ki-67 zu bestimmen. Ein kombinierter Ansatz zur Proteinexpression und DNA-Amplifikation für Gene wie HER2 Untersuchung verwendet werden. Gewebe können auf einem einzigen ngTMA versammelt, um Kosten, Auslastung und anderen Gewebe Ressource zu verringerns. Zusätzlich können chromogene mRNA in situ Hybridisierung für HER2 und andere Gene durchgeführt werden, um einzelne mRNA-Transkripte in einer Vielzahl von Fällen unter Verwendung einer minimalen Anzahl von Gewebeschnitten zu identifizieren. Immunhistochemie von Immunmarker, wie CD8 können im Rahmen der Tumormikroumgebung dargestellt werden. Doppel Immunhistochemie kann auch verwendet werden, wie Interaktionen zwischen Immunzellen (rot markiert) und Tumorzellen (in braun markiert) an der Invasionsfront von Krebs auf bestimmte Bereiche von Interesse zu markieren. Solch ein Bereich von Interesse nicht unter Verwendung herkömmlicher Gewebemikroarray erfasst haben.
Dennoch enthält diese Protokoll einige Einschränkungen. Die wichtigste Herausforderung ist die Überlappung zwischen Donor-Block und digitale Dia. Mehrere Faktoren können diesen Schritt zu beeinflussen. Erstens sollte der letzte Abschnitt des Blocks für Dia Scannen verwendet werden. In vielen Fällen ist das H & E ist nicht der letzte Abschnitt des Spenderblocks, Käther ist es ein immunhistochemischen oder anderen Fleck. In diesem Fall wird auch ein gefärbtes Schieber verwendet werden, solange der letzte Fleck abgetastet und annotiert oder einer neuen H & E vorgenommen werden sollen. Vorsicht ist auch bei der Gewebeschnitte werden gemacht, wie Gewebe können im Wasserbad, die anspruchsvolle Anpassung der Rutsche und Block führt zu erweitern. Zweitens, im Moment Projekte bis 12 Empfänger TMA Blöcke auf einmal verarbeitet beschränkt. Größere Projekte von mehr als 12 TMAs muss zu einer zweiten Projektnamen zugeordnet werden. Drittens müssen die Spenderblöcke mit Standard-Formen und-Kassetten als das Instrument kann sich nicht auf verschiedene Größen einstellen werden. Schließlich müssen die Spenderblöcke minimale Höhe (4 mm), um eine optimale Bohrung erzielen überschreiten. In einigen Fällen erfordert dies Rückbettung von Geweben.
Hunderte von Publikationen in den letzten Jahren unterstreichen die TMA als ein unschätzbares Werkzeug für Biomarker-Forschung. TMAs wurden verwendet, um Lungen 13, kolorektalen 7, bre studierenAST 14, 15 Prostata, Pankreas 16, der Blase 17 und Magenkrebs 18, um nur einige zu nennen. Eine zunehmende Anzahl von Autoren haben die Verwendung von TMA mit Bildanalyse und bedeutende Schritte werden in dieser Richtung gemacht 19-21 zusammengefasst. Doch neben einer Handvoll von Forschungsgruppen, die innovative Ideen TMA 22-24 veröffentlicht haben, wenig Aufmerksamkeit gegeben worden, um die TMA-Technik selbst zu optimieren. Automatisierte Gewebe Microarrayer, wie der ATA-27 um Estigen / Beecher tun geben Layout-Design und zweckmäßige und automatisierte Gewebe Stanzen. Dies stellt jedoch nur ein Aspekt der ngTMA Konzept.
ngTMA ist eine wesentliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Gewebemikroarray-Techniken. Es enthält Fachwissen in der Histologie und TMA-Design mit der Flexibilität der digitalen Pathologie und der Genauigkeit der digitalen Anmerkungen mit der Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit des automatischen TMA Konstruktion. Die Kombination NGTMA und Bildanalyse zur Auswertung von Protein und molekulare Biomarker wird ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Qualität der klinischen und translationalen Forschung in der Zukunft weiter zu verbessern.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken den technischen Mitarbeitern des Translational Research Unit; Mary Economou, José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni und die Informatik-Team am Institut für Pathologie der Universität Bern.
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