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Medicine

Un tissu microarray de nouvelle génération (ngTMA Protocol) pour les études de biomarqueurs

doi: 10.3791/51893 Published: September 23, 2014

Summary

Le protocole vise à optimiser la construction et la qualité des puces de tissus pour la recherche de biomarqueurs. Il comprend des aspects de la planification et de la conception, de la pathologie numérique, toboggan annotation virtuel, et de formation de réseau de tissu automatisé.

Abstract

la recherche de biomarqueurs s'appuie sur des puces tissulaires (TMA). TMA sont produites par le transfert répété de petites carottes de tissu à partir d'un bloc de «donneur» dans un bloc "destinataire" et ensuite utilisé pour une variété d'applications de biomarqueurs. La construction du TMA classique est de main-d'œuvre, imprécis, et de temps. Ici, un protocole utilisant tissue microarrays de prochaine génération (ngTMA) est décrite. ngTMA est basé sur la planification et la conception de TMA, de la pathologie numérique, et microréseau tissulaire automatisé. Le protocole est illustré par un exemple de 134 patients atteints de cancer colorectal métastatique. Aspects histologiques, statistiques et logistiques sont pris en compte, tels que le type de tissu, les régions histologiques spécifiques, et les types de cellules à inclure dans la TMA, le nombre de spots de tissu, taille de l'échantillon, l'analyse statistique, et le nombre de copies de la TMA. Lames histologiques pour chaque patient sont numérisés et téléchargés sur une plate-forme numérique en ligne. Là, ils sont perçus et annotated (marqué) à l'aide d'un outil de diamètre 0,6 à 2,0 mm, de multiples fois en utilisant différentes couleurs pour distinguer les zones de tissu. blocs de donateurs et 12 blocs «bénéficiaires» sont chargés dans l'instrument. Diapositives numériques sont récupérés et adaptés à bloquer les images des bailleurs de fonds. Formation de réseaux répétée des régions annotées est automatiquement effectuée entraîne un ngTMA. Dans cet exemple, six ngTMAs sont prévus contenant six types de tissus différents / zones histologiques. Deux exemplaires des ngTMAs sont souhaitées. Trois à quatre lames pour chaque patient sont analysés; 3 pistes d'analyse sont nécessaires et effectué la nuit. Toutes les lames sont annotés; différentes couleurs sont utilisées pour représenter les différents tissus / zones, à savoir le centre de la tumeur, l'invasion avant, tumeur / stroma, métastases ganglionnaires, métastases hépatiques, et les tissus normaux. 17 annotations / cas sont faites; temps pour l'annotation est de 2-3 min / cas. 12 ngTMAs sont produits contenant 4556 points. Temps rangeant est de 15-20 heures. Grâce à sa précision, flexibilité et rapidité, ngTMA est un puissantoutil pour améliorer la qualité des TMA utilisé en recherche clinique et translationnelle.

Introduction

Au cours des deux dernières décennies, tissue microarrays (TMA) ont eu un impact remarquable sur les études d'enquête sur les biomarqueurs. TMA sont essentiellement des tissus «archives» produites par le transfert répété de petites carottes de tissu, généralement allant de la taille de 0,6 à 2,0 mm de diamètre, de paraffine blocs «donateurs» en un seul bloc "bénéficiaire" TMA (Figure 1) 1. En utilisant une petite taille de base, environ 500 différents endroits de tissus de peu ou beaucoup de patients différents peuvent être disposés dans un TMA-2.

L'utilisation de TMA pour des études de biomarqueurs pronostiques ou prédictifs présente de nombreux avantages. Prenons l'exemple où l'expression d'un biomarqueur protéique par immunohistochimie doit être évaluée sur 450 patients. Plutôt que d'effectuer les taches 450 immunohistochimiques sur les lames 450 patients en coupe du même nombre de blocs, de petits noyaux de chaque échantillon peuvent être disposés sur un seul Tbloc de MA. Même si plusieurs cœurs sont prélevés de chaque patient individuel, un nombre minimum de blocs sont produits. Cela a pour effet de diminuer considérablement considérablement les coûts et d'autres ressources ainsi que la réduction de détérioration des tissus. En outre, cette étude permet alimenté de façon appropriée au moyen d'un grand nombre de tissus à être évaluées dans les mêmes conditions expérimentales.

