Protokol biyomarker araştırma için inşaat ve doku microarrays kalitesini optimize edilmesini amaçlamaktadır. Bu planlama ve tasarım, dijital patoloji, sanal slayt açıklama ve otomatik doku arraying yönlerini kapsamaktadır.
Biyomarker araştırma doku mikrodizilerinin (TMA) dayanır. TMAlar bir "alıcı" blok içine bir "verici" blok küçük doku çekirdeklerinin tekrar transferi ile üretilebilir ve daha sonra biyobelirteç çeşitli uygulamalar için kullanılır. Geleneksel tmas yapımı yoğun emek gerektirmekte, kesin ve zaman alıcıdır. İşte, yeni nesil Doku mikrodizileri kullanarak bir protokol (ngTMA) özetlenmiştir. ngTMA TMA planlama ve tasarım, dijital patoloji, ve otomatik doku microarraying dayanmaktadır. Protokol 134 metastatik kolorektal kanser hastalarının bir örneği ile. Histolojik istatistik ve lojistik yönleri gibi TMA, TMA kopya doku noktalar, örnek büyüklüğü, istatistiksel analiz sayısı ve numarası eklenmesi için doku tipi, spesifik histolojik bölgeler ve hücre türleri olarak, kabul edilir. Her hasta için histolojik slaytlar taranmış ve bir web-tabanlı dijital platform üzerine yüklenir. Orada, onlar inceledi ve ann edilirotated bir 0,6-2,0 mm çaplı aracı, doku alanları ayırt çeşitli renkleri kullanarak birden çok kez kullanarak (işaretli). Donör blok ve 12 'alıcı' blok alet içine yüklenir. Dijital slaytlar alınır ve donör blok görüntülere eşleştirilir. Açıklamalı bölgelerin tekrarlanan arraying otomatik olarak ngTMA sonuçlanan gerçekleştirilir. Bu örnekte, altı ngTMAs altı farklı doku türleri / histolojik bölgesi ile planlanmıştır. NgTMAs iki kopyası arzu edilir. Taranan her hasta için dört slaytlar üç; 3 tarama çalışır ve gerekli gecede gerçekleştirilmez. Tüm slaytlar açıklamalı; Farklı renkler, farklı dokular / bölgeleri, yani tümör merkezi, istila ön, tümör / dokudan lenf nodu metastazı, karaciğer metastazları, ve normal doku temsil etmek için kullanılır. 17 açıklamalar / vaka yapılır; açıklama için süresi 2-3 dk / durumdur. 12 ngTMAs 4,556 noktalarını içeren üretilmektedir. Zaman arraying 15-20 saattir. Nedeniyle hassas, esneklik ve hız, ngTMA güçlüayrıca tmas kalitesini artırmak için bir araç ve klinik araştırma translasyonel olarak kullanılır.
Son iki yılda, doku mikroarray'ler (TMAlar) biyomarkör soruşturma çalışmaları dikkate değer bir etkisi oldu. TMAlar parafine gömülü 'vericinin blok tek bir TMA' alıcının blok içine, esas olarak (Şekil 1), tipik olarak çapı 0,6 ila 2,0 mm arasında değişen boyutu küçük doku çekirdeklerinin tekrar transferi, doku tarafından üretilen "arşiv" 1. Küçük bir çekirdek boyutu kullanarak, az ya da çok farklı hastadan yaklaşık 500 farklı doku noktalar tek TMA 2 içine dizilmiş olabilir.
Prognostik veya prediktif biyomarkör çalışmalar için TMAlar kullanımı birçok avantajı vardır. Imünohistokimya ile bir protein biyobelirteci ifade 450 hasta üzerinde değerlendirilecek olan örneği ele alalım. Aksine blokların aynı sayıda kesitli 450 hasta slaytlar üzerinde 450 immünohistokimyasal lekeleri gerçekleştirmek yerine, her örnekten küçük çekirdekler tek bir T üzerine dizilmiş olabilirMA bloğu. Birden çok çekirdek her bir hastadan alınan bile, blok en az sayıda üretilir. Bu şekilde bu masrafları ve diğer bilgi azalan ve doku yıkımı azaltma önemli bir etkisi vardır. Dokuların çok sayıda kullanarak Ayrıca bu uygun güç sağlar çalışmalar aynı deneysel koşullar altında değerlendirilmelidir.
TMAlar çeşitli kullanımlara sahiptir. Örneğin bunlar, morfolojisi, protein ekspresyonu RNA ekspresyonunu ve farklı boyalarla boyanması ile DNA sapmaları incelemek için kullanılabilir, ya da in situ hibridizasyon 3-7 immünohistokimya veya kromojenik ve daha sonra fluoresans. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, aynı zamanda, boyama protokolleri içi ve laboratuar varyasyonlarını deneme özgünlük ve belirli gen mutasyon için antikorların oluşturulması duyarlılık ve uluslararası ortak olarak protein ifade gözlemciler tekrarlanabilirliği belirlenmesi için bir tmas kullandık <sus> 8-11.
