प्रोटोकॉल biomarker अनुसंधान के लिए निर्माण और ऊतक की गुणवत्ता का अनुकूलन करना है. यह योजना और डिजाइन, डिजिटल पैथोलॉजी, आभासी स्लाइड एनोटेशन, और स्वचालित ऊतक arraying के पहलुओं को भी शामिल है.
Biomarker अनुसंधान ऊतक (टीएमए) पर निर्भर करता है. Tmas एक 'प्राप्तकर्ता' ब्लॉक में एक 'दाता' ब्लॉक से छोटे ऊतक कोर के दोहराया स्थानांतरण द्वारा निर्मित और फिर biomarker आवेदनों की एक किस्म के लिए उपयोग किया जाता है. पारंपरिक tmas का निर्माण श्रम, गहन imprecise, और समय लेने वाली है. इधर, अगली पीढ़ी के ऊतक का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल (ngTMA) उल्लिखित है. ngTMA TMA योजना और डिजाइन, डिजिटल पैथोलॉजी, और स्वचालित ऊतक microarraying पर आधारित है. प्रोटोकॉल 134 मेटास्टैटिक कोलोरेक्टल कैंसर रोगियों का एक उदाहरण का उपयोग करते हुए यह साफ है. , ऊतकीय सांख्यिकीय और सैन्य पहलुओं ऐसे TMA, TMA प्रतियों के ऊतक धब्बे, नमूना आकार, सांख्यिकीय विश्लेषण की संख्या, और संख्या में शामिल करने के लिए ऊतक प्रकार, विशिष्ट ऊतकीय क्षेत्रों, और प्रकार की कोशिकाओं के रूप में, माना जाता है. प्रत्येक रोगी के लिए ऊतकीय स्लाइड स्कैन और एक वेब आधारित डिजिटल प्लेटफार्म पर अपलोड कर रहे हैं. वहां उन्हें देखा और एन कर रहे हैंotated एक 0.6-2.0 मिमी व्यास उपकरण, ऊतक क्षेत्रों भेद करने के लिए विभिन्न रंगों के प्रयोग से कई बार उपयोग कर (चिह्नित). दाता ब्लॉक और 12 'प्राप्तकर्ता' ब्लॉक साधन में लोड कर रहे हैं. डिजिटल स्लाइड लिया और दाता ब्लॉक छवियों मिलान कर रहे हैं. एनोटेट क्षेत्रों के दोहराया arraying स्वतः एक ngTMA में जिसके परिणामस्वरूप किया जाता है. इस उदाहरण में, छह ngTMAs छह विभिन्न प्रकार के ऊतकों / ऊतकीय क्षेत्रों युक्त योजना बनाई है. NgTMAs की दो प्रतियां वांछित हैं. स्कैन कर रहे हैं प्रत्येक रोगी के लिए चार स्लाइड को तीन; 3 स्कैन रन आवश्यक और रात भर प्रदर्शन कर रहे हैं. सभी स्लाइड एनोटेट कर रहे हैं; अलग अलग रंग अलग ऊतकों / क्षेत्रों, अर्थात् ट्यूमर केंद्र, आक्रमण सामने, ट्यूमर / स्ट्रोमा, लिम्फ नोड मेटास्टेसिस, यकृत मेटास्टेसिस, और सामान्य ऊतक का प्रतिनिधित्व करने के लिए उपयोग किया जाता है. 17 एनोटेशन / मामला बना रहे हैं; टिप्पणी के लिए समय 2-3 मिनट / मामला है. 12 ngTMAs 4556 स्पॉट युक्त उत्पादन कर रहे हैं. समय arraying 15-20 घंटा है. कारण इसकी सटीक, लचीलापन और गति के लिए, ngTMA एक शक्तिशाली हैआगे tmas की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए उपकरण नैदानिक और शोधों में इस्तेमाल किया.
