Het protocol is gericht op het optimaliseren van de bouw en de kwaliteit van het weefsel microarrays voor biomarker onderzoek. Het omvat aspecten van de planning en het ontwerp, digitale pathologie, virtuele dia annotatie, en geautomatiseerde weefsel arraying.
Biomarker onderzoek is gebaseerd op tissue microarrays (TMA). TMA's worden geproduceerd door herhaalde overdracht van kleine kernen weefsel van een donor blok in een "ontvanger" blok en dan gebruikt voor verschillende toepassingen biomarker. De constructie van conventionele TMA is arbeidsintensief, onnauwkeurig en tijdrovend. Hier wordt een protocol met behulp van de volgende generatie Tissue microarrays (ngTMA) geschetst. ngTMA is gebaseerd op TMA planning en ontwerp, digitale pathologie, en geautomatiseerde weefsel microarraying. Het protocol wordt geïllustreerd aan de hand van een voorbeeld van 134 gemetastaseerd colorectale kanker patiënten. Histologische, statistische en logistieke aspecten worden beschouwd, zoals het type weefsel, specifieke histologische regio's, en celtypen voor opname in de TMA, het aantal weefsel vlekken, steekproefgrootte, statistische analyse en het aantal TMA exemplaren. Histologische coupes voor elke patiënt worden gescand en geüpload naar een web-based digitaal platform. Daar worden ze gezien en annotated (gemerkt) met een 0,6-2,0 mm diameter van het gereedschap, meerdere keren met behulp van verschillende kleuren om weefsel gebieden onderscheiden. Donorblokken en 12 "ontvanger" blokken worden geladen in het instrument. Digitale dia's worden opgehaald en gekoppeld aan donor blok afbeeldingen. Herhaalde arraying van geannoteerde regio wordt automatisch uitgevoerd wat resulteert in een ngTMA. In dit voorbeeld worden zes ngTMAs voorzien met zes verschillende weefseltypen / histologische zones. Twee exemplaren van de ngTMAs gewenst zijn. Drie tot vier dia voor elke patiënt worden afgetast; 3 scan pistes zijn noodzakelijk en 's nachts uitgevoerd. Alle dia's worden geannoteerd; verschillende kleuren worden gebruikt om de verschillende weefsels / zones, namelijk tumor centrum invasiefront, tumor / stroma, metastasen, levermetastasen en normaal weefsel representeren. 17 annotaties / case zijn gemaakt; tijd voor annotatie is 2-3 min / case. 12 ngTMAs worden geproduceerd met 4556 plekken. Arraying tijd is 15-20 uur. Door de precisie, flexibiliteit en snelheid ngTMA is een krachtigeinstrument om verdere verbetering van de kwaliteit van de TMA's gebruikt in klinisch en translationeel onderzoek.
In de afgelopen twee decennia hebben tissue microarrays (TMA) een opmerkelijke invloed op biomarker onderzoek studies hadden. TMA hoofdzakelijk weefsel "archieven" door de herhaalde overdracht van kleine weefsel kernen, gewoonlijk variërend in afmeting 0,6-2,0 mm in diameter, van paraffine donor blokken in een TMA "ontvanger blok (figuur 1) 1. Met behulp van een kleine kern grootte, kan ongeveer 500 verschillende weefsel spots van enkele of vele verschillende patiënten worden getooid in een TMA 2.
Het gebruik van TMA voor prognostische of voorspellende biomarker studies heeft vele voordelen. Beschouw het voorbeeld waarbij expressie van een eiwit biomarker door immunohistochemie wordt geëvalueerd 450 patiënten. In plaats van uitvoeren 450 immunohistochemische vlekken op 450 patiënten dia doorsnede van hetzelfde aantal blokken, kunnen kleine kernen van elk monster worden bekleed op een TMA blok. Zelfs als er meerdere kernen worden van elk individuele patiënt, een minimum aantal blokken geproduceerd. Dit heeft het aanzienlijke effect van een drastische vermindering van de kosten en andere middelen, alsmede het verminderen van weefsel verspillen. Bovendien maakt dit passend aangedreven studies met een groot aantal weefsels geëvalueerd onder dezelfde proefomstandigheden.
TMA's hebben veel verschillende toepassingen. Zo kunnen zij worden gebruikt om de morfologie, eiwitexpressie, RNA expressie en DNA afwijkingen na kleuring met verschillende kleurstoffen studie, of na immunohistochemie of chromogene en zelfs fluorescentie in situ hybridisatie 3-7. Recente studies hebben ook TMA testen intra en interlaboratoriumvariatie in kleuringsprotocollen, bepaalt specificiteit en gevoeligheid van antilichamen voor specifieke genmutaties, en de interobserver reproduceerbaarheid van eiwitexpressie in internationale samenwerkingsverbanden bepalen <sup> 8-11.
De constructie van TMA traditionele gebruik-patiënt afgeleide weefsels een lange meerstappenprocedure procedure (figuur 2). Het begint met een zoektocht naar mogelijke passende gevallen en selectie van diagnostische dia's uit het archief aan een instelling voor pathologie, of een andere instelling, waar ze worden opgehaald. De patholoog evalueert elke dia per case en selecteert de meest representatieve dia ten behoeve van de studie. Vervolgens wordt de regio van belang gemarkeerd met een pen direct onder de microscoop. Dit is vaak een uitdaging en onnauwkeurig en resulteert slechts in een "schatting" van waar weefsel stoten moet worden genomen van. Vervolgens wordt de paraffine blokken die overeenkomen met deze gemarkeerde dia's worden opgehaald uit het archief. Een snelle vergelijking tussen blok en dia wordt gemaakt. Met behulp van een semi-automatische of zelfgemaakte weefsel Arrayer, wordt de donor blok geslagen in de geschatte regio van belang en overgebracht naar een ontvanger TMA blok. De bouw van TMA's met behulp van deze arraying techniek is arbeidsintensief, tijdrovend, onnauwkeurig, en inflexibel. Het voorbereiden van een TMA van 475 plekken in 3 exemplaren wordt geschat op ongeveer 84 uur werk te nemen.
Een nieuwe benadering van de bouw van TMA's werd onlangs door het Instituut voor Pathologie van de Universiteit van Bern, dat is gebaseerd op drie componenten: de planning en het ontwerp (of advies), digitale pathologie gecombineerd met de expertise in de histologie en geautomatiseerde TMA arraying 12. Samen, wordt dit concept genaamd volgende generatie Tissue microarray (ngTMA). Hieronder is een protocol voor ngTMA beschreven op basis van een voorbeeld van de 134 patiënten met gemetastaseerd colorectaal carcinoom. Hier, primaire tumoren evenals lymfkliermetastasen en levermetastasen worden getooid in ngTMAs voor verdere biomarker analyse. Daarnaast kleine weefsel kernen van elke patiënt worden gewenst voor toekomstige nucleïnezuur extractie.
In deze paper wordt een protocol voor ngTMA geschetst. ngTMA is een nieuw opgerichte concept voor tissue microarraying waarbij planning en ontwerp, digitale pathologie en dia annotatie evenals geautomatiseerde weefsel microarraying 12.
Vergeleken met conventionele weefsel microarraying, ngTMA biedt vele voordelen. In een eerste stap, de planning en ontwerpfase kritisch. De focus ligt op het beantwoorden van een gerichte onderzoeksvraag. Hierbij moet rekening worden gehouden met de histologische aspecten (bijvoorbeeld welke regio en hoeveel plekken wil ik onder andere?), De statistische planning (bijvoorbeeld steekproefgrootte? Hoe analyseer ik mijn monsters later?) En logistieke overwegingen (bijvoorbeeld hoe vele biomarkers en dus hoeveel ngTMA kopieën?). Een specifieke ngTMA is gemaakt voor specifieke behoeften, of het nu voor biomarker screening en high-throughput of bedoeld om specifieke histologische aspecten te bestuderen op slechts een paar goed gekozen cases.
One, zo niet de, belangrijkste nadeel van conventionele tissue microarraying is de lage nauwkeurigheid waarmee markeringen op de histologische coupes worden gemaakt. De studie van specifieke histologische structuren, cellen of gebieden is vrijwel onmogelijk. ngTMA zorgt voor hoge precisie omdat aantekeningen direct aan de digitale glaasjes geplaatst. Hierdoor kan de onderzoeker aan de regio's nauwkeurig selecteren die moet worden geslagen, met inbegrip van specifieke cellen. In dit voorbeeld worden verschillende gebieden binnen hetzelfde weefsel blok doorgestoken voor rangschikken van, zoals het tumor centrum, de invasiefront en verwijdering van tumor / stroma interactie benadrukt door de aanwezigheid van kleine tumorcel clusters of zelfs enkele cellen. Deze nauwkeurigheid kan alleen worden bereikt met ngTMA. Ten derde, omdat de dia's worden gescand op een web-based digitaal platform, schuift het bekijken en annoteren kan worden gemaakt door middel van de computer in plaats van met de microscoop. Het weefsel arraying software biedt een gebruikersvriendelijkeinterface met een grote flexibiliteit, dus verschillende layouts en ngTMA ontwerp kan worden bereikt. Aangezien TMA constructie automatisch wordt uitgevoerd door het boren, is er weinig noodzaak voor praktische manoeuvreren en de hoeveelheid tijd voor de bouw aanzienlijk verminderd. De tijd voor TMA bouw in dit voorbeeld hier tussen 24 uur. Met behulp van een conventionele TMA aanpak en het schatten van 15 slagen per uur, zou dit project ongeveer 304 uur duren.
ngTMA kan op eiwitexpressie mRNA of DNA alsook combinaties van deze onderzoeken. Figuur 9 illustreert verscheidene van deze toepassingen potentiële biomarkers. Standaard immunohistochemie kan worden toegepast op de celproliferatie kanker met Ki-67 bepalen. Een gecombineerde benadering van eiwitexpressie en DNA amplificatie voor genen zoals HER2 onderzoeken worden gebruikt. Weefsels kunnen verzameld worden op een enkele ngTMA om kosten, gebruik weefsel en andere bron te verminderens. Bovendien kunnen chromogene mRNA in situ hybridisatie voor HER2 en andere genen worden uitgevoerd om enkel mRNA transcripten in een groot aantal gevallen met een minimaal aantal weefselobjectglaasjes identificeren. Immunohistochemie van immune merkers zoals CD8 kan worden gevisualiseerd in de context van de tumor micro-omgeving. Dubbele immunohistochemie kan ook worden gebruikt om bepaalde gebieden van belang te benadrukken zoals uitwisseling tussen immuuncellen (geëtiketteerd rood) en tumorcellen (bruin gemarkeerd) en invasiefront kankers. Zulk een regio van belang kon niet worden gevangen met behulp van conventionele weefsel microarraying.
Toch, dit protocol bevat een aantal beperkingen. De grootste uitdaging is de overlap tussen donor blok en digitale schuif. Verschillende factoren kunnen deze stap te beïnvloeden. Ten eerste moet het laatste gedeelte van het blok worden gebruikt voor dia's scannen. In veel gevallen, de H & E is niet het laatste gedeelte van het donorblok, rather is een immunohistochemische of andere vlekken. In dit geval, ook bevlekt dia kan worden zolang als de laatste vlek wordt gescand en geannoteerde of een nieuwe H & E moet worden. Zorg moet ook worden genomen bij de coupes worden gemaakt als weefsels kunnen uitbreiden in het waterbad, die leidt tot een uitdagende matching van de glijbaan en blok. Tweede momenteel projecten slechts 12 ontvanger TMA blokken verwerkt in een keer. Grotere projecten van meer dan 12 TMA's moet worden toegewezen aan een tweede naam van het project. Ten derde moet de donorblokken worden gemaakt met standaard mallen en cassettes als instrument kan zich niet aanpassen aan verschillende afmetingen. Tenslotte moet donorblokken de minimale hoogte (4 mm) boren optimale bereiken overschrijden. In veel gevallen vereist reembedding van weefsels.
Honderden publicaties in de afgelopen jaren wijzen op de TMA als een waardevol instrument voor biomarker onderzoek. TMA's zijn gebruikt om long 13, colorectale 7, bre bestuderenast 14, prostate 15, 16 pancreas, blaas 17 en 18 maag kanker, een paar te noemen. Een toenemend aantal auteurs hebben het gebruik van TMA met beeldanalyse en belangrijke stappen worden gemaakt in deze richting 19-21 gecombineerd. Echter, naast een handvol onderzoeksgroepen die innovatieve ideeën TMA 22-24 hebben gepubliceerd, weinig aandacht is gegeven aan de TMA techniek zelf te optimaliseren. Geautomatiseerde weefsel microarrayers, zoals de ATA-27 door Estigen / Beecher geven wel de lay-out ontwerp en de doelmatige en geautomatiseerde weefsel ponsen. Dit is echter slechts 1 aspect van de ngTMA concept.
ngTMA is een aanzienlijke verbetering ten opzichte van conventionele tissue microarraying technieken. Het bevat deskundigheid in histologie en TMA ontwerp met de flexibiliteit van digitale pathologie en de precisie van digitale annotaties met de snelheid en betrouwbaarheid van geautomatiseerde TMA constructie. De combinatie van ngTMEen en beeldanalyse voor de evaluatie van eiwitten en moleculaire biomarkers zal een krachtig instrument om verdere verbetering van de kwaliteit van het klinisch en translationeel onderzoek in de toekomst.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag de technische staf van het Translational Research Unit bedanken; Mary Economou, Jose Galván, Caroline Hamer, Dominique Müller, Liliane Schöni en Informatica Team aan het Instituut voor Pathologie van de Universiteit van Bern.
Pannoramic 250 Flash II | 3DHistech | Slide scanner | |
TMA Grandmaster | 3DHistech | Tissue Microarrayer | |
Pannoramic Viewer | 3DHistech | free | Slide viewing software |
Case Center | 3DHistech | Digital slide platform |