Hasta-türetilmiş dokuları kullanılarak geleneksel TMAlar inşaat uzun bir çok aşamalı prosedür (Şekil 2). Bu alındıktan yerden bir patoloji enstitüsü veya diğer kurum, olası bir uygun durumlarda arama ve arşivlerden teşhis slaytlar seçimi ile başlar. Patolog vaka başına her slayt değerlendirir ve çalışmanın amaçları için en temsilcisi slayt seçer. Daha sonra, ilgi alanındaki bölgenin mikroskop altında doğrudan bir kalem ile işaretlenmiştir. Bu genellikle zorlu ve belirsiz ve sadece doku yumruklar alınmalıdır nerede bir "tahmininde" sonuçlanır. Sonra bu işaretlenmiş slaytlar karşılık parafin bloklar arşivden edilir. Blok ve kızak arasında hızlı bir karşılaştırma yapılır. Bir yarı otomatik veya ev yapımı doku dizici kullanarak, verici bloğu ilgi tahmini bölümünde dışarı doğru itilmekte ve bir alıcı blok içine aktarıldı TMA. Bu arraying tekniği kullanarak TMAlar İnşaat emek yoğun, zaman alıcı, kesin ve sert olduğunu. 3 nüsha olarak 475 noktalar bir TMA hazırlama çalışma yaklaşık 84 saat sürmesi tahmin ediliyor.
Planlama ve tasarım (veya danışmanlık), histoloji uzmanlık ve otomatik TMA 12 arraying ile birlikte dijital patoloji: TMAlar inşası için yeni bir yaklaşım son zamanlarda Patoloji Enstitüsü, üç bileşenden dayanmaktadır Bern Üniversitesi tarafından tanıtıldı. Birlikte, bu kavram yeni nesil Doku Mikroarray (ngTMA) denir. Aşağıda, ngTMA için bir protokol metastatik kolorektal kanserli 134 hastanın bir örnek temelinde tarif edilmiştir. Burada primer tümörleri hem de lenf düğümü metastazı ve karaciğer metastazları sonraki analiz için biyomarker ngTMAs içine dizilmiştir edilecektir. Buna ek olarak, her bir hastaya küçük doku çekirdekleri gelecek nükleik asit ekstraksiyonu için arzu edilir.
Bu yazıda, ngTMA için bir protokol özetlenmiştir. ngTMA planlama ve tasarım, dijital patoloji ve slayt şerh içeren doku microarraying yanı sıra otomatik doku microarraying 12 için yeni kurulan bir kavramdır.
Geleneksel ince microarraying ile karşılaştırıldığında, ngTMA birçok avantaj sunmaktadır. Bir ilk adımda, planlama ve tasarım aşamasında kritiktir. Odak hedeflenen araştırma sorusunu yanıtlayan üzerinde. Bu dikkate almalı histolojik konular (örneğin, kaç noktalar Ben istiyorum ki bölgeler ve dahil?), Istatistiksel planlama (örneğin, örneklem büyüklüğü? Sonra benim örnekleri analiz Nasıl?) Ve lojistik hususlar (örneğin, nasıl Birçok biyolojik belirteçler ve bu nedenle kaç kopya ngTMA?). Belirli bir ngTMA bu biyomarkör tarama ve yüksek verimlilik için olup olmadığını, özel ihtiyaçları için veya sadece birkaç iyi seçilmiş cas belirli histolojik yönlerini incelemek için tasarlanmıştıres.
Bir değil ise, geleneksel ince kağıttan microarraying en önemli dezavantajı, histolojik slaytlar üzerinde işaretler imal edildiği düşük doğruluğudur. Spesifik histolojik yapıları, hücreler veya bölgelerde çalışma neredeyse imkansız hale gelmektedir. açıklamalar dijital slaytlar üzerinde doğrudan yerleştirilen çünkü ngTMA yüksek doğruluk sağlar. Bu tam olarak bölgelerini seçmek için araştırmacı spesifik hücreler de dahil olmak üzere, delikli sağlar. Bu örnekte, aynı doku bloğu içinde farklı alanları gibi küçük tümör hücre kümeleri ya da tek hücrelerin varlığı ile vurgulanan tümör merkezinde, istilası ve tümör ön / stroma etkileşim sahaları, düzenlenmesiyle dışarı delinir. Bu doğruluğu, ngTMA kullanılarak elde edilebilir. Slaytlar web-tabanlı dijital platform üzerine taranır, çünkü Üçüncüsü, görüntüleme slayt ve not bilgisayar aracılığıyla yerine mikroskop ile yapılabilir. Doku arraying yazılımı kullanıcı dostu sağlarBir yüksek esneklik derecesi, bu nedenle de farklı düzenleri ve ngTMA tasarımı ile arayüz elde edilebilir. TMA inşaat delme tarafından otomatik olarak yapılır bu yana, eller manevra ve inşaat için zamanın miktarı önemli ölçüde azalır az ihtiyaç vardır. Burada, bu örnekte TMA yapımı için süre 24 saat arasındadır. Geleneksel TMA yaklaşımı kullanarak ve saat başına 15 yumruklar tahmin, bu proje yaklaşık 304 saat alacaktı.
