Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Een volgende generatie Tissue microarray (ngTMA) Protocol voor Biomarker Studies

doi: 10.3791/51893 Published: September 23, 2014

Summary

Het protocol is gericht op het optimaliseren van de bouw en de kwaliteit van het weefsel microarrays voor biomarker onderzoek. Het omvat aspecten van de planning en het ontwerp, digitale pathologie, virtuele dia annotatie, en geautomatiseerde weefsel arraying.

Abstract

Biomarker onderzoek is gebaseerd op tissue microarrays (TMA). TMA's worden geproduceerd door herhaalde overdracht van kleine kernen weefsel van een donor blok in een "ontvanger" blok en dan gebruikt voor verschillende toepassingen biomarker. De constructie van conventionele TMA is arbeidsintensief, onnauwkeurig en tijdrovend. Hier wordt een protocol met behulp van de volgende generatie Tissue microarrays (ngTMA) geschetst. ngTMA is gebaseerd op TMA planning en ontwerp, digitale pathologie, en geautomatiseerde weefsel microarraying. Het protocol wordt geïllustreerd aan de hand van een voorbeeld van 134 gemetastaseerd colorectale kanker patiënten. Histologische, statistische en logistieke aspecten worden beschouwd, zoals het type weefsel, specifieke histologische regio's, en celtypen voor opname in de TMA, het aantal weefsel vlekken, steekproefgrootte, statistische analyse en het aantal TMA exemplaren. Histologische coupes voor elke patiënt worden gescand en geüpload naar een web-based digitaal platform. Daar worden ze gezien en annotated (gemerkt) met een 0,6-2,0 mm diameter van het gereedschap, meerdere keren met behulp van verschillende kleuren om weefsel gebieden onderscheiden. Donorblokken en 12 "ontvanger" blokken worden geladen in het instrument. Digitale dia's worden opgehaald en gekoppeld aan donor blok afbeeldingen. Herhaalde arraying van geannoteerde regio wordt automatisch uitgevoerd wat resulteert in een ngTMA. In dit voorbeeld worden zes ngTMAs voorzien met zes verschillende weefseltypen / histologische zones. Twee exemplaren van de ngTMAs gewenst zijn. Drie tot vier dia voor elke patiënt worden afgetast; 3 scan pistes zijn noodzakelijk en 's nachts uitgevoerd. Alle dia's worden geannoteerd; verschillende kleuren worden gebruikt om de verschillende weefsels / zones, namelijk tumor centrum invasiefront, tumor / stroma, metastasen, levermetastasen en normaal weefsel representeren. 17 annotaties / case zijn gemaakt; tijd voor annotatie is 2-3 min / case. 12 ngTMAs worden geproduceerd met 4556 plekken. Arraying tijd is 15-20 uur. Door de precisie, flexibiliteit en snelheid ngTMA is een krachtigeinstrument om verdere verbetering van de kwaliteit van de TMA's gebruikt in klinisch en translationeel onderzoek.

Introduction

In de afgelopen twee decennia hebben tissue microarrays (TMA) een opmerkelijke invloed op biomarker onderzoek studies hadden. TMA hoofdzakelijk weefsel "archieven" door de herhaalde overdracht van kleine weefsel kernen, gewoonlijk variërend in afmeting 0,6-2,0 mm in diameter, van paraffine donor blokken in een TMA "ontvanger blok (figuur 1) 1. Met behulp van een kleine kern grootte, kan ongeveer 500 verschillende weefsel spots van enkele of vele verschillende patiënten worden getooid in een TMA 2.

Het gebruik van TMA voor prognostische of voorspellende biomarker studies heeft vele voordelen. Beschouw het voorbeeld waarbij expressie van een eiwit biomarker door immunohistochemie wordt geëvalueerd 450 patiënten. In plaats van uitvoeren 450 immunohistochemische vlekken op 450 patiënten dia doorsnede van hetzelfde aantal blokken, kunnen kleine kernen van elk monster worden bekleed op een TMA blok. Zelfs als er meerdere kernen worden van elk individuele patiënt, een minimum aantal blokken geproduceerd. Dit heeft het aanzienlijke effect van een drastische vermindering van de kosten en andere middelen, alsmede het verminderen van weefsel verspillen. Bovendien maakt dit passend aangedreven studies met een groot aantal weefsels geëvalueerd onder dezelfde proefomstandigheden.

