プロトコルは、バイオマーカー研究のための組織マイクロアレイの構築と品質を最適化することを目指しています。それは、計画と設計、デジタル病理学、バーチャルスライドアノテーション、自動化された組織アレイ化の態様を含む。
バイオマーカー研究は、組織マイクロアレイ(TMA)に依存しています。のTMAは、「受信者のブロックに「ドナー」ブロックからの小さな組織コアの繰り返し転写によって産生され、その後、バイオマーカー、さまざまな用途のために使用される。従来のTMAの構成は労働集約的不正確で、時間がかかる。ここで、次世代の組織マイクロアレイを使用してプロトコル(ngTMA)が概説されている。 ngTMAはTMAの企画·デザイン、デジタル病理学、および自動化された組織microarrayingに基づいています。プロトコルは、134転移性結腸直腸癌患者の例を用いて例示されている。組織学的には、統計的および物流の態様は、組織タイプ、特定の組織領域、およびTMA、組織スポット、サンプルサイズ、統計分析、およびTMAのコピー数の数に含めるための細胞型として、考えられている。各患者の組織学的スライドがスキャンされ、Webベースのデジタルプラットフォーム上にアップロードされます。そこでは、彼らが表示およびアンされているotated 0.6〜2.0ミリメートルの直径のツール、組織領域を区別するために多様な色を使用して複数回使用して、(マーク)。ドナーブロックと12 '受信者のブロックは、機器にロードされます。デジタルスライドが取得され、ドナーブロック·イメージに一致している。注釈付きの領域の繰り返し整列を自動的にngTMA結果として実行されます。この例では、6 ngTMAsは六つの異なる組織タイプ/組織学的ゾーンを含む予定されています。 ngTMAsの2つのコピーが望まれている。各患者の3〜4スライドがスキャンされます。 3スキャンの実行が必要であり、一晩行った。すべてのスライドがアノテートされます。異なる色は、異なる組織/ゾーン、すなわち、腫瘍の中心、浸潤先端、腫瘍/間質、リンパ節転移、肝転移、および正常組織を表すために使用される。 17の注釈/ケースが見直され、注釈のための時間は2〜3分/ケースです。 12 ngTMAsは4556スポットを含む生産されています。時間的に配列することは、15〜20時間である。により、その精度、柔軟性とスピードに、ngTMAは強力ですさらに、臨床およびトランスレーショナルリサーチで使用のTMAの質を向上させるツールです。
最後の20年間、組織マイクロアレイ(TMAには)バイオマーカー調査研究に関する著しい影響を与えている。 TMAは、単一のTMA「受信者のブロック( 図1)1にパラフィン包埋「ドナー」のブロックから、通常は0.6〜直径2.0mmの大きさの範囲の、本質的に小さな組織コアを繰り返し転送によって生成組織「アーカイブ」です。小さ なコア·サイズを使用して、いくつかのまたは多数の異なる患者からの約500の異なる組織スポットは、1つのTMA 2に配列することができる。
予後または予測的バイオマーカー研究のためのTMAの使用は多くの利点を有する。免疫組織化学によるタンパク質バイオマーカーの発現は450人の患者で評価される例を考えてみましょう。むしろ、同数のブロックから切片450患者スライドに450免疫組織化学的汚れを行うよりも、各サンプルから小さなコアが単一のT上に配列することができるMAブロック。複数のコアを各患者から採取されていても、ブロックの最小数が生成される。これは、大幅にコストと他のリソースを減少ならびに組織消耗を減少させるかなりの効果を有する。さらにこれは、同じ実験条件下で評価される組織の多数を使用して適切に給電研究を可能にする。
TMAは、多くの異なる用途を有する。例えば、それらは、形態学、タンパク質発現、RNAの発現および異なる色素で染色し、次のDNA異常を研究するために使用することができる、またはin situハイブリダイゼーション 3-7 の免疫組織化学または色素、さらには蛍光た。最近の研究はまた、染色プロトコルにおけるイントラ及び室間の変動をテスト特異性または特定の遺伝子変異のための抗体の感受性を確立し、国際的な共同研究におけるタンパク質発現の観察者間再現性を決定するためのTMAを使用して<suP> 8-11。
患者由来の組織を用い伝統のTMAの建設は長いマルチステップの手順( 図2)。それは彼らが取得され、そこから病理学の研究所、あるいは他の機関、で可能な適切なケースの検索やアーカイブからの診断のスライドの選択から始まります。病理学者は、ケースごとに各スライドを評価し、研究の目的のための最も代表的なスライドを選択します。次に、関心領域は、顕微鏡下で直接ペンでマークされる。これは、多くの場合、挑戦的かつ不正確であり、唯一の組織パンチから取られるべき場所の「推定」になる。次に、これらのマークされたスライドに対応したパラフィンブロックをアーカイブから検索される。ブロックとスライドとの間の簡単な比較が行われる。半自動または自家製組織アレイヤーを使用して、ドナーブロックは、関心の推定領域で打ち抜き、受信者のTMAブロックに転送され、。この整列技術を使用してのTMAの建設は労働集約的で、時間のかかる、不正確、そして柔軟性がない。 3コピーで475スポットのTMAを調製するには、作業の約84時間かかると推定される。
組織学および12を配列自動化されたTMAの専門知識と組み合わせる計画と設計(またはコンサルティング)、デジタル病理学:TMAを建設するための新しいアプローチは、最近三成分に依存している病理、ベルン大学の研究所が紹介されました。一緒に、この概念は次世代のティッシュマイクロアレイ(ngTMA)と呼ばれている。以下は、ngTMAためのプロトコルは、転移性結腸直腸癌患者134の例に基づいて説明する。ここで、原発性腫瘍、ならびにリンパ節転移、肝転移、その後のバイオマーカー分析のためngTMAsに配列される。さらに、各患者からの小さな組織コアは、将来の核酸抽出のために所望される。
本論文では、ngTMAためのプロトコルを概説する。 ngTMAは、組織の計画と設計を含むmicroarraying、デジタル病理スライド注釈に新しく設立された概念だけでなく、自動化された組織microarraying 12です。
従来の組織microarrayingと比較して、ngTMAは多くの利点を提供しています。最初のステップでは、企画·設計段階は非常に重要です。焦点は、目標と研究の質問に答えるにあります。これは考慮すべき組織学的な問題( 例えば 、どのように多くのスポットが、私がしたいですどの地域やに含める?)、統計的な計画( 例えば 、サンプルサイズ?私は後で私のサンプルを分析するにはどうすればよい?)と物流の考慮事項( 例えば 、どのように多くのバイオマーカー、したがって何ngTMAコピー?)。特定ngTMAは、それがバイオマーカーのスクリーニングおよびハイスループットまたは少数だけでなく、選択し、CAS上の特定の組織学的な側面を研究するためのものであるかを、具体的なニーズのために作られているエス。
一つは、ない場合には、従来の組織microarrayingの最も重要な欠点は、組織スライド上のマーキングが行われると、低精度である。特定の組織学的構造、細胞または領域の研究は、ほとんど不可能になる。注釈がデジタルスライド上に直接配置されているためngTMA高精度を可能にします。これは研究者が正確に特定の細胞を含む穿孔する領域を選択することができます。この例では、同じ組織ブロック内のさまざまな領域は、腫瘍の中心、浸潤先端および小腫瘍細胞クラスターまたは単一細胞の存在によって強調された腫瘍/間質相互作用の領域として、配列するために打ち抜く。この精度は、ngTMAを用いて達成することができる。スライドをWebベースのデジタルプラットフォーム上にスキャンされているため第三に、スライドの表示と注釈がコンピュータを介してではなく、顕微鏡を用いて行うことができる。ソフトウェアを配列した組織は、ユーザーフレンドリーを提供しています高い柔軟性、したがって異なるレイアウトやngTMA設計とのインターフェースを実現することができる。 TMA構成はドリルによって自動的に行われるので、実践的な操縦および構築のための時間の量が大幅に低減されるためにほとんど必要とされている。ここで、この例ではTMAを構築するための時間は、24時間の間である。従来のTMAアプローチを使用し、時間当たり15パンチを推定し、このプロジェクトは約304時間がかかります。
ngTMA、タンパク質発現、mRNAまたはDNA、並びにこれらの組み合わせを研究するために適用することができる。 図9は、潜在的なバイオマーカーにこれらのアプリケーションのいくつかを示している。標準的な免疫組織化学のKi-67を用いた癌の増殖指数を決定するために適用することができる。そのようなHER2などの遺伝子についてのタンパク質発現およびDNA増幅を調査する組み合わせアプローチを使用することができる。組織は、コスト、組織の使用状況およびその他のリソースを削減するために、単一ngTMA上に一緒に集めることができる秒。また、HER2および他の遺伝子のためのin situハイブリダイゼーション発色性mRNAは組織スライドの最小数を使用して多数の症例において単一のmRNA転写物を同定することができる。このようなCD8などの免疫マーカーの免疫組織化学は、腫瘍微小環境との関連で視覚化することができる。二重免疫組織化学はまた、そのような癌の浸潤先端部での免疫(赤で標識された)細胞および腫瘍細胞(茶色標識)との間の相互作用のような関心の特定の領域を強調するために使用することができる。このような関心領域は、従来の組織microarrayingを使用してキャプチャすることができなかった。
それにもかかわらず、このプロトコルは、いくつかの制限が含まれています。最も重要な課題は、ドナーブロックとデジタルスライド間の重複である。いくつかの要因が、この工程に影響を与えることができる。まず、ブロックからの最新のセクションでは、スライド走査のために使用されるべきである。多くの場合、H&Eは早咲きの、ドナーブロックの最後のセクションではありませんrは、それは、免疫組織化学または他の汚れがある。最後に汚れがスキャンされ、注釈付きまたは新しいH&Eがなされるべきであるれているように、この場合にも、染色されたスライドであれば用いることができる。組織はスライドブロックの挑戦的なマッチングにつながる水浴中に拡張することができるように組織切片が行われている場合には注意も払うべきである。第二に、現時点でのプロジェクトは、単一の時点で処理12、受信者のTMAブロックに制限されています。 12のTMAを超える大規模なプロジェクトは、第二、プロジェクト名に割り当てる必要があります。第三に、ドナーブロックは、さまざまなサイズに自分自身を調整することができない楽器のような標準的な金型やカセットを使用して行われなければならない。最後に、ドナーブロックは、最適な掘削を実現するために、最小限の高さ(4ミリメートル)を超えなければならない。いくつかのケースでは、これは組織のreembeddingを必要とする。
ここ数年の出版物の何百ものバイオマーカー研究のための貴重なツールとしてTMAを強調表示します。 TMAは、肺13、結腸直腸7、ティンバーを研究するために使用されているAST 14、前立腺15、膵臓16、膀胱17、および胃18の癌は、いくつかの名前を付けます。著者が増えて画像解析でのTMAの使用を組み合わせているとかなりの進歩がこの方向19-21になされている。しかし、革新的なTMAのアイデア22-24を公開している研究グループの一握りの横に、ほとんど注意がTMA法自体を最適化するために与えられている。 Estigen /ビーチャーによるこのようなATA-27のような自動化された組織microarrayersは、レイアウト設計と好都合と自動化された組織パンチを提供しません。しかし、これはngTMAコンセプトの唯一の1側面を表す。
ngTMAは従来の組織microarraying技術に比べて大幅な改善である。それは、デジタル病理学の柔軟性と自動化されたTMAの建設の速度と信頼性を備えたデジタル注釈の精度で組織学の専門知識とTMAのデザインが組み込まれています。 ngTMの組み合わせタンパク質及び分子バイオマーカーの評価のためのA及び画像解析は、さらに、将来の臨床および翻訳研究の質を改善するための強力なツールとなる。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、トランスレーショナル研究ユニットの技術スタッフに感謝したいと思います。メアリーエコノモウ、ホセ·ガルバン、キャロラインハンマー、ドミニク·ミュラー、リリアンSchöni病理研究所の情報チーム、ベルン大学。
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