ngTMA protein ifadesi, mRNA veya DNA yanı sıra, bu kombinasyonları incelemek için de uygulanabilir. 9 potansiyel biyolojik belirteçler bu uygulamaların birçok göstermektedir Şekil. Standart immünohistokimyasal Ki-67 ile kanserlerin çoğalma endeksi belirlemek için uygulanabilir. Bu gibi genler için HER2 protein ekspresyonu ve DNA amplifikasyon araştırmak için kombine olarak kullanılabilir. Dokular maliyetleri, doku kullanımı ve diğer kaynağın azaltılması için tek bir ngTMA üzerinde bir araya getirilebilirs. Buna ek olarak, HER2 ve diğer genler için in situ melezleme, kromojenik mRNA'nın doku örneklerinin minimal numarasını kullanarak vakaların büyük sayıda tek mRNA belirlemek için gerçekleştirilebilir. CD8 gibi bağışıklık belirteçlerin İmmünohistokimya tümörün mikro-ortamı bağlamında görüntülenmiştir. Çift immünohistokimya, aynı zamanda, kanserlerin istila ön (kahverengi etiketlenmiştir), immün (kırmızı etiketli) hücreleri ve tümör hücreleri arasındaki etkileşim gibi ilgi konusu belirli bölgelerini vurgulamak için kullanılabilir. Ilgi Böyle bir bölge, geleneksel doku microarraying kullanılarak yakalanan olamazdı.
Bununla birlikte, bu protokolü, bazı sınırlamalar içermektedir. En önemli zorluk donör blok ve dijital slayt arasındaki örtüşme olduğunu. Çeşitli faktörler bu adımı etkileyebilir. İlk olarak, blok en son bölümünde kayma tarama için kullanılmalıdır. Bir çok durumda, H & E donör blok -Rathe son bölümü değilr bir immünohistokimyasal ya da diğer leke olduğunu. Son leke taranmış ve not ya da yeni bir H & E ile yapılmalıdır olduğu üzere, bu durumda, aynı zamanda, bir boyanmış lam sürece kullanılabilir. Dokular slayt ve blok eşleme zorlu yol açan su banyosunda genişleyebilir olarak doku kesitleri yapıldığı zaman da bakımını alınmalıdır. İkincisi, şu anda projelerin tek seferde işlenen 12 alıcı TMA blokları ile sınırlıdır. 12 TMAlar aşan büyük projeler ikinci bir proje adı atanmalıdır. Üçüncü olarak, donör bloklar çeşitli boyutlarda kendini ayarlayamaz aracı olarak, standart kalıp ve kasetleri kullanılarak yapılmalıdır. Son olarak, donör bloklar optimum delme ulaşmak için minimum yüksekliği (4 mm) aşmamalıdır. Bazı durumlarda, bu dokuların reembedding gerektirir.
Son birkaç yıldır yayınların Yüzlerce biyomarkör araştırma için değerli bir araç olarak TMA vurgulayın. TMAlar akciğer 13, kolorektal 7, bre incelemek için kullanılmıştırast 14, prostat 15, pankreas 16, mesane 17, ve mide 18 kanserleri, birkaç isim. Yazarların giderek artan sayıda görüntü analizi ve önemli adımlar bu yönde 19-21 yapılıyor ile TMAlar kullanımını birleştirdik. Ancak, yenilikçi TMA fikirleri 22-24 yayınlanmış araştırma grupları bir avuç yanında, biraz dikkat TMA tekniği kendisini optimize verildi. Böyle ATA-27 Estigen / Beecher'la tarafından gibi otomatik doku microarrayers, düzeni tasarım ve uygun ve otomatik doku delme sağlarlar. Ancak bu ngTMA kavramı sadece 1 yönünü temsil eder.
ngTMA geleneksel ince microarraying tekniklere kıyasla büyük bir gelişme görülür. Bu dijital patoloji esneklik ve hız ve otomatik TMA inşaat güvenilirliği dijital ek açıklamaları hassasiyetle histoloji ve TMA tasarım uzmanlığı içermektedir. NgTM kombinasyonuProtein ve moleküler belirteçlerin değerlendirilmesi için bir görüntü analizi ve gelecekte daha da klinik ve translasyonel araştırma kalitesini geliştirmek için güçlü bir araç olacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Translational Araştırma Birimi teknik personeli teşekkür etmek istiyorum; Mary Economou José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni ve Patoloji Enstitüsünde Bilişim Ekibi, Bern Üniversitesi.
Pannoramic 250 Flash II | 3DHistech | Slide scanner | |
TMA Grandmaster | 3DHistech | Tissue Microarrayer | |
Pannoramic Viewer | 3DHistech | free | Slide viewing software |
Case Center | 3DHistech | Digital slide platform |