TMA's hebben veel verschillende toepassingen. Zo kunnen zij worden gebruikt om de morfologie, eiwitexpressie, RNA expressie en DNA afwijkingen na kleuring met verschillende kleurstoffen studie, of na immunohistochemie of chromogene en zelfs fluorescentie in situ hybridisatie 3-7. Recente studies hebben ook TMA testen intra en interlaboratoriumvariatie in kleuringsprotocollen, bepaalt specificiteit en gevoeligheid van antilichamen voor specifieke genmutaties, en de interobserver reproduceerbaarheid van eiwitexpressie in internationale samenwerkingsverbanden bepalen

De constructie van TMA traditionele gebruik-patiënt afgeleide weefsels een lange meerstappenprocedure procedure (figuur 2). Het begint met een zoektocht naar mogelijke passende gevallen en selectie van diagnostische dia's uit het archief aan een instelling voor pathologie, of een andere instelling, waar ze worden opgehaald. De patholoog evalueert elke dia per case en selecteert de meest representatieve dia ten behoeve van de studie. Vervolgens wordt de regio van belang gemarkeerd met een pen direct onder de microscoop. Dit is vaak een uitdaging en onnauwkeurig en resulteert slechts in een "schatting" van waar weefsel stoten moet worden genomen van. Vervolgens wordt de paraffine blokken die overeenkomen met deze gemarkeerde dia's worden opgehaald uit het archief. Een snelle vergelijking tussen blok en dia wordt gemaakt. Met behulp van een semi-automatische of zelfgemaakte weefsel Arrayer, wordt de donor blok geslagen in de geschatte regio van belang en overgebracht naar een ontvanger TMA blok. De bouw van TMA's met behulp van deze arraying techniek is arbeidsintensief, tijdrovend, onnauwkeurig, en inflexibel. Het voorbereiden van een TMA van 475 plekken in 3 exemplaren wordt geschat op ongeveer 84 uur werk te nemen.

Een nieuwe benadering van de bouw van TMA's werd onlangs door het Instituut voor Pathologie van de Universiteit van Bern, dat is gebaseerd op drie componenten: de planning en het ontwerp (of advies), digitale pathologie gecombineerd met de expertise in de histologie en geautomatiseerde TMA arraying 12. Samen, wordt dit concept genaamd volgende generatie Tissue microarray (ngTMA). Hieronder is een protocol voor ngTMA beschreven op basis van een voorbeeld van de 134 patiënten met gemetastaseerd colorectaal carcinoom. Hier, primaire tumoren evenals lymfkliermetastasen en levermetastasen worden getooid in ngTMAs voor verdere biomarker analyse. Daarnaast kleine weefsel kernen van elke patiënt worden gewenst voor toekomstige nucleïnezuur extractie.

Protocol

OPMERKING: Deze studie is door de lokale ethische commissie van de Insel Ziekenhuis, Bern, Zwitserland (07-10-13) goedgekeurd. Weefsels werden verkregen van de Tumor bank Bern, Instituut voor Pathologie van de Universiteit van Bern.

1 Planning and Design (Consulting)

  1. Denk na over de onderzoeksvraag te beantwoorden. Bepaal de weefselsoorten worden opgenomen in het project. Bepalen welke histologische structuren zijn belangrijk om de vraag te beantwoorden.
  2. Vast te stellen de meest bruikbare kern diameter en het aantal cores per patiënt voor het project. Beslissen over het aantal exemplaren van de volgende generatie Tissue Micro Array (ngTMA) op basis van het bedrag van de biomerkers te onderzoeken.
  3. Overweeg statistische aspecten zoals de steekproefomvang en analyse na de tissue microarray (TMA) is opgebouwd. Bepaal het aantal patiënten voor opname in de studie en controle weefsels vast te stellen voor de array.
  4. Haal de histologische (ofdiagnostische) Haematoxyline en Eosine (H & E) dia's van elke patiënt. Beknopt overzicht van de dia's en identificeren van degenen met relevante informatie en histologie voor het project.
    OPMERKING: Maak nieuwe secties van de paraffine blokken, indien bijzondere beits of immunohistochemie dia gewenst is voor het scannen en annotatie glijbaan, in plaats van H & E slides

2 dia's scannen

  1. Schakel de PC en diascanner en geopend scansoftware. Selecteer "automatische modus" voor helderveld scannen vanaf het voorbeeldscherm.
  2. Klik op "scan opties" om dia kwaliteit parameters aan te passen. Op dit moment kiezen of dia's worden direct gescand om het digitale platform toegankelijk door web of naar een lokaal station (of externe schijf) en stel het type scan en het aantal scherpstelpunten.
  3. Klik op "Server Parameters" om te scannen naar de "zaak center". Bij deze stap, voeg meer magazines, labelen alle dia's en stelde map in de zaak Center waar de dia's moeten worden opgeslagen. Elk tijdschrift kan tot 25 dia's.
  4. Controleer de kwaliteit / netheid van de werkelijke histologische coupes voor het scannen. Eventueel schone objectglaasjes met 70% ethanol.
  5. Plaats maximaal 25 dia's per magazine met de labels te wijzen naar binnen (Figuur 3A)
  6. Leg het blad in de scanner. Voor meer dan een blad, leg ze op elkaar.
  7. Start het scannen van dia door te klikken op de groene pijl (Figuur 3B). Wanneer alle dia's worden gescand, het lossen van de tijdschriften en uitschakeling van het programma, PC en dia scanner.