पिछले दो दशकों में, ऊतक (tmas) biomarker जांच के अध्ययन पर एक उल्लेखनीय प्रभाव पड़ा है. Tmas आयल एम्बेडेड 'दाता' ब्लॉक से एक भी टीएमए 'प्राप्तकर्ता' ब्लॉक में, अनिवार्य रूप से (चित्रा 1) आमतौर पर व्यास में 0.6 से 2.0 मिमी से आकार में लेकर छोटे ऊतक कोर के दोहराया स्थानांतरण, द्वारा निर्मित ऊतक "अभिलेखागार" हैं 1. एक छोटे मूल आकार का उपयोग करना, कुछ या कई अलग अलग मरीजों से लगभग 500 विभिन्न ऊतकों स्पॉट एक TMA 2 में arrayed जा सकता है.
शकुन या भविष्य कहनेवाला biomarker के अध्ययन के लिए tmas का उपयोग कई फायदे हैं. Immunohistochemistry द्वारा एक प्रोटीन बायोमार्कर की अभिव्यक्ति 450 रोगियों पर मूल्यांकन किया जाना है जहां उदाहरण पर विचार करें. बल्कि ब्लॉक के एक ही नंबर से sectioned 450 रोगी स्लाइड पर 450 immunohistochemical दाग प्रदर्शन से, प्रत्येक नमूने से छोटे कोर एक भी टी पर arrayed जा सकता हैएमए ब्लॉक. एकाधिक कोर प्रत्येक व्यक्ति के मरीज से लिया जाता है, भले ही ब्लॉक के एक न्यूनतम संख्या का उत्पादन कर रहे हैं. यह काफी लागत और अन्य संसाधनों ह्रासमान के साथ ही ऊतक बर्बाद कर कम करने का काफी प्रभाव पड़ता है. ऊतकों की एक बड़ी संख्या का उपयोग कर ही यह उचित संचालित करने की अनुमति देता पढ़ाई एक ही प्रयोगात्मक शर्तों के तहत मूल्यांकन किया जाना.
Tmas कई अलग अलग आवेदन किया है. उदाहरण के लिए, वे आकृति विज्ञान, प्रोटीन अभिव्यक्ति, आरएनए अभिव्यक्ति और विभिन्न रंगों के साथ धुंधला निम्नलिखित डीएनए aberrations अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या स्वस्थानी संकरण 3-7 में immunohistochemistry या वर्णजनीय और भी प्रतिदीप्ति के बाद. हाल के अध्ययनों से भी, धुंधला प्रोटोकॉल में अंतर और interlaboratory भिन्नता का परीक्षण विशिष्टता या विशिष्ट जीन म्यूटेशन के लिए एंटीबॉडी की संवेदनशीलता की स्थापना, और अंतरराष्ट्रीय सहयोग में प्रोटीन अभिव्यक्ति की interobserver reproducibility निर्धारित करने के लिए tmas का इस्तेमाल किया है <sup> 8-11.
रोगी व्युत्पन्न ऊतकों का उपयोग पारंपरिक tmas का निर्माण एक लंबी बहु कदम प्रक्रिया (चित्रा 2) है. यह वे प्राप्त कर रहे हैं, जहां से एक पैथोलॉजी संस्थान, या अन्य संस्थान में एक संभव उचित मामलों के लिए खोज और अभिलेखागार से नैदानिक स्लाइड्स के चयन के साथ शुरू होता है. रोगविज्ञानी मामले के अनुसार प्रत्येक स्लाइड का मूल्यांकन करता है और अध्ययन के प्रयोजनों के लिए सबसे अधिक प्रतिनिधि स्लाइड का चयन करता है. इसके बाद, ब्याज के क्षेत्र खुर्दबीन के नीचे सीधे एक पेन का उपयोग कर के रूप में चिह्नित है. यह अक्सर चुनौतीपूर्ण और imprecise है और केवल ऊतक घूंसे से लिया जाना चाहिए जहां के एक "अनुमान" में यह परिणाम है. इसके बाद, इन चिह्नित स्लाइड को इसी आयल ब्लॉक संग्रह से प्राप्त कर रहे हैं. ब्लॉक और स्लाइड के बीच एक त्वरित तुलना किया जाता है. एक स्वचालित अर्द्ध या घर का बना ऊतक arrayer का उपयोग करना, दाता ब्लॉक ब्याज की अनुमानित क्षेत्र में बाहर मुक्का मारा है और एक प्राप्तकर्ता TMA ब्लॉक में स्थानांतरित. इस arraying तकनीक का उपयोग tmas का निर्माण श्रम गहन, समय लेने वाली है, imprecise, और अनम्य है. 3 प्रतियों में 475 स्थानों में से एक TMA तैयारी काम के बारे में 84 घंटे लग जाने का अनुमान है.
