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Medicine

バイオマーカー研究のための次世代組織マイクロアレイ(ngTMA)プロトコル

doi: 10.3791/51893 Published: September 23, 2014

Summary

プロトコルは、バイオマーカー研究のための組織マイクロアレイの構築と品質を最適化することを目指しています。それは、計画と設計、デジタル病理学、バーチャルスライドアノテーション、自動化された組織アレイ化の態様を含む。

Abstract

バイオマーカー研究は、組織マイクロアレイ(TMA)に依存しています。のTMAは、「受信者のブロックに「ドナー」ブロックからの小さな組織コアの繰り返し転写によって産生され、その後、バイオマーカー、さまざまな用途のために使用される。従来のTMAの構成は労働集約的不正確で、時間がかかる。ここで、次世代の組織マイクロアレイを使用してプロトコル(ngTMA)が概説されている。 ngTMAはTMAの企画·デザイン、デジタル病理学、および自動化された組織microarrayingに基づいています。プロトコルは、134転移性結腸直腸癌患者の例を用いて例示されている。組織学的には、統計的および物流の態様は、組織タイプ、特定の組織領域、およびTMA、組織スポット、サンプルサイズ、統計分析、およびTMAのコピー数の数に含めるための細胞型として、考えられている。各患者の組織学的スライドがスキャンされ、Webベースのデジタルプラットフォーム上にアップロードされます。そこでは、彼らが表示およびアンされているotated 0.6〜2.0ミリメートルの直径のツール、組織領域を区別するために多様な色を使用して複数回使用して、(マーク)。ドナーブロックと12 '受信者のブロックは、機器にロードされます。デジタルスライドが取得され、ドナーブロック·イメージに一致している。注釈付きの領域の繰り返し整列を自動的にngTMA結果として実行されます。この例では、6 ngTMAsは六つの異なる組織タイプ/組織学的ゾーンを含む予定されています。 ngTMAsの2つのコピーが望まれている。各患者の3〜4スライドがスキャンされます。 3スキャンの実行が必要であり、一晩行った。すべてのスライドがアノテートされます。異なる色は、異なる組織/ゾーン、すなわち、腫瘍の中心、浸潤先端、腫瘍/間質、リンパ節転移、肝転移、および正常組織を表すために使用される。 17の注釈/ケースが見直され、注釈のための時間は2〜3分/ケースです。 12 ngTMAsは4556スポットを含む生産されています。時間的に配列することは、15〜20時間である。により、その精度、柔軟性とスピードに、ngTMAは強力ですさらに、臨床およびトランスレーショナルリサーチで使用のTMAの質を向上させるツールです。

Introduction

最後の20年間、組織マイクロアレイ(TMAには)バイオマーカー調査研究に関する著しい影響を与えている。 TMAは、単一のTMA「受信者のブロック( 1)1にパラフィン包埋「ドナー」のブロックから、通常は0.6〜直径2.0mmの大きさの範囲の、本質的に小さな組織コアを繰り返し転送によって生成組織「アーカイブ」です。小さ ​​なコア·サイズを使用して、いくつかのまたは多数の異なる患者からの約500の異なる組織スポットは、1つのTMA 2に配列することができる。

予後または予測的バイオマーカー研究のためのTMAの使用は多くの利点を有する。免疫組織化学によるタンパク質バイオマーカーの発現は450人の患者で評価される例を考えてみましょう。むしろ、同数のブロックから切片450患者スライドに450免疫組織化学的汚れを行うよりも、各サンプルから小さなコアが単一のT上に配列することができるMAブロック。複数のコアを各患者から採取されていても、ブロックの最小数が生成される。これは、大幅にコストと他のリソースを減少ならびに組織消耗を減少させるかなりの効果を有する。さらにこれは、同じ実験条件下で評価される組織の多数を使用して適切に給電研究を可能にする。

TMAは、多くの異なる用途を有する。例えば、それらは、形態学、タンパク質発現、RNAの発現および異なる色素で染色し、次のDNA異常を研究するために使用することができる、またはin situハイブリダイゼーション 3-7 免疫組織化学または色素、さらには蛍光た。最近の研究はまた、染色プロトコルにおけるイントラ及び室間の変動をテスト特異性または特定の遺伝子変異のための抗体の感受性を確立し、国際的な共同研究におけるタンパク質発現の観察者間再現性を決定するためのTMAを使用して