3 Digitale Schuif Annotatie

  1. Voer de browser het adres voor digitale foto management center en download de gratis digitale dia viewer software.
  2. Open de digitale foto-viewer software en selecteer de map met de digitale dia's (Figuur 4A).
  3. Notities toevoegen, ordenen en beheren van de digital folder dia of gebruikersrechten toewijzen aan collega's of bijlagen toe te voegen aan de map.
  4. Klik op de gewenste digitale dia die in de digitale foto-viewer wordt weergegeven.
  5. Met behulp van de vergroting tool, evalueren van de glijbaan en vind de gebieden van belang voor de integratie in de ngTMA.
  6. Met behulp van de 'TMA annotatie tool', selecteert u het formaat van de gewenste kern en de kleur van de annotatie. Plaats de annotatie op de digitale dia door erop te klikken (Figuur 4B).
  7. Verplaats de annotatie de gewenste histologische structuren voor inbouw in het ngTMA (Figuur 4C).
  8. Herhaal dit proces van annotatie weer met behulp van de annotatie tool, het selecteren van een kern van de grootte en de gewenste annotatie kleur. Herhaal de dia bekijken en annotatie op alle dia's in de map.
  9. Als alternatief plaatst weefsel kernen voor PCR in 0,2 ml buizen in plaats van integratie in de TMA. Annoteren dia's met behulp van een andere kleur te identificerendeze vlekken voor verdere moleculaire analyse.
  10. Maak een lijst van alle gevallen met de bijbehorende aantekeningen en kleuren.

4 Tissue microarray Bouw

  1. Haal de overeenkomstige paraffine weefsel blokken voor alle geannoteerde digitale dia's, blokken sorteren in de gewenste volgorde voor tissue microarraying.
  2. Zorg ervoor dat het weefsel blokken hebben een minimum van 4 mm dikte. Zo niet, reembedding weefsel noodzakelijk.
  3. Zet de PC "ON" en geautomatiseerde weefsel microarrayer instrument. Open het weefsel microarrayer software en geef een naam aan het project
  4. Voer een "Tool Change" en selecteer de gewenste diameter van het gereedschap voor het project (dat wil zeggen, 0,6, 1,0, 1,5 of 2,0 mm).
  5. Plaats maximaal 12 "ontvanger" TMA blokken in de machine. Geef een ID aan elk van de 12 blokken
  6. Maak een TMA-out voor elke ontvanger blok. Observeer een TMA ontwerp met aantal rijen, kolommen en empty lijnen evenals de afstand tussen kernen. Maak een nieuwe lay-out voor elke ontvanger blok of gebruik maken van dezelfde lay-out herhaaldelijk.
  7. Plaats de cursor op de ontvanger blok lay-out van de eerste kern nemen.
  8. Vervolgens laadt tot 60 donorblokken in het weefsel microarrayer (figuur 5A). Plaats tien blokken in elke rij A tot en met F. Geef elk blok een donor ID. Observeer afbeeldingen van elke donor blok op het computerscherm automatisch door het weefsel microarrayer verworven.
  9. Te beginnen met het eerste blok, klik op "Slide". Let op de geannoteerde digitale dia opgeslagen in de digitale dia management center (of op de externe schijf) met behulp van de digitale dia viewer. Bekijk het beeld van het donorblok en de digitale slide side-by-side.
  10. Selecteer referentiepunten op de afbeelding van het blok op de foto om de donor blok superimpose met de digitale dia
  11. Na het klikken op "Next", observeert de annotaties op een grotere afbeelding van het blok. (Figuur 5B </ Strong>). Klik bovenaan in de annotaties te bevestigen en klik op "Start".
    OPMERKING: Dit vraagt ​​het weefsel microarrayer te beginnen boren van een gat van 0,6 mm in diameter in het ontvangende blok op het gekozen startpunt. Vervolgens in een tweede stap, met het ponsgereedschap het instrument slaat gat in het weefsel van de geselecteerde donor blok precies geannoteerde bevestigd regio. Kernen worden vervolgens overgebracht van de donor tot de ontvanger blok.
  12. Na ongeveer 500 cores, het reinigen van de boor en ponsen machine met behulp van een wattenstaafje of xyleen.
  13. Als weefsel kernen gewenst zijn (in plaats van stoten in een ngTMA), klikt u op de "PCR" tool voor het blok, bevestigen tot 4 annotaties en klik op "Start". Dit zal slaan en de overdracht van de kernen in een 0,2 ml tube.
  14. Herhaal punt 4,9-4,11 tweede donorblok, enzovoort.
  15. Na het gebruik van de donor blokken, geef een tweede ronde van donorblokken (61-120) in het weefsel microarrayer en blijven stappen 4,8-4,11.
  16. Vernieuwen donor en ontvanger blok beelden terwijl de voortgang van het project tijdens het boren en ponsen plaatsvindt (figuur 5C).
  17. Voer een "Export" nadat het project is voltooid. Zoek het .xslx bestand met de donor en de ontvanger blok IDs, de lokalisatie van alle stempels binnen de TMA als de TMA layout / design, in de geëxporteerde map. Sla alle donor blok beelden met alle gesuperponeerd annotatie als jpg beelden in de geëxporteerde map (Figuur 5D). Het uiteindelijke TMA blok is dan klaar.