TMA ont de nombreuses applications différentes. Par exemple, ils peuvent être utilisés pour étudier la morphologie, l'expression des protéines, l'expression d'ARN et d'ADN suivantes aberrations coloration avec des colorants différents, ou après l'immunohistochimie ou même chromogène et hybridation fluorescente in situ en 7.3. Des études récentes ont également utilisé TMA pour tester la variation intra et inter dans les protocoles de coloration, d'établir la spécificité ou la sensibilité des anticorps pour les mutations de gènes spécifiques, et pour déterminer la reproductibilité inter-observateur de l'expression de protéines dans des collaborations internationales

La construction du TMA traditionnelle en utilisant des tissus de patients dérivés est une longue procédure en plusieurs étapes (figure 2). Il commence par une recherche d'éventuels cas appropriés et la sélection des diapositives de diagnostic des archives à un institut de pathologie, ou autre institut, d'où ils sont extraits. Le pathologiste évalue chaque diapositive par cas et sélectionne la diapositive la plus représentative pour les fins de l'étude. Ensuite, la région d'intérêt est marqué à l'aide d'un stylo, directement sous le microscope. C'est souvent difficile et imprécise et entraîne uniquement une «estimation» de l'endroit où poinçons de tissus doivent être prélevés. Ensuite, les blocs de paraffine correspondant à ces diapositives marqués sont récupérés à partir de l'archive. Une comparaison rapide entre le bloc et lame est faite. L'utilisation d'un semi-automatisé arrayer maison ou un tissu, le bloc donneur est percé dans la région d'environ intérêt et transféré dans un bloc receveur TMA. Construction de TMA en utilisant cette technique de formation de réseau est de main-d'œuvre, de temps, imprécis, et inflexible. Préparation d'une TMA de 475 points en 3 exemplaires est estimée à environ 84 heures de travail.

Une nouvelle approche de la construction de TMA a été récemment mis en place par l'Institut de pathologie de l'Université de Berne qui repose sur trois composantes: la planification et la conception (ou conseil), la pathologie numérique combinée à une expertise de l'histologie et automatisé TMA rangeant 12. Ensemble, ce concept est appelé prochaine génération de puces à ADN de tissus (ngTMA). Ci-dessous, un protocole pour ngTMA est décrite sur la base de, par exemple, de 134 patients atteints d'un cancer colorectal métastatique. Ici, des tumeurs primaires ainsi que des métastases des ganglions lymphatiques et les métastases hépatiques sont à être rangé dans ngTMAs pour l'analyse ultérieure de biomarqueurs. En outre, de petites carottes de tissus provenant de chaque patient sont désirés pour l'avenir extraction d'acide nucléique.

Protocol

NOTE: Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique local de l'Hôpital de l'Île, Berne, Suisse (10/07/13). Les tissus ont été obtenus à partir de la banque de tumeurs de Berne, Institut de pathologie de l'Université de Berne.

1 Planification et conception (Consulting)

  1. Pensez à la question de recherche à y répondre. Décider sur les types de tissus à être inclus dans le projet. Déterminer quelles sont les structures histologiques sont importants pour répondre à la question.
  2. Vérifier le diamètre de base le plus utile et le nombre de cœurs par patient pour le projet. Décider du nombre de copies du tissu de nouvelle génération Micro Array (ngTMA) en fonction de la quantité de biomarqueurs à étudier.
  3. Examiner les aspects statistiques telles que la taille et l'analyse des échantillons après le tissu microarray (TMA) est construit. Déterminer le nombre de patients à inclure dans l'étude et établir des tissus de contrôle pour le réseau.
  4. Récupérer la histologique (oudiagnostic) hématoxyline et de l'éosine (H & E) des diapositives de chaque patient. Brièvement en revue les diapositives et d'identifier ceux contenant des informations et histologie pertinente pour le projet.
    REMARQUE: Faire de nouvelles sections des blocs de paraffine, si la tache spéciale ou immunohistochimie diapositive est souhaitée pour la numérisation de diapositives et l'annotation, au lieu de lames H & E