患者由来の組織を用い伝統のTMAの建設は長いマルチステップの手順( 図2)。それは彼らが取得され、そこから病理学の研究所、あるいは他の機関、で可能な適切なケースの検索やアーカイブからの診断のスライドの選択から始まります。病理学者は、ケースごとに各スライドを評価し、研究の目的のための最も代表的なスライドを選択します。次に、関心領域は、顕微鏡下で直接ペンでマークされる。これは、多くの場合、挑戦的かつ不正確であり、唯一の組織パンチから取られるべき場所の「推定」になる。次に、これらのマークされたスライドに対応したパラフィンブロックをアーカイブから検索される。ブロックとスライドとの間の簡単な比較が行われる。半自動または自家製組織アレイヤーを使用して、ドナーブロックは、関心の推定領域で打ち抜き、受信者のTMAブロックに転送され、。この整列技術を使用してのTMAの建設は労働集約的で、時間のかかる、不正確、そして柔軟性がない。 3コピーで475スポットのTMAを調製するには、作業の約84時間かかると推定される。

組織学および12を配列自動化されたTMAの専門知識と組み合わせる計画と設計(またはコンサルティング)、デジタル病理学:TMAを建設するための新しいアプローチは、最近三成分に依存している病理、ベルン大学の研究所が紹介されました。一緒に、この概念は次世代のティッシュマイクロアレイ(ngTMA)と呼ばれている。以下は、ngTMAためのプロトコルは、転移性結腸直腸癌患者134の例に基づいて説明する。ここで、原発性腫瘍、ならびにリンパ節転移、肝転移、その後のバイオマーカー分析のためngTMAsに配列される。さらに、各患者からの小さな組織コアは、将来の核酸抽出のために所望される。

Protocol

注:この研究はインゼル病院、ベルン、スイス(07-10-13)の地元の倫理委員会によって承認されています。組織は腫瘍銀行病理ベルン、研究所、ベルン大学から入手した。

1。計画と設計(コンサルティング)

  1. 回答する研究課題について考えてみてください。プロジェクトに含まれる組織の種類を決定します。組織学的構造は質問に答えるために重要であるかを決定します。
  2. 最も有用なコア径およびプロジェクトのための患者あたりのコアの数を把握する。調査するためのバイオマーカーの量に基づいて次世代の組織マイクロアレー(ngTMA)のコピー数を決定する。
  3. 組織マイクロアレイ(TMA)が構築された後、そのようなサンプルサイズと分析などの統計的な側面を考慮してください。研究に含めるための患者の数を決定し、アレイ用のコントロール組織を確立します。
  4. 組織学的を取得(または診断)ヘマトキシリン​​およびエオシン(H&E)各患者のスライド。簡単に説明すると、スライドを見直し、プロジェクトに関連する情報および組織学を含むものを特定する。
    注:特殊な汚れや免疫組織化学スライドがスライド走査と注釈のために所望される場合に代わりにH&Eスライドの、パラフィンブロックの新しいセクションを作成します

2スライド走査

  1. PCとスライドスキャナとオープンスキャンソフトウェアをオンにします。プレビュー画面からの明視野スキャン用の「自動モード」を選択してください。
  2. スライド品質パラメータを調整する「スキャンオプション」をクリックします。このとき、スライドを直接ウェブからアクセス可能なデジタルプラットフォームやローカルドライブ(または外部ドライブ)にスキャンされるかどうかを選択してスキャンし、フォーカスポイントの数の種類を設定します。
  3. 「ケース·センター」をスキャンする「サーバー·パラメータ」をクリックします。このステップでは、複数のマガジンを追加し、すべてのスライドとセットにラベルを付けるスライドが格納されるべきケースセンター内のフォルダ。各雑誌は25のスライドまで収納。
  4. スキャンのための実際の組織スライドの質/清浄度を確認してください。 70%エタノールで必要に応じて、きれいなスライド。
  5. ラベルが内側に向くように、マガジンあたり25のスライドまでのロード( 図3A)
  6. スキャナで雑誌を置きます。複数の雑誌では、互いの上に配置します。
  7. 緑色の矢印( 図3B)をクリックすることで、スライドをスキャン開始します。すべてのスライドがスキャンされると、雑誌をアンロードし、プログラム、PCとスライドスキャナを遮断してください。

3。デジタルスライドの注釈

  1. デジタルスライド管理センターブラウザのアドレスを入力して、無料のデジタルスライドビューアソフトウェアをダウンロードします。
  2. デジタルスライドビューアソフトウェアを開き、デジタルスライド( 図4A)を含むフォルダを選択します。
  3. デジを、メモを追加順序を変更し、管理Lスライドフォルダや同僚にユーザー権限を割り当てるか、フォルダに添付ファイルを追加します。
  4. デジタルスライドビューアに表示される所望のデジタルスライドをクリック。
  5. 倍率ツールを使用して、スライドを評価し、ngTMAに統合するための関心領域を見つける。
  6. 「TMAの注釈ツール」を使用して、所望のコアのサイズと注釈の色を選択します。 ( 図4B)、それをクリックすることで、デジタルスライドに注釈を配置します。
  7. ngTMA( 図4C)に組み込むための目的の組織学的構造に注釈を移動します。
  8. コアサイズ、所望の注釈の色を選択して、注釈ツールを使用して、再度、注釈のこのプロセスを繰り返します。フォルダ内のすべてのスライドにスライドの表示と注釈を繰り返します。
  9. 代わりに、0.2mlチューブではなく、TMAへの統合にPCR用の組織コアを配置します。識別するために、異なる色を使用して、スライドに注釈を付けるさらなる分子解析のためのこれらのスポット。
  10. それらに対応するアノテーションと色ですべてのケースのリストを作成します。

4。組織マイクロアレイの構築

  1. すべての注釈付きデジタルスライドに対応するパラフィン組織ブロックを取得し、組織microarrayingための所望の順序でブロックを並べ替えます。
  2. 組織ブロックを4mmの厚さの最小値を持っていることを確認します。そうでない場合、組織のreembeddingが必要である。
  3. 自動化された組織マイクロアレイヤー楽器「ON」のPCの電源を入れます。組織マイクロアレイヤーソフトウェアを開き、プロジェクトに名前を与える
  4. 「工具交換」を実行し、プロジェクトに必要な工具径を選択する( すなわち 、0.6、1.0、1.5、または2.0ミリメートル)。
  5. マシンに12 '受信者のTMAブロックまでロードします。 12ブロックのそれぞれにIDを与える
  6. 各受信者のブロックごとにTMAのレイアウトを作成します。行、列の数と、TMAのデザインを観察し、先取りyのラインだけでなく、コア間の距離。各レシピエントブロックのための新しいレイアウトを作成するか、繰り返し同じレイアウトを使用。
  7. 第一のコアを取るために受信者のブロックレイアウト上にカーソルを置きます。
  8. 次に、組織マイクロアレイヤー( 図5A)に60ドナーブロックまでセット。各ブロックのドナーIDを与えるFに各行Aの10ブロックを配置します。組織マイクロアレイによって自動的に取得されたコンピュータの画面上の各ドナーブロックの画像を観察します。
  9. 最初のブロックからは、「スライド」をクリックしてください。デジタルスライドビューアを使用してデジタルスライド管理センターに(または外部ドライブに)格納された注釈付きのデジタルスライドを観察します。ドナーブロックとデジタルスライドサイドバイサイドの画像を表示します。
  10. デジタルスライドをドナーブロックの画像を重畳するブロック画像上の基準点を選択する
  11. 「次へ」をクリックした後、ブロックの大きな画像に注釈を観察します。 ( 図5B </強い>)。確認し、「開始」をクリックし、注釈の上をクリックしてください。
    注:これは選択した出発点でレシピエントブロックに直径0.6mmの穴をドリル開始するために、組織マイクロアレイヤーを求めるメッセージが表示されます。その後、第二工程で、打ち抜き工具を用いて、器具は、正確な注釈付きと確認された領域で、選択されたドナーブロックから組織に穴を打ち抜く。コアは、受信者のブロックにドナーから転送されます。
  12. 約500のコアの後、キシレンの綿棒を使用して、ドリルとパンチツールを清掃してください。
  13. 組織コアが(むしろngTMAへのパンチよりも)必要な場合は、ブロックごとに「PCR」ツールをクリック、4の注釈まで確認し、「開始」を押してください。これは0.2ミリリットルチューブにコアをパンチして転送します。
  14. リピートポイント第二ドナーブロックで4.9から4.11、というように。
  15. すべてのドナーブロックを使用した後、組織マイクロアレイへのドナーブロックの第二ラウンド(61-120)を入力ERおよび手順4.11に4.8を続ける。
  16. 掘削およびパンチが( 図5C)を発生している間にプロジェクトの進捗ながらドナーとレシピエントブロック·イメージを更新します。
  17. プロジェクトが完了した後、「エクスポート」を実行します。エクスポートされたフォルダ内に、ドナーとレシピエントブロックID、TMA内のすべてのパンチのローカライズだけでなく、TMAのレイアウト/デザインを.xslxファイルを探します。エクスポートされたフォルダ( 図5D)におけるJPG画像など、すべて重ね合わせた注釈を持つすべてのドナーブロック·イメージを保存します。最後のTMAブロックは準備が整う。

Representative Results

企画·デザイン

ここでバイオマーカーの特定の一連の調査されている転移性結腸直腸癌患者134の例を使用した。 ngTMAは、これらの患者のために計画するが、DNA抽出は、いくつかの特定の遺伝子のための変異解析が続いているだけでなく。

ngTMAの計画と設計フェーズでは、以下の点が決定されました。各患者から、6つの異なる組織学的領域が調査されます:腫瘍センター、腫瘍の浸潤前線を、最密腫瘍の面積が(腫瘍/間質相互作用)、正常組織、リンパ節転移や肝転移出芽。腫瘍組織面積当たり3腫瘍スポット二つ正常組織スポットは、(患者当たりのn = 17スポット)プロジェクトに含まれるべきである。それは50以上のバイオマーカーは、この患者材料に調査されることが予定されているので、最後のngTMAの2つのコピーが望まれる。可能な小さなリンパ節の大きさとdistanによるtの転移は、全ての組織のためのTMAを構築するための0.6mmの小さいコア径が選択される。

さらに、それは、異なる組織学的領域を含む6 ngTMAsが生成されるように、各領域は別個に、配列されることが予定されている:ngTMA a)は、腫瘍の中心からの組織を含む、b)の浸潤先端と、c)腫瘍出芽領域と、d)正常組織、e)のリンパ節転移、およびf)肝転移。

0.6ミリメートルツールを使用して、TMAの設計では、パンチとの間の0.4mmの快適な距離が選択される。長い行と列に組織スポットの評価は、しばしば面倒であるため、二つの異なる設計が選択される。組織面積当たり3パンチを用いた腫瘍ブロックに対して、6つの部分を含むデザインが作成される。これは、402組織パンチの総数につながる。正常組織パンチは、ケースあたり2パンチが含まれるべきである。全部で432のパンチをフィッティングレイアウトが選択されます。

また、ケースごとに、最大40.6ミリメートルでのコアは、さらに、打ち抜き、0.2mlチューブ内に配置される。これらの組織コアも注釈が付けられます。

チューブ用の患者当たり4コアに加えて、要約すると、異なる組織の6 ngTMAsが生成されます(1正常組織アレイ×2のパンチのx 134の患者5の腫瘍アレイ×3パンチは134人の患者をX)。まとめると、2814注釈が行われる。

次に、選択された患者からの対応するH&Eスライドはスライドアーカイブから取得されます。各ケースは簡単に病理学者によって検討され、各組織タイプの最も代表的なスライドが選択されています。

スキャニング

各組織切片のデジタルスライドは、将来の注釈のために作られています。この研究のための、3-4組織スライドは、ケースごとにスキャンされるべきであり、 すなわち 、原発性結腸直腸癌、正常組織、リンパ節転移、肝転移およびおそらく追加のスライドコン隣接有りまたは無し正常粘膜をtaining。

最大10種類の雑誌が完全にスライドスキャナにロードすることができます。したがって、250のスライドは、単一の実行でスキャンすることができます。スキャニングとデジタルスライドのサイズのための時間は、組織と所望の品質係数の大きさに応じて変化する。品質係数は、スキャン品質の顕著な損失なしに小さくスキャンファイルサイズを生成するので60の品質係数が、選択され、ここで、0〜100の範囲である。この例で使用されるもののような全体の組織切片は、2と10分の間でとることができる一方、小さな生検を、30秒の下で走査することができる。デジタルスライドのサイズも2メガバイトから2ギガバイトの範囲とすることができる。 60の品質係数を用いて、600メガバイトおよび1 GBとの間のスキャンが生成される。

402との間および536スライドを3スキャンの実行を合計このプロジェクトのために必要とされる。各ランは、一晩に行われる。収納スペースの約500ギガバイトが必要になります。スライドをケースセンター(ngtmaいわゆるデジタルプラットフォーム上に直接スキャンされる.unibe.pathcasecenter)。ケースセンターは、指定されたユーザ名とパスワードを入力して、Webアクセスでどこからでもアクセスできます。

注釈

注釈については、2つの側面が考慮されるべきである:1)の異なる組織領域は、異なる注釈の色を与えられるべきであり、2)注釈の数は、最終ngTMA所望のコピー数を反映すべきである。

この場合、単一コピーの腫瘍面積当たり3スポットが選択されている。 2部では、各領域は6スポットを使用して注釈を付けなければなりません。有用であることが判明した領域について、正常組織のための緑の腫瘍センターの青、腫瘍の浸潤前線イエロー、(腫瘍/間質)の相互作用を出芽腫瘍のエリアの赤、リンパ節転移のための黒、遠隔転移のためのターコイズ、最後に白ですチューブに使用されます。それぞれの場合の注釈は2〜3分が必要になります。

ngTMA建設

この研究は、6 ngTMAブロックtを必要とするO 12、最終ブロックで、その結果、2枚で構成する。各腫瘍のブロックは402組織スポットを含有し、それぞれの正常組織ブロックは、プロジェクト全体4,556スポットを合計268スポットを、含まれていますアレイヤーでサポートできるレシピエントブロックの最大数は12です。

TMAのレイアウトは、各レシピエントブロックのために作成され、プロジェクトは( 図6A、6B)に保存されます。 60組織ブロックは、並行して、組織マイクロアレイヤーにロードすることができ;各ドナーブロックの画像が取り込まれる。最初のドナーブロックから開始して、対応する注釈付きデジタルスライドは、ケース·センターから取得されます。スライドマッチングは1-3分の間かかることが、実行されます。注釈が確認され、アレイヤー( 図7)を打ち抜く開始するように求めている。コア打ち抜き、転送時間は約12秒である。この手順の間に、コアの損失が最小限に抑えられます。このプロジェクトを配列するための合計時間は、SLIのための時間を含め、約24時間であるド/ブロックマッチングおよび機器のリロード。 ngTMAのいくつかの例は、 図8Aに示されている。その後の分子解析のためのコアはまた、この時点( 図8B)で打ち抜くことができる。

図1
図1のA)は、A「ドナー」ブロック。ドナーブロックからコアを打ち抜き、B)レシピエントブロック、または組織マイクロアレイ(TMA)に移す。

図2
病理医fに与えられた図2の従来の組織マイクロアレイのワークフロー。A)組織学的スライドをアーカイブおよびBから取得されます)やレビュー。CD)のアノテーションは、転送のために'推定'領域を示すスライド上に作られています。E)に対応する組織ブロックが検索されます。F)ブロックとスライドがG)は 、時には困難な作業になる場合があります。HJマッチングのために比較され、 )組織microarrayingその後、かかる場所。K)コアを繰り返し転送し、L)の最終TMAが構築される。

図3
25スライド最大図3 A)スキャンに各マガジン内に配置することができる。B)品質係数とサイズの調整を行うことができる。スキャンの進行状況を監視することができる。

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図4のA)スキャンされたスライドは、Webベースのプラットフォーム、ケースセンター。B)デジタルスライドを見ることができる上にアップロードすることができます。 TMAの注釈ツールは、ユーザーが注釈のために必要なコアのサイズと色を選択することができます。C)注釈がデジタルスライド上に直接配置することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
60ブロックまで図5 A)が取得された組織マイクロアレイヤー、すなわち行当たり10ドナーブロックと12の受信者をブロックにも。B)各ドナーブロックの画像内にロードすることができ、デジlのスライドが取り出される。ブロックスライドの整合が行われ、注釈がブロックパンチ器具がパンチングされている間整列の進行をモニターすることができる。C)D)のために使用されるパンチが行われた後、レイアウト内の各スポットの位置の輸出が、また、対応する注釈を各ドナーブロックの画像が形成される。

図6
図6は、これらのTMAレイアウトは、A)腫瘍ブロックおよびB)正常組織を配列するために使用した。

図7
図7。組織マイクロアレイソフトウェアのスクリーンショット。左側には、12の再cipientブロックは器具内に配置することができる。底部に、各ドナーブロックの画像が取り込まれる。センター、TMAのレイアウトでは、パンチングの進行だけでなく、注釈を各ドナーブロックの拡大画像が発見された。

図8
図8のA)新たに作成されたngTMAブロックのいくつかの例。B)その他の組織パンチは、その後の分子分析のために採取することができる。これらのコアは打ち抜き、0.2mlチューブ内に配置される。

図9
ngTMAバイオマーカーの用途の図9の例。結腸直腸癌におけるKi67ののA)の免疫組織化学染色。デュアルHEB)低い)(茶色タンパク質の発現およびHER2遺伝子セントロメアへ(黒)相対(赤)の無い増幅を示すin situハイブリダイゼーションアッセイ内の R2免疫組織化学/;タンパク質(茶色)のC)高発現およびHER2遺伝子増幅(乳がんngTMA内の単一mRNA転写物を示すのHer2のin situハイブリダイゼーションセントロメア(赤)。D)発色黒)と比較。大腸癌におけるCD8のためのE)の免疫組織化学。 F)汎サイトケラチンマーカーAE1 / AE3(茶色のための二重免疫組織化学染色、腫瘍細胞)およびCD68(赤;マクロファージ)大腸癌における腫瘍微小環境を強調は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

本論文では、ngTMAためのプロトコルを概説する。 ngTMAは、組織の計画と設計を含むmicroarraying、デジタル病理スライド注釈に新しく設立された概念だけでなく、自動化された組織microarraying 12です。

従来の組織microarrayingと比較して、ngTMAは多くの利点を提供しています。最初のステップでは、企画·設計段階は非常に重要です。焦点は、目標と研究の質問に答えるにあります。これは考慮すべき組織学的な問題( 例えば 、どのように多くのスポットが、私がしたいですどの地域やに含める?)、統計的な計画( 例えば 、サンプルサイズ?私は後で私のサンプルを分析するにはどうすればよい?)と物流の考慮事項( 例えば 、どのように多くのバイオマーカー、したがって何ngTMAコピー?)。特定ngTMAは、それがバイオマーカーのスクリーニングおよびハイスループットまたは少数だけでなく、選択し、CAS上の特定の組織学的な側面を研究するためのものであるかを、具体的なニーズのために作られているエス。

一つは、ない場合には、従来の組織microarrayingの最も重要な欠点は、組織スライド上のマーキングが行われると、低精度である。特定の組織学的構造、細胞または領域の研究は、ほとんど不可能になる。注釈がデジタルスライド上に直接配置されているためngTMA高精度を可能にします。これは研究者が正確に特定の細胞を含む穿孔する領域を選択することができます。この例では、同じ組織ブロック内のさまざまな領域は、腫瘍の中心、浸潤先端および小腫瘍細胞クラスターまたは単一細胞の存在によって強調された腫瘍/間質相互作用の領域として、配列するために打ち抜く。この精度は、ngTMAを用いて達成することができる。スライドをWebベースのデジタルプラットフォーム上にスキャンされているため第三に、スライドの表示と注釈がコンピュータを介してではなく、顕微鏡を用いて行うことができる。ソフトウェアを配列した組織は、ユーザーフレンドリーを提供しています高い柔軟性、したがって異なるレイアウトやngTMA設計とのインターフェースを実現することができる。 TMA構成はドリルによって自動的に行われるので、実践的な操縦および構築のための時間の量が大幅に低減されるためにほとんど必要とされている。ここで、この例ではTMAを構築するための時間は、24時間の間である。従来のTMAアプローチを使用し、時間当たり15パンチを推定し、このプロジェクトは約304時間がかかります。