Representative Results

Planning and Design

Hier het voorbeeld van de 134 patiënten met uitgezaaide darmkanker die worden onderzocht voor een bepaalde serie van biomarkers werd gebruikt. Niet alleen is een ngTMA gepland voor deze patiënten, maar DNA-extractie gevolgd door mutatieanalyse van sommige specifieke gen.

Tijdens de planning en het ontwerp fase van ngTMA, zijn de volgende aspecten is besloten. Van elke patiënt, zullen 6 verschillende histologische regio's worden onderzocht: tumor centrum, tumor invasie voor, delen van dichtste tumor ontluikende (tumor / stroma interactie), normaal weefsel, lymfkliermetastasen en uitzaaiingen in de lever. Drie tumor spots per tumorweefsel stippellijn twee normaal weefsel plekken worden opgenomen in het project (n = 17 spots per patiënt). Aangezien het is de bedoeling dat er meer dan 50 biomarkers worden onderzocht op deze patiëntenmateriaal worden twee exemplaren van de laatste ngTMA gewenst. Vanwege de mogelijke kleine omvang van lymfeklier en distant metastasen, wordt een kleine kerndiameter van 0,6 mm voor TMA bouw voor alle weefsels opstelling.

Daarnaast is het de bedoeling dat elk gebied afzonderlijk worden bekleed, zodat 6 ngTMAs met verschillende histologische gebieden worden geproduceerd: een ngTMA die weefsels van de a) tumor centrum b) invasiefront, c) tumor budding gebieden, d) normaal weefsel , e) lymfklier metastasen, en f) levermetastasen.

Voor de TMA ontwerp met behulp van een 0,6 mm tool, zal een comfortabele afstand van 0,4 mm tussen de stoten worden geselecteerd. Omdat de evaluatie van weefsel plekken in lange rijen en kolommen is vaak vermoeiend, zijn twee verschillende ontwerpen gekozen. Voor tumor blokken met 3 stoten per weefsel gebied, is een ontwerp met zes delen gemaakt. Dit leidt tot een totaal van 402 weefsel stoten. Voor normaal weefsel stoten, 2 stempels per geval moeten worden opgenomen. Een lay-out aanbrengen van 432 slagen in totaal wordt gekozen.

Bovendien, voor elk geval, tot 4cores op 0,6 mm zal bovendien worden gestanst en geplaatst in 0,2 ml buizen. Deze weefsel kernen zullen ook worden geannoteerd.

Om samen te vatten, zal 6 ngTMAs van verschillende weefsels worden geproduceerd (5 tumor arrays x 3 stoten x 134 patiënten; 1 normaal weefsel-array x 2 stoten x 134 patiënten) in aanvulling op 4 cores per patiënt voor buizen. Samen zorgen 2814 aantekeningen gemaakt.

Vervolgens worden de overeenkomstige H & E slides van geselecteerde patiënten worden opgehaald uit de dia archief. Elk geval wordt kort beoordeeld door een patholoog en meest representatieve dia's van elk type weefsel zijn geselecteerd.

Scannen

Digitale dia's van elk histologische sectie worden gemaakt voor toekomstige annotatie. Voor deze studie, 3-4 weefsel dia gescand moeten worden per geval, dat wil zeggen, de primaire colorectale kanker, met of zonder de aangrenzende normale weefsels, lymfkliermetastasen en levermetastasen en eventueel een extra dia conTaining normale slijmvlies.