2 Faites glisser la numérisation

  1. Tournez sur PC et scanner de diapositives et logiciel de numérisation ouverte. Sélectionnez "mode automatique" pour la numérisation de champ lumineux de l'écran d'aperçu.
  2. Cliquez sur "options d'analyse" pour régler les paramètres de qualité de diapositives. A cette époque, sélectionnez si les diapositives doivent être directement scannés à la plate-forme numérique accessible par Internet ou sur un disque local (ou disque dur externe) et définir les types de balayage et le nombre de points de discussion.
  3. Cliquez sur "Paramètres du serveur" pour numériser vers le «centre de l'affaire". À cette étape, ajouter plus de magazines, d'étiqueter toutes les lames et réglerle dossier dans l'affaire Center où les lames doivent être stockées. Chaque magasin peut contenir jusqu'à 25 lames.
  4. Vérifiez la qualité / propreté de réels lames histologiques pour la numérisation. Si nécessaire, des lames propres avec 70% d'éthanol.
  5. Chargez jusqu'à 25 lames par le magazine avec les étiquettes pointant vers l'intérieur (figure 3A)
  6. Placer le chargeur dans le scanner. Pour plus d'un magasin, de les placer au-dessus de l'autre.
  7. Démarrez le balayage diapositive en cliquant sur ​​la flèche verte (figure 3B). Lorsque toutes les diapositives sont numérisées, décharger les magazines et éteindre le scanner programme, PC et un toboggan.

3 diapositives numériques à l'annotation

  1. Entrez l'adresse du navigateur pour le centre de gestion de diaporama numérique et télécharger le logiciel numérique libre lame de spectateur.
  2. Ouvrez le logiciel de visualisation numérique coulissant et sélectionnez le dossier contenant les diapositives numériques (figure 4A).
  3. Ajouter des notes, réorganiser et gérer la digital dossier de diapositives ou de céder des droits d'utilisateur à des collègues ou ajouter des pièces jointes au dossier.
  4. Cliquez sur la diapositive numérique souhaitée qui apparaît dans la visionneuse de diaporama numérique.
  5. Utilisation de l'outil d'agrandissement, d'évaluer la diapositive et trouver les domaines d'intérêt pour l'intégration dans le ngTMA.
  6. Utilisation de la «TMA outil d'annotation ', sélectionnez la taille de la base désirée et la couleur de l'annotation. Placez l'annotation sur la diapositive numérique en cliquant dessus (figure 4B).
  7. Déplacez l'annotation aux structures histologiques souhaités pour l'incorporation dans le ngTMA (figure 4C).
  8. Répéter ce procédé annotation de nouveau à l'aide de l'outil d'annotation, la sélection d'une taille de base et une couleur d'annotation souhaitée. Répétez le visionnement de diapositives et annotation sur toutes les diapositives dans le dossier.
  9. Sinon, placez carottes de tissu pour la PCR en tubes de 0,2 ml plutôt que l'intégration dans la TMA. Annoter diapositives en utilisant une couleur différente pour identifierces taches pour une analyse plus approfondie moléculaire.
  10. Créer une liste de tous les cas avec leurs annotations et les couleurs correspondantes.