योजना और डिजाइन (या परामर्श), ऊतक विज्ञान में विशेषज्ञता और स्वचालित टीएमए 12 arraying के साथ संयुक्त डिजिटल पैथोलॉजी: tmas का निर्माण करने के लिए एक नया दृष्टिकोण हाल ही में पैथोलॉजी संस्थान, तीन घटकों पर निर्भर करता है कि बर्न विश्वविद्यालय द्वारा शुरू की गई थी. साथ में, इस अवधारणा को अगली पीढ़ी के ऊतक माइक्रोएरे (ngTMA) कहा जाता है. नीचे, ngTMA के लिए एक प्रोटोकॉल मेटास्टैटिक कोलोरेक्टल कैंसर के साथ 134 रोगियों का एक उदाहरण के आधार पर वर्णित है. इधर, प्राथमिक ट्यूमर के साथ ही लिम्फ नोड मेटास्टेसिस और जिगर metastases बाद biomarker विश्लेषण के लिए ngTMAs में arrayed हो रहे हैं. इसके अतिरिक्त, प्रत्येक रोगी से छोटे ऊतक कोर भविष्य न्यूक्लिक एसिड निकासी के लिए वांछित हैं.
इस पत्र में, ngTMA के लिए एक प्रोटोकॉल उल्लिखित है. ngTMA योजना और डिजाइन, डिजिटल पैथोलॉजी और स्लाइड एनोटेशन शामिल ऊतक microarraying के रूप में अच्छी तरह से स्वचालित ऊतक microarraying 12 के लिए एक नव स्थापित अवधारणा है.
पारंपरिक ऊतक microarraying की तुलना में, ngTMA कई लाभ प्रदान करता है. पहले कदम में, योजना और डिजाइन चरण के लिए महत्वपूर्ण है. फोकस एक लक्षित अनुसंधान सवाल का जवाब देने पर है. यह ध्यान में रखना चाहिए ऊतकीय मुद्दों (जैसे, कितने धब्बे मैं चाहता है जो क्षेत्रों और शामिल करने के लिए?), सांख्यिकीय नियोजन (जैसे, नमूना आकार? मैं बाद में मेरे नमूनों का विश्लेषण करते हैं?) और साजो विचारों (जैसे, कैसे कई बायोमार्कर और इसलिए कितने ngTMA प्रतियां?). एक विशिष्ट ngTMA यह biomarker स्क्रीनिंग और उच्च throughput के लिए है कि क्या, विशिष्ट जरूरतों के लिए बनाया है या केवल कुछ अच्छी तरह से चयनित कैस पर विशिष्ट ऊतकीय पहलुओं का अध्ययन करने का इरादा हैतों.
एक, यदि नहीं, तो पारंपरिक ऊतक microarraying का सबसे महत्वपूर्ण नुकसान ऊतकीय स्लाइड्स पर निशान बना रहे हैं, जिसके साथ कम सटीकता है. विशिष्ट ऊतकीय संरचनाओं, कोशिकाओं या क्षेत्रों का अध्ययन लगभग असंभव बना दिया है. एनोटेशन डिजिटल स्लाइड पर सीधे रखा जाता है क्योंकि ngTMA उच्च सटीकता के लिए अनुमति देता है. यह ठीक क्षेत्रों का चयन करने के शोधकर्ता विशिष्ट कोशिकाओं सहित, मुक्का मारा जा करने के लिए अनुमति देता है. इस उदाहरण में, एक ही ऊतक ब्लॉक के भीतर विभिन्न क्षेत्रों में इस तरह के छोटे ट्यूमर सेल समूहों या यहां तक कि एकल कक्षों की मौजूदगी से प्रकाश डाला ट्यूमर केंद्र, आक्रमण के सामने और ट्यूमर / stroma बातचीत के क्षेत्रों के रूप में, arraying के लिए बाहर मुक्का मारा जाता है. यह सटीकता केवल ngTMA का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. स्लाइड एक वेब आधारित डिजिटल प्लेटफार्म पर स्कैन कर रहे हैं क्योंकि तीसरे,, देखने के लिए स्लाइड और टिप्पणी कंप्यूटर के माध्यम से करने के बजाय माइक्रोस्कोप के साथ बनाया जा सकता है. ऊतक arraying सॉफ्टवेयर एक उपयोगकर्ता के अनुकूल प्रदान करता हैएक लचीलेपन के उच्च डिग्री, इसलिए विभिन्न लेआउट और ngTMA डिजाइन के साथ इंटरफेस प्राप्त किया जा सकता है. टीएमए निर्माण ड्रिलिंग द्वारा स्वचालित रूप से किया जाता है के बाद से, हाथों पर चालों और निर्माण के लिए समय की मात्रा काफी कम है के लिए थोड़ा की जरूरत है. यहाँ इस उदाहरण में TMA निर्माण के लिए समय 24 घंटा के बीच है. एक पारंपरिक TMA दृष्टिकोण का प्रयोग और घंटा प्रति 15 घूंसे आकलन, इस परियोजना में लगभग 304 घंटे लगेंगे.
ngTMA प्रोटीन अभिव्यक्ति, mRNA या डीएनए के साथ ही इन के संयोजन का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है. 9 संभावित बायोमार्कर के लिए इन आवेदनों में से कई दिखाता चित्रा. मानक immunohistochemistry की-67 का उपयोग कैंसर के प्रसार सूचकांक का निर्धारण करने के लिए लागू किया जा सकता है. ऐसे HER2 के रूप में जीनों के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति और डीएनए प्रवर्धन की जांच के लिए एक संयुक्त दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया जा सकता है. ऊतकों लागत, ऊतक के उपयोग और अन्य संसाधन कम करने के लिए एक एकल ngTMA पर एक साथ इकट्ठा किया जा सकता हैएस. इसके अलावा, HER2 और अन्य जीनों के लिए स्वस्थानी संकरण में वर्णजनीय mRNA ऊतक स्लाइड्स की एक न्यूनतम संख्या का उपयोग कर मामलों की एक बड़ी संख्या में एकल mRNA टेप की पहचान करने के लिए किया जा सकता है. ऐसी सीडी 8 के रूप में प्रतिरक्षा मार्करों के Immunohistochemistry ट्यूमर microenvironment के संदर्भ में देखे जा सकते हैं. डबल immunohistochemistry भी इस तरह के कैंसर के आक्रमण के सामने (भूरे रंग में लेबल) प्रतिरक्षा (लाल रंग में लेबल) कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच बातचीत के रूप में ब्याज की विशेष क्षेत्रों को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ब्याज के इस तरह के एक क्षेत्र में पारंपरिक ऊतक microarraying का उपयोग कर लिया गया है नहीं कर सका.
बहरहाल, इस प्रोटोकॉल कुछ सीमाएं शामिल हैं. सबसे महत्वपूर्ण चुनौती दाता ब्लॉक और डिजिटल स्लाइड के बीच ओवरलैप है. कई कारकों इस कदम को प्रभावित कर सकते हैं. सबसे पहले, ब्लॉक से नवीनतम अनुभाग स्लाइड स्कैनिंग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. कई मामलों में, एच एंड ई दाता ब्लॉक, अधिक तत्पर के अंतिम खंड नहीं हैअनुसंधान यह एक immunohistochemical या अन्य दाग है. पिछले दाग स्कैन और एनोटेट या एक नया एच ई बनाया जाना चाहिए है के रूप में इस मामले में, यह भी एक दाग स्लाइड के रूप में लंबे समय तक इस्तेमाल किया जा सकता है. ऊतकों स्लाइड और ब्लॉक का चुनौतीपूर्ण मिलान की ओर जाता है जो पानी के स्नान में विस्तार कर सकते हैं के रूप में ऊतक वर्गों किए जा रहे हैं जब ख्याल भी रखा जाना चाहिए. दूसरे, पल में परियोजनाओं को एक ही समय में संसाधित 12 प्राप्तकर्ता TMA ब्लॉक करने के लिए सीमित कर रहे हैं. 12 tmas से अधिक बड़ी परियोजनाओं को एक दूसरी परियोजना के नाम को सौंपा जाना चाहिए. तीसरा, दाता ब्लॉक विभिन्न आकारों के लिए खुद को समायोजित नहीं कर सकते साधन के रूप में मानक के नए नए साँचे और कैसेट का उपयोग किया जाना चाहिए. अंत में, दाता ब्लॉक इष्टतम ड्रिलिंग प्राप्त करने के लिए कम से कम ऊंचाई (4 मिमी) से अधिक होना चाहिए. कुछ मामलों में, यह ऊतकों की reembedding की आवश्यकता है.
पिछले कुछ वर्षों में प्रकाशन के सैकड़ों biomarker अनुसंधान के लिए एक अमूल्य उपकरण के रूप में TMA पर प्रकाश डाला. Tmas फेफड़ों 13, कोलोरेक्टल 7, BRE अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैAST 14, प्रोस्टेट 15, अग्न्याशय 16, मूत्राशय 17, और गैस्ट्रिक 18 तरह के कैंसर, कुछ नाम हैं. लेखकों की संख्या बढ़ रही छवि विश्लेषण और महत्वपूर्ण प्रगति इस दिशा 19-21 में किए जा रहे हैं साथ tmas का उपयोग संयुक्त है. हालांकि, अभिनव TMA विचारों 22-24 प्रकाशित किया है कि अनुसंधान समूहों में से एक मुट्ठी के बगल में, थोड़ा ध्यान TMA तकनीक ही अनुकूलन करने के लिए दिया गया है. ऐसे अता-27 Estigen / बीचर द्वारा के रूप में स्वचालित ऊतक microarrayers, लेआउट डिजाइन और समीचीन और स्वचालित ऊतक छिद्रण प्रदान करते हैं. हालांकि यह ngTMA अवधारणा का केवल 1 पहलू का प्रतिनिधित्व करता है.
ngTMA पारंपरिक ऊतक microarraying तकनीक से काफी सुधार है. यह डिजिटल पैथोलॉजी का लचीलापन और गति और स्वचालित TMA निर्माण की विश्वसनीयता के साथ डिजिटल एनोटेशन की परिशुद्धता के साथ ऊतक विज्ञान और टीएमए डिजाइन में विशेषज्ञता को शामिल किया गया. ngTM का संयोजनप्रोटीन और आणविक बायोमार्कर के मूल्यांकन के लिए एक और छवि विश्लेषण आगे भविष्य में नैदानिक और translational अनुसंधान की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण होगा.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों translational रिसर्च यूनिट के तकनीकी कर्मचारियों को धन्यवाद देना चाहूंगा; मैरी Economou, जोस Galvan, कैरोलीन हथौड़ा, डोमिनिक मुलर, Liliane Schöni और पैथोलॉजी संस्थान में सूचना विज्ञान टीम, बर्न विश्वविद्यालय.
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