Maximaal 10 verschillende tijdschriften kunnen volledig in de dia scanner worden geladen; dus 250 dia's kunnen worden gescand in een enkele run. Tijd voor het scannen en digitale schuif varieert met de afmetingen van het weefsel en de kwaliteitsfactor gewenst. De kwaliteitsfactor varieert van 0 tot 100 Hierbij wordt een kwaliteitsfactor 60 geselecteerd, omdat de mate kleiner scanbestand formaat zonder merkbaar verlies van kwaliteit scan. Kleine biopsieën kunnen worden gescand in minder dan 30 seconden terwijl hele weefselsecties, zoals die in dit voorbeeld kan 2 tot 10 minuten duren. Digitale slide grootte kan ook variëren van 2 MB tot 2 GB. Met een kwaliteitsfactor van 60, scant tussen 600 MB en 1 GB geproduceerd.

Tussen 402 en 536 dia's zijn nodig voor dit project in totaal 3 scannen loopt. Elke run wordt 's nachts uitgevoerd. Ongeveer 500 GB aan opslagruimte nodig is. Dia's worden direct gescand op een digitaal platform genaamd Case Center (ngtma.unibe.pathcasecenter). Case Center is toegankelijk vanaf elke locatie met internet toegang door het invoeren van de aangewezen gebruikersnaam en wachtwoord.

Annotatie

Voor annotatie, moet twee aspecten worden beschouwd: 1) verschillende weefsel gebieden, moeten verschillende annotatie kleuren en 2) het aantal annotaties moet het aantal gewenste exemplaren van de laatste ngTMA weerspiegelen.

In dit geval zijn 3 spots per tumor stippellijn een enkele kopie geselecteerd. Voor 2 kopieën, moet elke regio worden geannoteerd met 6 plekken. Nuttig is groen voor normaal weefsel, blauw voor de tumor centrum, geel voor de tumor invasie voor, rood voor gebieden van de tumor ontluikende (tumor / stroma) interactie, zwart voor lymfkliermetastasen, turkoois voor metastasen op afstand en uiteindelijk wit voor de regio's te zijn voor buizen. Annotatie van elk geval vereist 2-3 min.

ngTMA Bouw

Deze studie vereist 6 ngTMA blokken to worden gebouwd in 2 exemplaren, wat resulteert in 12 def blokken. Het maximum aantal geadresseerde blokken die kan worden ondersteund door de array-is 12. Elke tumor blok 402 weefsel spots bevatten en elk normaal weefsel blok 268 plekken, in totaal 4556 plekken over het hele project bevatten.

Een TMA layout is gemaakt voor elke ontvanger blok en het project wordt opgeslagen (Figuren 6A, 6B). 60 weefsel blokken kunnen in het weefsel microarrayer parallel worden geladen; een afbeelding van elke donor blok wordt genomen. Te beginnen met de eerste donor blok, wordt het overeenkomstige geannoteerde digitale dia opgehaald uit Case Center. Dia matching wordt uitgevoerd, die kan tussen de 1-3 minuten. Annotaties worden bevestigd en de array-wordt gevraagd om te beginnen met ponsen (figuur 7). Core ponsen en transfertijd is ongeveer 12 sec. Verlies aders tijdens deze procedure is minimaal. Totale tijd voor rangschikken van dit project is ongeveer 24 uur, met inbegrip van de tijd voor slide / block matching en opnieuw laden van het instrument. Enkele voorbeelden van ngTMA zijn geïllustreerd in figuur 8A. Kernen voor verdere moleculaire analyse kan ook worden gestanst in deze tijd (figuur 8B).

Figuur 1
Figuur 1 A) een 'donor' block. Kernen van de donor blok worden gestanst en overgebracht in B) een ontvanger blok, of tissue microarray (TMA).

Figuur 2
Figuur 2 De conventionele tissue microarray workflow. A) histologische coupes worden opgehaald uit het archief en B) gegeven aan de patholoog f of beoordeling. CD) annotaties zijn gemaakt op de dia's geeft aan de 'schatting' regio voor de overdracht. E) De bijbehorende weefsel blokken worden opgehaald. F) Blok en glijbaan zijn vergeleken voor matching, die kan G) soms een uitdagende taak zijn. HJ ) Tissue microarraying vindt dan plaats. K) Cores worden herhaaldelijk overgebracht en L) een laatste TMA is opgebouwd.

Figuur 3
Figuur 3 A) tot 25 slides in elk magazijn voor het scannen. B) Aanpassingen worden geplaatst om de kwaliteitsfactor en grootte worden gemaakt. Scanning voortgang kan worden gevolgd.