4. tissu microarray Construction

  1. Récupérer les blocs de tissus de paraffine correspondants pour toutes les diapositives numériques annotés, trier les blocs dans l'ordre souhaité pour microréseau tissulaire.
  2. Veiller à ce que les blocs de tissus ont un minimum de 4 mm d'épaisseur. Dans le cas contraire, reembedding de tissu est nécessaire.
  3. Éteignez l'ordinateur "ON" et tissus instrument automatisé de puces à ADN. Ouvrez le logiciel de puces à ADN de tissus et de fournir un nom pour le projet
  4. Effectuer un "changement d'outil" et sélectionnez le diamètre de l'outil requis pour le projet (c.-à 0,6, 1,0, 1,5, ou 2,0 mm).
  5. Chargez jusqu'à 12 blocs «destinataire» de la TMA dans la machine. Donner une identité à chacun des 12 blocs
  6. Création d'un modèle TMA pour chaque bloc receveur. Observez une conception TMA avec le nombre de lignes, colonnes, et devancerY lignes, ainsi que la distance entre les noyaux. Créer une nouvelle mise en page pour chaque bloc receveur ou utiliser la même disposition plusieurs reprises.
  7. Placez le curseur sur la mise en page de bloc receveur de prendre le premier noyau.
  8. Ensuite, charger jusqu'à 60 blocs de donateurs dans le microarrayer de tissu (figure 5A). Placez dix blocs de chaque rangée de A à F. Donner à chaque bloc une identification du donneur. Observer les images de chaque bloc donneur sur l'écran d'ordinateur acquis automatiquement par le microarrayer tissulaire.
  9. En commençant par le premier bloc, cliquez sur «Slide». Observez le diaporama numérique annoté stockée dans le centre de gestion de diaporama numérique (ou sur le disque dur externe) en utilisant la visionneuse de diaporama numérique. Voir l'image du bloc donneur et le côté côte-à-diaporama numérique.
  10. Sélectionner des points de référence sur l'image de bloc de superposer l'image de bloc de donneur avec le coulisseau numérique
  11. Après avoir cliqué sur "Suivant", observer les annotations sur une image plus grande du bloc. (Figure 5B </ Strong>). Cliquez sur les annotations pour confirmer et cliquez sur "Démarrer".
    NOTE: Ce invite l'microarrayer de tissus pour commencer le forage d'un trou de 0,6 mm de diamètre dans le bloc de destinataire au point de départ choisi. Ensuite, dans une deuxième étape, à l'aide de l'outil de poinçonnage, l'instrument poinçons trou dans le tissu à partir du bloc donneur choisi à la région exacte annotée et confirmé. Les noyaux sont ensuite transférés du donneur au bloc receveur.
  12. Après environ 500 noyaux, nettoyer l'outil de forage et la perforation en utilisant un tampon de xylène.
  13. Si carottes de tissu sont souhaitées (plutôt que de coups de poing dans un ngTMA), cliquez sur l'outil «PCR» pour le bloc, confirmer jusqu'à 4 annotations et cliquez sur "Démarrer". Ce punch et de transférer les noyaux dans un tube de 0,2 ml.
  14. Répétez les points 4.9 à 4.11 avec le deuxième bloc donneur, et ainsi de suite.
  15. Après avoir utilisé tous les blocs de donateurs, entrez une deuxième série de blocs donneurs (61-120) dans le tissu microarrayer et de continuer étapes 04.08 au 04.11.
  16. Actualiser images donateurs et blocs bénéficiaire tandis que l'avancement du projet en cours de forage et la perforation se produit (figure 5C).
  17. Faire un "Exporter" après l'achèvement du projet. Localisez le fichier .xslx avec les identifiants des bailleurs de fonds et des blocs de destinataire, la localisation de tous les coups de poing dans la TMA ainsi que la mise en page TMA / conception, dans le dossier exporté. Enregistrer toutes les images de blocs de donateurs avec toute annotation superposé des images jpg dans le dossier exporté (Figure 5D). Le dernier bloc TMA est alors prêt.

Representative Results

Planification et conception

Voici l'exemple de 134 patients atteints de cancer colorectal métastatique qui sont à l'étude pour une série particulière de biomarqueurs a été utilisé. Non seulement un ngTMA est prévu pour ces patients, mais l'extraction de l'ADN suivie par l'analyse mutationnelle de certains gène spécifié.

Pendant la phase de planification et de conception de ngTMA, les aspects suivants ont été décidés. De chaque patient, 6 régions histologiques différents seront étudiés: centre de la tumeur, l'invasion tumorale avant, les zones les plus denses de la tumeur en herbe (tumeur / stroma interaction), les tissus normaux, les métastases ganglionnaires et des métastases hépatiques. Trois points tumorales par zone de tissu tumoral et deux places de tissus normaux doivent être inclus dans le projet (n = 17 points par patient). Comme il est prévu que plus de 50 biomarqueurs objet d'une enquête sur ce matériau patients, deux copies de la ngTMA finale sont souhaitées. En raison de la petite taille possible de ganglion lymphatique et distant métastases, un petit diamètre de noyau de 0,6 mm pour la construction de TMA pour tous les tissus est choisi.