ngTMA、タンパク質発現、mRNAまたはDNA、並びにこれらの組み合わせを研究するために適用することができる。 図9は、潜在的なバイオマーカーにこれらのアプリケーションのいくつかを示している。標準的な免疫組織化学のKi-67を用いた癌の増殖指数を決定するために適用することができる。そのようなHER2などの遺伝子についてのタンパク質発現およびDNA増幅を調査する組み合わせアプローチを使用することができる。組織は、コスト、組織の使用状況およびその他のリソースを削減するために、単一ngTMA上に一緒に集めることができる秒。また、HER2および他の遺伝子のためのin situハイブリダイゼーション発色性mRNAは組織スライドの最小数を使用して多数の症例において単一のmRNA転写物を同定することができる。このようなCD8などの免疫マーカーの免疫組織化学は、腫瘍微小環境との関連で視覚化することができる。二重免疫組織化学はまた、そのような癌の浸潤先端部での免疫(赤で標識された)細胞および腫瘍細胞(茶色標識)との間の相互作用のような関心の特定の領域を強調するために使用することができる。このような関心領域は、従来の組織microarrayingを使用してキャプチャすることができなかった。

それにもかかわらず、このプロトコルは、いくつかの制限が含まれています。最も重要な課題は、ドナーブロックとデジタルスライド間の重複である。いくつかの要因が、この工程に影響を与えることができる。まず、ブロックからの最新のセクションでは、スライド走査のために使用されるべきである。多くの場合、H&Eは早咲きの、ドナーブロックの最後のセクションではありませんrは、それは、免疫組織化学または他の汚れがある。最後に汚れがスキャンされ、注釈付きまたは新しいH&Eがなされるべきであるれているように、この場合にも、染色されたスライドであれば用いることができる。組織はスライドブロックの挑戦的なマッチングにつながる水浴中に拡張することができるように組織切片が行われている場合には注意も払うべきである。第二に、現時点でのプロジェクトは、単一の時点で処理12、受信者のTMAブロックに制限されています。 12のTMAを超える大規模なプロジェクトは、第二、プロジェクト名に割り当てる必要があります。第三に、ドナーブロックは、さまざまなサイズに自分自身を調整することができない楽器のような標準的な金型やカセットを使用して行われなければならない。最後に、ドナーブロックは、最適な掘削を実現するために、最小限の高さ(4ミリメートル)を超えなければならない。いくつかのケースでは、これは組織のreembeddingを必要とする。

ここ数年の出版物の何百ものバイオマーカー研究のための貴重なツールとしてTMAを強調表示します。 TMAは、肺13、結腸直腸7、ティンバーを研究するために使用されているAST 14、前立腺15、膵臓16、膀胱17、および胃18の癌は、いくつかの名前を付けます。著者が増えて画像解析でのTMAの使用を組み合わせているとかなりの進歩がこの方向19-21になされている。しかし、革新的なTMAのアイデア22-24を公開している研究グループの一握りの横に、ほとんど注意がTMA法自体を最適化するために与えられている。 Estigen /ビーチャーによるこのようなATA-27のような自動化された組織microarrayersは、レイアウト設計と好都合と自動化された組織パンチを提供しません。しかし、これはngTMAコンセプトの唯一の1側面を表す。

ngTMAは従来の組織microarraying技術に比べて大幅な改善である。それは、デジタル病理学の柔軟性と自動化されたTMAの建設の速度と信頼性を備えたデジタル注釈の精度で組織学の専門知識とTMAのデザインが組み込まれています。 ngTMの組み合わせタンパク質及び分子バイオマーカーの評価のためのA及び画像解析は、さらに、将来の臨床および翻訳研究の質を改善するための強力なツールとなる。

Acknowledgments

著者らは、トランスレーショナル研究ユニットの技術スタッフに感謝したいと思います。メアリーエコノモウ、ホセ·ガルバン、キャロラインハンマー、ドミニク·ミュラー、リリアンSchöni病理研究所の情報チーム、ベルン大学。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pannoramic 250 Flash II 3DHistech Slide scanner
TMA Grandmaster 3DHistech Tissue Microarrayer
Pannoramic Viewer 3DHistech free Slide viewing software
Case Center 3DHistech Digital slide platform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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バイオマーカー研究のための次世代組織マイクロアレイ(ngTMA)プロトコル
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Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).More

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).

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