"Src =" / files / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
Figuur 4 A) Gescande dia's kunnen worden geüpload naar het web-based platform, Case Center. B) digitale dia's kunnen worden bekeken. De TMA annotatie tool stelt de gebruiker in staat om de kern van de grootte en de kleur die nodig is voor annotatie. C) annotaties kan direct op de digitale dia geplaatst worden te selecteren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5 A) Tot 60 blokken kunnen in het weefsel microarrayer, namelijk 10 donorblokken per rij en 12 ontvangers blokken ook. B) Een beeld van elke donor blok geladen wordt genomen, de digital slide wordt opgehaald. Matching van blok en schuif wordt gedaan en annotaties worden gebruikt voor blok ponsen. C) De voortgang van de arraying kan worden bewaakt, terwijl het instrument wordt ponsen. D) Na het ponsen wordt uitgevoerd, een export van de locatie van elke plek in de lay-out, maar ook een beeld van elke donor blok met bijbehorende aantekeningen gemaakt.

Figuur 6
Figuur 6. Deze TMA layouts werden gebruikt voor het rangschikken van A) tumormateriaal en B) normale weefsels.

Figuur 7
Figuur 7. Screenshot van het weefsel microarrayer software. Links, 12 regeadres- seerde blokken in het instrument worden geplaatst. Onderaan, zijn afbeeldingen van elke donor blok genomen. In het centrum, de TMA-lay-out, wordt de voortgang van het ponsen en vergrote afbeeldingen van elke donor blok met aantekeningen gevonden.

Figuur 8
Figuur 8 A) Enkele voorbeelden van nieuw gecreëerde ngTMA blokken. B) Aanvullende weefsel stoten kan worden genomen voor verdere moleculaire analyse. Deze kernen worden uitgestanst en geplaatst in 0,2 ml buizen.

Figuur 9
Figuur 9 Voorbeelden van ngTMA biomarker toepassingen. A) Immunohistochemistry kleuring van Ki67 bij darmkanker. Dual HER2 immunohistochemie / in situ hybridisatie assay geeft B) lage expressie van eiwit (bruin) en geen amplificatie van het Her2 gen (zwart) ten opzichte van het centromeer (rood); C) hoge expressie van het eiwit (bruin) en Her2 genamplificatie ( zwart) ten opzichte centromeer (rood). D) chromogene in situ hybridisatie van Her2 geeft enkel mRNA transcripten in borstkanker ngTMA. E) Immunohistochemie voor CD8 in colorectale kanker. F) Dubbele immunohistochemische kleuring voor pan-cytokeratin marker AE1 / AE3 (bruin; tumorcellen) en CD68 (rood;. Macrofagen) benadrukking van de tumor micro-omgeving in colorectale kanker Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

In deze paper wordt een protocol voor ngTMA geschetst. ngTMA is een nieuw opgerichte concept voor tissue microarraying waarbij planning en ontwerp, digitale pathologie en dia annotatie evenals geautomatiseerde weefsel microarraying 12.

Vergeleken met conventionele weefsel microarraying, ngTMA biedt vele voordelen. In een eerste stap, de planning en ontwerpfase kritisch. De focus ligt op het beantwoorden van een gerichte onderzoeksvraag. Hierbij moet rekening worden gehouden met de histologische aspecten (bijvoorbeeld welke regio en hoeveel plekken wil ik onder andere?), De statistische planning (bijvoorbeeld steekproefgrootte? Hoe analyseer ik mijn monsters later?) En logistieke overwegingen (bijvoorbeeld hoe vele biomarkers en dus hoeveel ngTMA kopieën?). Een specifieke ngTMA is gemaakt voor specifieke behoeften, of het nu voor biomarker screening en high-throughput of bedoeld om specifieke histologische aspecten te bestuderen op slechts een paar goed gekozen cases.

One, zo niet de, belangrijkste nadeel van conventionele tissue microarraying is de lage nauwkeurigheid waarmee markeringen op de histologische coupes worden gemaakt. De studie van specifieke histologische structuren, cellen of gebieden is vrijwel onmogelijk. ngTMA zorgt voor hoge precisie omdat aantekeningen direct aan de digitale glaasjes geplaatst. Hierdoor kan de onderzoeker aan de regio's nauwkeurig selecteren die moet worden geslagen, met inbegrip van specifieke cellen. In dit voorbeeld worden verschillende gebieden binnen hetzelfde weefsel blok doorgestoken voor rangschikken van, zoals het tumor centrum, de invasiefront en verwijdering van tumor / stroma interactie benadrukt door de aanwezigheid van kleine tumorcel clusters of zelfs enkele cellen. Deze nauwkeurigheid kan alleen worden bereikt met ngTMA. Ten derde, omdat de dia's worden gescand op een web-based digitaal platform, schuift het bekijken en annoteren kan worden gemaakt door middel van de computer in plaats van met de microscoop. Het weefsel arraying software biedt een gebruikersvriendelijkeinterface met een grote flexibiliteit, dus verschillende layouts en ngTMA ontwerp kan worden bereikt. Aangezien TMA constructie automatisch wordt uitgevoerd door het boren, is er weinig noodzaak voor praktische manoeuvreren en de hoeveelheid tijd voor de bouw aanzienlijk verminderd. De tijd voor TMA bouw in dit voorbeeld hier tussen 24 uur. Met behulp van een conventionele TMA aanpak en het schatten van 15 slagen per uur, zou dit project ongeveer 304 uur duren.