En outre, il est prévu que chaque région se revêtir séparément, de sorte que 6 ngTMAs contenant différentes zones histologiques seront produits: un ngTMA contenant des tissus du centre de la tumeur a), b) front d'invasion, les zones c) tumeur en herbe, d) les tissus normaux , e) les métastases des ganglions lymphatiques, et f) des métastases hépatiques.

Pour la conception de TMA en utilisant un outil de 0,6 mm, une distance confortable de 0,4 mm entre les coups de poing sera sélectionné. Parce que l'évaluation des spots de tissu dans de longues lignes et de colonnes est souvent fastidieux, deux modèles différents sont choisis. Pour les blocs de tumeurs avec 3 coups par zone de tissu, une conception contenant six parties est créé. Cela conduit à un nombre total de 402 coups de tissu. Pour poinçons de tissus normaux, 2 coups par cas doivent être inclus. Une mise en page raccord 432 coups au total est choisi.

En outre, pour chaque cas, jusqu'à 4cœurs à 0,6 mm seront en outre être perforés et placés en tubes de 0,2 ml. Ces noyaux de tissus seront également annotés.

Pour résumer, 6 ngTMAs de différents tissus seront produits (5 tableaux tumorales x 3 poinçons x 134 patients; une matrice de tissu normal x 2 poinçons x 134 patients), en plus de 4 cœurs par patient pour les tubes. Dans l'ensemble, 2814 annotations seront faites.

Ensuite, les H & E diapositives correspondantes de patients sélectionnés sont extraits de l'archive de diapositives. Chaque cas est brièvement examinée par un médecin légiste et la plupart des diapositives représentatives de chaque type de tissu sont sélectionnés.

Numérisation

Diapositives numériques de chaque coupe histologique sont faites pour l'annotation avenir. Pour cette étude, trois à quatre lames de tissu doivent être scannées par cas, c'est à dire, le cancer colorectal primaire, avec ou sans les tissus adjacents normaux, les métastases des ganglions lymphatiques et les métastases du foie et, éventuellement, un coulisseau supplémentaire concontenant une muqueuse normale.

Jusqu'à 10 magazines différents peuvent être entièrement chargées dans le scanner de diapositives; donc 250 diapositives peuvent être numérisés en un seul passage. Le temps de balayage et la taille de diapositive numérique varie en fonction des dimensions du tissu et le facteur de qualité souhaitée. Les gammes de facteurs de qualité de 0 à 100 Ici, un facteur de qualité de 60 est choisi, car il produit une plus petite taille de fichier de balayage sans perte notable de qualité de numérisation. Petites biopsies peuvent être numérisés en moins de 30 secondes alors que les sections de tissus ensemble, comme ceux utilisés dans cet exemple peut prendre entre 2 et 10 min. Taille de diapositive numérique peut également varier de 2 Mo à 2 Go. L'utilisation d'un facteur de qualité de 60, scanne entre 600 Mo et 1 Go sont produites.

Entre 402 et 536 diapositives sont nécessaires pour ce projet totalisant 3 numérisation s'exécute. Chaque essai est effectué pendant une nuit. Environ 500 Go d'espace de stockage est nécessaire. Les lames sont numérisés directement sur une plate-forme numérique appelé Case Center (ngtma.unibe.pathcasecenter). Case Center est accessible à partir de n'importe quel accès Internet en entrant le nom d'utilisateur et mot de passe désigné.

Annotation

Pour annotation, deux aspects doivent être considérés: 1) les zones de tissus différents devraient avoir différentes couleurs d'annotation et 2) le nombre d'annotations doivent refléter le nombre de copies désirées de la finale ngTMA.

Dans ce cas, 3 spots par zone de la tumeur pour un seul exemplaire ont été sélectionnés. Pour 2 exemplaires, chaque région doit être annotée avec 6 points. Utiles sont vert pour les tissus normaux, bleu pour le centre de la tumeur, jaune pour le front de l'invasion tumorale, rouge pour les zones de tumeur en herbe (tumeur / stroma) interaction, noir pour les métastases ganglionnaires, turquoise pour des métastases à distance et enfin blanc pour les régions soient utilisé pour les tubes. Annotation de chaque cas nécessite 2-3 min.

ngTMA Construction

Cette étude nécessite 6 ngTMA bloque to être construit en 2 exemplaires, résultant en 12 blocs finales. Le nombre maximal de blocs de bénéficiaires qui peuvent être pris en charge par le arrayer est de 12 Chaque bloc de la tumeur contient 402 spots de tissu et chaque bloc de tissu normal contiendra 268 places, totalisant 4556 points sur l'ensemble du projet.

Une mise en TMA est créé pour chaque bloc receveur et le projet est enregistré (figures 6A, 6B). 60 blocs de tissus peuvent être chargés dans le tissu de puces à ADN en parallèle; une image de chaque bloc de donneur est prélevé. En commençant par le premier bloc donneur, la diapositive numérique annoté correspondant est récupéré à partir de cas Center. Glisser en correspondance est effectuée, ce qui peut prendre entre 1-3 min. Les annotations sont confirmées et la arrayer est invité à commencer poinçonnage (Figure 7). Noyau poinçonnage et le temps de transfert est d'environ 12 sec. La perte de noyaux au cours de cette procédure est minime. Le temps total pour rangeant ce projet est d'environ 24 heures, y compris le temps pour slide / correspondance de blocs et de rechargement de l'appareil. Quelques exemples de ngTMA sont illustrées sur la figure 8A. Noyaux pour l'analyse moléculaire ultérieure peuvent également être percés en ce moment (figure 8B).

Figure 1
Figure 1: A) Un bloc «donneur». Cœurs du bloc donneur sont découpées et transférés dans B) un bloc receveur, ou puce à ADN de tissu (TMA).

Figure 2
Figure 2: Le flux de production de puces à ADN de tissu classique. A) lames histologiques sont extraits de l'archive et B) donné à la pathologiste f ou d'examen. CD) Les annotations sont faites sur les diapositives indiquant la région «estimé» pour le transfert. E) Les blocs de tissus correspondants sont récupérés. F) Bloquer et toboggan sont comparées pour l'adaptation, qui peuvent G) parfois être une tâche difficile. HJ ) microréseau tissulaire se produit alors. K) Les noyaux sont transférés à plusieurs reprises et L) une finale TMA est construit.

Figure 3
Figure 3 A) Jusqu'à 25 lames peut être placé dans chaque magasin pour la numérisation. B) Ajustements pour le facteur de qualité et la taille peut être faite. progrès de numérisation peut être surveillé.

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Figure 4 A) numérisée diapositives peuvent être téléchargés sur la plate-forme Web, Case Center. B) diapositives numériques peuvent être visualisées. L'outil d'annotation TMA permet à l'utilisateur de sélectionner la taille et la couleur de base nécessaires pour l'annotation. C) Les annotations peuvent être placés directement sur ​​la lame numérique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5 A) Jusqu'à 60 blocs peut charger dans le microarrayer des tissus, à savoir 10 blocs donneurs par ligne et 12 bénéficiaires blocs ainsi. B) Une image de chaque bloc donneur est pris, la digital diapositive est récupéré. Correspondance de bloc et lame est faite et annotations sont utilisées pour le bloc de poinçonnage. C) Les progrès de la formation de réseau peut être surveillé pendant que l'instrument est la perforation. D) Après le poinçonnage est effectué, l'exportation de l'emplacement de chaque point dans la mise en page, mais aussi une image de chaque bloc donneur avec annotations correspondantes est faite.

Figure 6
Figure 6. Ces dispositions TMA ont été utilisés pour rangeant les blocs A) de la tumeur et B) les tissus normaux.

Figure 7
Figure 7. D'écran du logiciel de puces à ADN de tissu. Sur la gauche, 12 recipient blocs peuvent être placés dans l'appareil. Sur le fond, les images de chaque bloc donneur sont prises. Au centre, la disposition TMA, le progrès de la perforation ainsi que des images agrandies de chaque bloc donneur avec annotations se trouve.

Figure 8
Figure 8: A) Quelques exemples de blocs ngTMA nouvellement créées. B) coups de tissus supplémentaires peuvent être prises pour l'analyse moléculaire ultérieure. Ces noyaux sont découpées et placées dans des tubes de 0,2 ml.

Figure 9
Figure 9 Exemples d'applications de biomarqueurs ngTMA. A) immunohistochimie coloration de Ki67 dans le cancer colorectal. Double SER2 immunohistochimie / hybridation in situ test montrant B) faible expression de la protéine (brun) et pas d'amplification du gène HER2 (noir) par rapport au centromère (rouge), C) une expression élevée de la protéine (brun) et amplification du gène HER2 ( noir) par rapport au centromère (rouge). D) chromogénique hybridation in situ de Her2 en montrant transcrits d'ARNm simples dans le cancer du sein ngTMA. E) immunohistochimie pour CD8 dans le cancer colorectal. F) Double Teinture d'immunohistochimie pour le marqueur pan-cytokératine AE1 / AE3 (brun, cellules tumorales) et CD68 (rouge. Macrophages) soulignant microenvironnement de la tumeur dans le cancer colorectal S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Dans cet article, un protocole pour ngTMA est décrite. ngTMA est un concept nouvellement créé pour microréseau tissulaire comprenant la planification et la conception, la pathologie numérique et diaporama annotation ainsi que automatisé microréseau tissulaire 12.

Par rapport à microréseau tissulaire classique, ngTMA offre de nombreux avantages. Dans une première étape, la phase de planification et la conception est critique. L'accent est mis sur la réponse à une question de recherche ciblée. Cela devrait prendre en considération les questions histologiques (par exemple, quelles sont les régions et le nombre de points que je veux comprennent?), La planification statistique (par exemple, la taille de l'échantillon? Comment puis-je analyser mes échantillons plus tard?) Et des considérations logistiques (par exemple, comment de nombreux biomarqueurs et donc le nombre de copies ngTMA?). Un ngTMA spécifique est faite pour des besoins spécifiques, que ce soit pour le dépistage des biomarqueurs et à haut débit ou l'intention d'étudier les aspects histologiques spécifiques sur quelques-unes CAS bien choisies.

Un, sinon le, désavantage le plus important de microréseau tissulaire classique est la faible précision avec laquelle les marquages ​​sur les lames histologiques sont pratiquées. L'étude des structures histologiques, des cellules ou des régions spécifiques est faite presque impossible. ngTMA permet une grande précision car annotations sont placées directement sur les diapositives numériques. Cela permet au chercheur de choisir précisément les régions à perforer, y compris des cellules spécifiques. Dans cet exemple, différents domaines au sein du même bloc de tissu sont découpées pour rangeant, comme centre de la tumeur, le front de l'invasion et de domaines d'interaction tumeur / stroma mis en évidence par la présence de petits amas de cellules tumorales ou même des cellules individuelles. Cette précision ne peut être obtenue à l'aide ngTMA. Troisièmement, parce que les diapositives sont numérisées sur une plate-forme numérique sur le Web, faites glisser la visualisation et l'annotation peut être faite par l'ordinateur plutôt qu'avec le microscope. Le logiciel de formation de réseaux de tissus fournit un outil convivialinterface avec un haut degré de flexibilité, donc différentes mises en page et la conception ngTMA peut être atteint. Depuis la construction TMA est effectuée automatiquement par le forage, il n'est guère nécessaire pour est considérablement réduite mains sur les manœuvres et le temps de construction. Le temps de construction TMA dans cet exemple ici est entre 24 h. En utilisant une approche conventionnelle TMA et l'estimation de 15 coups par heure, ce projet prendra environ 304 heures.

ngTMA peut être appliquée pour étudier l'expression de la protéine, de l'ARNm ou de l'ADN, ainsi que des combinaisons de ceux-ci. figure 9 illustre plusieurs de ces applications de biomarqueurs potentiels. Immunohistochimie standard peut être utilisé pour déterminer l'indice de prolifération de cancers en utilisant Ki-67. Une approche combinée pour étudier l'expression des protéines et de l'ADN pour l'amplification des gènes tels que HER2 peut être utilisé. Les tissus peuvent être rassemblés sur un seul ngTMA de réduire les coûts, l'utilisation de tissus et d'autres ressourcess. En outre, l'ARNm par hybridation in situ chromogène pour HER2 et d'autres gènes peut être réalisée en d'identifier des transcrits d'ARNm individuels dans un grand nombre de cas à l'aide d'un nombre minimal de lames de tissu. L'immunohistochimie de marqueurs immunitaires telles que CD8 peut être visualisé dans le contexte du micro-environnement de la tumeur. Double immunohistochimie peut également être utilisé pour mettre en évidence les régions d'intérêt particulier tels que les interactions entre les cellules immunitaires (marquées en rouge) et les cellules tumorales (marquées en brun) à l'avant de l'invasion des cancers. Une telle région d'intérêt n'a pas pu être capturée à l'aide de microréseau tissulaire classique.

Néanmoins, ce protocole contient certaines limites. Le défi le plus important est le chevauchement entre le bloc des bailleurs de fonds et diaporama numérique. Plusieurs facteurs peuvent influencer cette étape. Tout d'abord, la dernière section du bloc doit être utilisé pour la numérisation de diapositives. Dans de nombreux cas, l'H & E ne sont pas de la dernière section du bloc donneur, Rather est une coloration immunohistochimique ou d'une autre. Dans ce cas, également une lame colorée peut être utilisé aussi longtemps que la dernière tache est numérisé et annoté ou un nouveau H & E doit être effectué. Il faut également être prises lors des coupes de tissus sont faits comme les tissus peuvent se développer dans le bain d'eau qui conduit à l'alignement difficile de diapositives et bloc. Deuxièmement, à l'heure actuelle des projets sont limités à 12 destinataires TMA blocs traités en une seule fois. Les grands projets de plus de 12 TMA doivent être affectés à un deuxième nom du projet. Troisièmement, les blocs donneurs doivent être faites en utilisant des moules et des cassettes standard que l'instrument ne peut pas s'adapter à différentes tailles. Enfin, les blocs donneurs doit dépasser la hauteur minimale (4 mm) pour réaliser le forage optimale. Dans certains cas, cela nécessite reembedding de tissus.

Des centaines de publications au cours des dernières années mettent en évidence la TMA comme un outil précieux pour la recherche de biomarqueurs. TMA ont été utilisées pour étudier poumon 13, 7 colorectal, breast 14, de la prostate 15, 16 pancréas, de la vessie 17, et 18 cancers gastriques, pour n'en nommer que quelques-uns. Un nombre croissant d'auteurs ont combiné l'utilisation de TMA avec l'analyse de l'image et des progrès importants sont faits dans ce sens 19-21. Cependant, à côté d'une poignée de groupes de recherche qui ont publié des idées novatrices TMA 22-24, peu d'attention a été accordée à optimiser la technique TMA lui-même. Microarrayers tissulaires automatisés, tels que l'ATA-27 par Estigen / Beecher fournissent conception de mise en page et la perforation des tissus rapide et automatisé. Cela représente toutefois une seule aspect du concept ngTMA.

ngTMA est une amélioration importante par rapport aux techniques de microréseau tissulaire classiques. Il intègre l'expertise de l'histologie et de la conception de TMA avec la flexibilité de la pathologie numérique et la précision des annotations numériques avec la vitesse et la fiabilité de la construction TMA automatisé. La combinaison de ngTMUne analyse d'images pour l'évaluation des protéines biomarqueurs moléculaires et sera un outil puissant pour améliorer encore la qualité de la recherche clinique et translationnelle à l'avenir.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier le personnel technique de l'Unité de recherche translationnelle; Marie Economou, José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni et l'équipe informatique de l'Institut de pathologie de l'Université de Berne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pannoramic 250 Flash II 3DHistech Slide scanner
TMA Grandmaster 3DHistech Tissue Microarrayer
Pannoramic Viewer 3DHistech free Slide viewing software
Case Center 3DHistech Digital slide platform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Un tissu microarray de nouvelle génération (ngTMA Protocol) pour les études de biomarqueurs
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Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).More

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).

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