ngTMA kan op eiwitexpressie mRNA of DNA alsook combinaties van deze onderzoeken. Figuur 9 illustreert verscheidene van deze toepassingen potentiële biomarkers. Standaard immunohistochemie kan worden toegepast op de celproliferatie kanker met Ki-67 bepalen. Een gecombineerde benadering van eiwitexpressie en DNA amplificatie voor genen zoals HER2 onderzoeken worden gebruikt. Weefsels kunnen verzameld worden op een enkele ngTMA om kosten, gebruik weefsel en andere bron te verminderens. Bovendien kunnen chromogene mRNA in situ hybridisatie voor HER2 en andere genen worden uitgevoerd om enkel mRNA transcripten in een groot aantal gevallen met een minimaal aantal weefselobjectglaasjes identificeren. Immunohistochemie van immune merkers zoals CD8 kan worden gevisualiseerd in de context van de tumor micro-omgeving. Dubbele immunohistochemie kan ook worden gebruikt om bepaalde gebieden van belang te benadrukken zoals uitwisseling tussen immuuncellen (geëtiketteerd rood) en tumorcellen (bruin gemarkeerd) en invasiefront kankers. Zulk een regio van belang kon niet worden gevangen met behulp van conventionele weefsel microarraying.

Toch, dit protocol bevat een aantal beperkingen. De grootste uitdaging is de overlap tussen donor blok en digitale schuif. Verschillende factoren kunnen deze stap te beïnvloeden. Ten eerste moet het laatste gedeelte van het blok worden gebruikt voor dia's scannen. In veel gevallen, de H & E is niet het laatste gedeelte van het donorblok, rather is een immunohistochemische of andere vlekken. In dit geval, ook bevlekt dia kan worden zolang als de laatste vlek wordt gescand en geannoteerde of een nieuwe H & E moet worden. Zorg moet ook worden genomen bij de coupes worden gemaakt als weefsels kunnen uitbreiden in het waterbad, die leidt tot een uitdagende matching van de glijbaan en blok. Tweede momenteel projecten slechts 12 ontvanger TMA blokken verwerkt in een keer. Grotere projecten van meer dan 12 TMA's moet worden toegewezen aan een tweede naam van het project. Ten derde moet de donorblokken worden gemaakt met standaard mallen en cassettes als instrument kan zich niet aanpassen aan verschillende afmetingen. Tenslotte moet donorblokken de minimale hoogte (4 mm) boren optimale bereiken overschrijden. In veel gevallen vereist reembedding van weefsels.

Honderden publicaties in de afgelopen jaren wijzen op de TMA als een waardevol instrument voor biomarker onderzoek. TMA's zijn gebruikt om long 13, colorectale 7, bre bestuderenast 14, prostate 15, 16 pancreas, blaas 17 en 18 maag kanker, een paar te noemen. Een toenemend aantal auteurs hebben het gebruik van TMA met beeldanalyse en belangrijke stappen worden gemaakt in deze richting 19-21 gecombineerd. Echter, naast een handvol onderzoeksgroepen die innovatieve ideeën TMA 22-24 hebben gepubliceerd, weinig aandacht is gegeven aan de TMA techniek zelf te optimaliseren. Geautomatiseerde weefsel microarrayers, zoals de ATA-27 door Estigen / Beecher geven wel de lay-out ontwerp en de doelmatige en geautomatiseerde weefsel ponsen. Dit is echter slechts 1 aspect van de ngTMA concept.

ngTMA is een aanzienlijke verbetering ten opzichte van conventionele tissue microarraying technieken. Het bevat deskundigheid in histologie en TMA ontwerp met de flexibiliteit van digitale pathologie en de precisie van digitale annotaties met de snelheid en betrouwbaarheid van geautomatiseerde TMA constructie. De combinatie van ngTMEen en beeldanalyse voor de evaluatie van eiwitten en moleculaire biomarkers zal een krachtig instrument om verdere verbetering van de kwaliteit van het klinisch en translationeel onderzoek in de toekomst.

Acknowledgments

De auteurs willen graag de technische staf van het Translational Research Unit bedanken; Mary Economou, Jose Galván, Caroline Hamer, Dominique Müller, Liliane Schöni en Informatica Team aan het Instituut voor Pathologie van de Universiteit van Bern.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pannoramic 250 Flash II 3DHistech Slide scanner
TMA Grandmaster 3DHistech Tissue Microarrayer
Pannoramic Viewer 3DHistech free Slide viewing software
Case Center 3DHistech Digital slide platform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, 844-847 (1998).
  2. Tzankov, A., Went, P., Zimpfer, A., Dirnhofer, S. Tissue microarray technology: principles, pitfalls and perspectives--lessons learned from hematological malignancies. Exp Gerontol. 40, 737-744 (2005).
  3. Barlund, M., et al. Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis. J Natl Cancer Inst. 92, 1252-1259 (2000).
  4. Bubendorf, L., et al. Survey of gene amplifications during prostate cancer progression by high-throughout fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays. Cancer Res. 59, 803-806 (1999).
  5. Garcia-Caballero, T., et al. Dual-colour CISH is a reliable alternative to FISH for assessment of topoisomerase 2-alpha amplification in breast carcinomas. Breast Cancer Res Treat. 81-89 (2014).
  6. Schraml, P., et al. Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types. Clin Cancer Res. 5, 1966-1975 (1999).
  7. Zlobec, I., et al. Role of RHAMM within the hierarchy of well-established prognostic factors in colorectal cancer. Gut. 57, 1413-1419 (2008).
  8. Hsu, F. D., et al. Tissue microarrays are an effective quality assurance tool for diagnostic immunohistochemistry. Mod Pathol. 15, 1374-1380 (2002).
  9. Marin, C., et al. Detection of BRAF p.V600E Mutations in Melanoma by Immunohistochemistry Has a Good Interobserver Reproducibility. Arch Pathol Lab Med. 71-75 (2014).
  10. Polley, M. Y., et al. An International Ki67 Reproducibility Study. J Natl Cancer Inst. 1897-1906 (2013).
  11. Zlobec, I., Terracciano, L., Jass, J. R., Lugli, A. Value of staining intensity in the interpretation of immunohistochemistry for tumor markers in colorectal cancer. Virchows Arch. 451, 763-769 (2007).
  12. Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: an example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types. J Transl Med. 11, 104 (2013).
  13. Yoshida, A., et al. Immunohistochemical detection of ROS1 is useful for identifying ROS1 rearrangements in lung cancers. Mod Pathol. 711-720 (2014).
  14. Droeser, R., et al. Differential pattern and prognostic significance of CD4+, FOXP3+ and IL-17+ tumor infiltrating lymphocytes in ductal and lobular breast cancers. BMC Cancer. 12, 134 (2012).
  15. Fleischmann, A., et al. Androgen receptors are differentially expressed in Gleason patterns of prostate cancer and down-regulated in matched lymph node metastases. Prostate. 71, 453-460 (2011).
  16. Wang, T., et al. Pattern of breast cancer susceptibility gene 1 expression is a potential prognostic biomarker in resectable pancreatic ductal adenocarcinoma. Pancreas. 42, 977-982 (2013).
  17. Fleischmann, A., Rotzer, D., Seiler, R., Studer, U. E., Thalmann, G. N. Her2 amplification is significantly more frequent in lymph node metastases from urothelial bladder cancer than in the primary tumours. Eur Urol. 60, 350-357 (2011).
  18. Zhang, Z. Q., et al. Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray. World J Gastroenterol. 19, 7795-7803 (2013).
  19. Chaux, A., et al. The epidermal growth factor receptor is frequently overexpressed in penile squamous cell carcinomas: a tissue microarray and digital image analysis study of 112 cases. Hum Pathol. 44, 2690-2695 (2013).
  20. McKenna, S. J., Amaral, T., Akbar, S., Jordan, L., Thompson, A. Immunohistochemical analysis of breast tissue microarray images using contextual classifiers. J Pathol Inform. 4, S13 (2013).
  21. Pages, F., et al. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med. 353, 2654-2666 (2005).
  22. Komiya, A., et al. Application of a new technique, spiral tissue microarrays constructed using needle biopsy specimens, to prostate cancer research. Int J Oncol. 44, 195-202 (2014).
  23. Quintayo, M. A., et al. Virtual tissue microarrays: A novel and viable approach to optimising tissue micro-arrays for biomarker research applied to Ductal Carcinoma in Situ (DCIS). Histopathology. 2-8 (2014).
  24. Torata, N., et al. Tissue tablet method: an efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray. Hum Pathol. 45, 143-152 (2014).
Een volgende generatie Tissue microarray (ngTMA) Protocol voor Biomarker Studies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).More

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter