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Medicine

바이오 마커 연구 차세대 조직 마이크로 어레이 (ngTMA) 프로토콜

doi: 10.3791/51893 Published: September 23, 2014

Summary

이 프로토콜은 바이오 마커 연구를위한 건설 및 조직 마이크로 어레이의 품질을 최적화하는 것을 목표로하고있다. 그것은 계획 및 디자인, 디지털 병리학, 가상 슬라이드 주석 및 자동화 된 조직으로 배열의 측면을 포함한다.

Abstract

바이오 마커 연구는 조직 마이크로 어레이 (TMA)에 의존한다. TMAs는 '수신자 블록으로'공여체 '작은 블록으로부터 조직 코어의 반복 전송에 의해 제조 한 후 바이오 마커 다양한 애플리케이션에 사용된다. TMAs 종래의 구조는 노동 집약적 부정확하고 시간 소모적이다. 여기서, 차세대 조직 마이크로 어레이를 사용하여 프로토콜 (ngTMA)가 개설된다. ngTMA는 TMA 계획 및 디자인, 디지털 병리학, 그리고 자동화 된 조직 microarraying을 기반으로합니다. 프로토콜은 134 전이성 직장 결장암 환자의 예를 사용하여 설명한다. 조직 학적 통계 및 물류 측면은 이러한 TMA, TMA 복사본 티슈 반점, 샘플 크기, 통계 분석 수, 및 번호에 포함 조직 유형, 특정 조직 학적 영역, 및 세포 유형으로 고려된다. 각 환자에 대한 조직 학적 슬라이드 스캔 및 웹 기반의 디지털 플랫폼에 업로드됩니다. 거기에, 그들은 볼 수 있으며 앤 아르otated 0.6-2.0 mm 직경 도구, 조직 영역을 구별하기 위해 다양한 색상을 사용하여 여러 번 사용하여 (표시). 기증자 블록 12 '받는 사람'블록은 악기에로드됩니다. 디지털 슬라이드를 검색 및 기증자 블록 이미지를 일치합니다. 주석 영역의 반복으로 배열 자동 ngTMA의 결과로 수행됩니다. 이 예에서, 여섯 ngTMAs은 여섯 가지 조직 유형 / 조직 학적 영역을 포함하는 계획이다. ngTMAs의 두 사본이 요구된다. 스캔 각 환자에 대한 사 슬라이드에 세; 3 스캔 실행이 필요 하룻밤을 수행합니다. 모든 슬라이드는 주석 아르; 다른 색상은 서로 다른 조직 / 영역, 즉 종양 센터, 침략 앞에, 종양 / 기질, 림프절 전이, 간 전이, 및 정상 조직을 나타내는 데 사용됩니다. 17 주석 ​​/ 케이스 통합됩니다 주석을위한 시간은 2-3 분 / 케이스입니다. 12 ngTMAs는 4,556 점을 포함하는 생산됩니다. 시간들을 배열하면 15 ~ 20 시간이다. 때문에 정밀도, 유연성, 속도, ngTMA은 강력하다상기 TMAs의 품질을 개선하는 도구 및 병진 임상 연구에 사용되는.

Introduction

지난 20 년 동안 조직 마이크로 어레이 (TMAs)는 바이오 마커 조사 연구에 현저한 영향을 미치고있다. TMAs는 파라핀 '기증자'블록에서 단일 TMA '받는 사람'블록으로, 기본적으로 (그림 1) 일반적으로 직경 0.6 ~ 2.0 mm에서 크기에 이르기까지 작은 조직 코어의 반복 전송, 생산 조직 "아카이브"의 아르 한. 작은 크기의 코어를 사용하여, 몇 개의 또는 많은 다른 환자로부터 약 500 가지 조직 스팟은 한 TMA (2)에 배열 될 수있다.

예후 또는 예측 바이오 마커 연구 TMAs의 사용은 많은 장점을 가지고있다. 면역 조직 화학 염색에 의한 단백질 바이오 마커의 발현은 450 명에서 평가 될 예를 생각해 보자. 오히려 블록의 동일한 번호는 구획 (450), 환자 (450)에 슬라이드 면역 얼룩을 수행하는 것보다, 각 샘플에서 작은 코어는 단일 T 상에 배열 될 수있다MA 블록. 다수의 코어는 각각의 개별 환자에서 촬영하더라도, 블록의 최소 개수가 일어난다. 이것은 크게 비용 및 기타 리소스를 감소뿐만 아니라 조직의 낭비를 줄이는 상당한 효과가있다. 조직의 다수를 사용이 또한 적절히 구동있게 연구는 동일한 실험 조건 하에서 평가한다.

TMAs는 다양한 응용 프로그램을 가지고있다. 예를 들어, 이들은 형태학, 단백질 발현, RNA 발현 및 다른 염료 염색 다음 DNA 수차를 연구하는 데 사용할 수 있거나, 동일계 하이브리드3-7 또는 면역 형광 발색 심지어 후. 최근의 연구는 또한, 염색 프로토콜에 내 및 실험실 간 변동을 테스트 특이 또는 특정 유전자 돌연변이에 대한 항체의 감도를 설정하고 국제 협력에서의 단백질 발현의 관찰자 간 재현성을 결정하기 위해 TMAs를 사용했다

환자 유래의 조직을 사용하여 기존의 TMAs의 건설은 긴 다중 단계 절차 (그림 2)입니다. 그것은 그들이이 검색되는 곳에서 병리학 연구소, 기타 연구소에서 가능한 적절한 경우에 대한 검색 및 아카이브에서 진단 슬라이드의 선택으로 시작된다. 병리학 경우 당 각 슬라이드를 평가하고 연구의 목적을 위해 가장 대표적인 슬라이드를 선택합니다. 다음으로, 관심 영역은 현미경 하에서 직접 펜을 사용하여 표시된다. 이것은 종종 도전과 부정확 만 조직 펀치가에서 촬영해야하는 위치의 "추정"가 발생합니다. 다음으로,이 표시된 슬라이드에 해당하는 파라핀 블록은 아카이브에서 검색됩니다. 블록과 슬라이드 사이의 빠른 비교가 이루어집니다. 반자동 또는 제 티슈 arrayer 사용 도너 블록은 예상 관심 영역에 펀칭하고 수신자 TMA 블록으로 전송. 이으로 배열 기술을 사용 TMAs의 건설 노동 집약적, 시간이 소요, 부정확하고, 유연성이다. 3 부에서 475 점의 TMA 준비는 일의 84 시간이 걸릴 것으로 추정된다.

계획 및 설계 (또는 컨설팅), 조직 학적 전문 지식 및 자동화 된 TMA 12으로 배열과 결합 된 디지털 병리 : TMAs의 건설에 대한 새로운 접근 방식은 최근 병리학 연구소, 세 가지 구성 요소에 의존 베른의 대학에 의해 소개되었다. 함께,이 개념은 차세대 조직 마이크로 어레이 (ngTMA)라고합니다. 이하, ngTMA위한 프로토콜은 전이성 직장 결장암 (134)와 환자의 예에 기초하여 설명한다. 여기서, 일차 종양뿐만 아니라 림프절 전이 및 간전 후속 바이오 마커 분석을위한 ngTMAs으로 배열하여야한다. 또한 각 환자의 작은 조직 코어는 향후 핵산 추출을 위해 요구된다.

Protocol

주 : 본 연구는 INSEL 병원, 베른, 스위스 (07-10-13)의 로컬 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 조직은 종양 은행 병리학 베른, 연구소, 베른 대학에서 얻을 수 있었다.

1 계획 및 설계 (컨설팅)

  1. 연구 문제에 대해 생각하는 대답한다. 조직 유형 결정은 프로젝트에 포함합니다. 조직 학적 구조가 질문에 대답하는 것이 중요 무엇인지 확인합니다.
  2. 가장 유용한 코어 직경 및 프로젝트 환자 당 코어 수를 확인. 바이오 마커의 양을 기준으로 차세대 조직 마이크로 어레이 (ngTMA)의 매수를 결정하는 것은 조사한다.
  3. 조직 마이크로 어레이 (TMA)가 생성 된 후에 같은 표본의 크기 및 분석과 같은 통계적인 측면을 고려한다. 연구에 포함 환자의 수를 결정하고 배열하기위한 제어 조직을 확립한다.
  4. 조직 학적 검색 (또는진단) 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 각 환자의 슬라이드. 간단히 슬라이드를 검토하고 프로젝트에 대한 관련 정보와 조직 검사를 포함하는 사람을 식별합니다.
    참고 : 특수 염색 또는 면역 조직 화학 슬라이드 슬라이드 스캔 및 주석을 위해 필요한 경우 대신 H & E 슬라이드, 파라핀 블록의 새로운 섹션을 확인

2 슬라이드 스캐닝

  1. PC 및 슬라이드 스캐너와 오픈 검색 소프트웨어를 켭니다. 미리보기 화면에서 밝은 필드 검색을위한 "자동 모드"를 선택합니다.
  2. 슬라이드 품질 매개 변수를 조정 "검색 옵션"을 클릭합니다. 이 때, 슬라이드를 직접 웹하거나 로컬 드라이브 (또는 외부 드라이브)에 액세스 할 수있는 디지털 플랫폼에 스캔 할 것인지 여부를 선택하고 스캔 및 초점 포인트 수의 유형을 설정합니다.
  3. "케이스 센터"로 스캔 "서버 매개 변수"을 클릭합니다. 이 단계에서, 더 많은 잡지를 추가 모든 슬라이드에 레이블을 설정하고슬라이드가 저장되어야한다 케이스 센터에서 폴더를 선택합니다. 각 잡지는 25 슬라이드를 보유하고있다.
  4. 품질 확인 / 스캔을위한 실제 조직 학적 슬라이드의 청결. 70 % 에탄올로 필요한 깨끗한 슬라이드합니다.
  5. 라벨이 안쪽으로 가리키는 잡지 당 25 슬라이드까지로드 (그림 3A)
  6. 스캐너에 잡지를 놓습니다. 하나 이상의 매거진, 서로의 상단에 배치.
  7. 녹색 화살표 (그림 3B)를 클릭하여 슬라이드를 스캔 시작합니다. 모든 슬라이드를 스캔하면 잡지를 언로드하고 프로그램, PC 및 슬라이드 스캐너를 차단.

3 디지털 슬라이드 주석

  1. 디지털 슬라이드 관리 센터의 브라우저에 주소를 입력하고 무료 디지털 슬라이드 뷰어 소프트웨어를 다운로드합니다.
  2. 디지털 슬라이드 뷰어 소프트웨어를 열고 디지털 슬라이드 (그림 4A)이 포함 된 폴더를 선택합니다.
  3. 메모를 추가 순서를 변경하고 DIGITA 관리리터 슬라이드 폴더 나 동료에게 사용자 권한을 할당하거나 폴더에 첨부 파일을 추가합니다.
  4. 디지털 슬라이드 뷰어에 나타납니다 원하는 디지털 슬라이드를 클릭하십시오.
  5. 배율 도구를 사용하여 슬라이드를 평가하고 ngTMA로의 통합에 대한 관심 영역을 찾아.
  6. 'TMA 주석 도구'를 이용하여, 원하는 코어의 크기 및 주석의 컬러를 선택한다. (그림 4B) 그것을 클릭하여 디지털 슬라이드에 주석을 배치합니다.
  7. ngTMA (그림 4C)에 통합에 대해 원하는 조직 학적 구조에 주석을 이동합니다.
  8. 코어 크기 및 원하는 색상을 주석, 주석 도구를 사용하여 선택하여 다시 주석이 과정을 반복한다. 폴더에있는 모든 슬라이드의 슬라이드보기 및 주석을 반복합니다.
  9. 또한, TMA에 0.2 ml의 튜브보다는 통합으로 PCR을위한 조직 코어를 배치합니다. 식별하기 위해 다른 색상을 사용하여 슬라이드를 주석더 분​​자 분석을 위해 이러한 관광 명소입니다.
  10. 해당 주석과 색상으로 모든 경우의 목록을 작성합니다.

(4) 조직 마이크로 어레이 건설

  1. 조직 microarraying에 대해 원하는 순서로 블록을 정렬 모든 주석 디지털 슬라이드에 해당하는 파라핀 조직 블록을 검색합니다.
  2. 조직 블록은 4mm 두께의 최소 권한이 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 조직의 reembedding 필요하다.
  3. 자동화 된 조직 마이크로 어 악기 "ON"PC 전원을 켭니다. 조직 마이크로 어 소프트웨어를 열고 프로젝트에 이름을 제공
  4. "도구 변경"을 수행하고 프로젝트에 필요한 공구 직경을 선택 (즉, 0.6, 1.0, 1.5, 또는 2.0 mm).
  5. 기계에 12 '받는 사람'TMA 블록까지 넣습니다. 12 블록들 각각에 ID를 보내기
  6. 받는 사람 각각의 블록에 대한 TMA 레이아웃을 만듭니다. 행, 열 및 empt의 수와 TMA 디자인을 준수Y 라인뿐만 아니라 코어 사이의 거리입니다. 받는 사람 각각의 블록에 대한 새로운 레이아웃을 만들거나 반복적으로 동일한 레이아웃을 사용합니다.
  7. 첫 번째 코어를 적용하려면받는 사람 블록 레이아웃에 커서를 놓습니다.
  8. 다음으로, 조직 마이크로 어 (그림 5A)에 60 기증자 블록까지로드합니다. 각 블록에게 기증자의 ID를 부여 F. 각 행의 열 블록을 배치합니다. 조직 마이크로 어에 의해 자동적으로 취득 된 컴퓨터 화면에 각 공여 블록의 화상을 관찰한다.
  9. 첫 번째 블록을 시작으로, "슬라이드"를 클릭하십시오. 디지털 슬라이드 뷰어를 사용하여 디지털 슬라이드 관리 센터에 (또는 외부 드라이브에) 저장 주석 디지털 슬라이드를 관찰한다. 공여 블록의 이미지와 디지털 슬라이드 나란히보기.
  10. 블록 이미지를 선택 기준점은 디지털 슬라이드 기증자 블록 이미지를 중첩합니다
  11. "다음"을 클릭 한 후, 블록의 큰 이미지에 주석을 관찰합니다. (그림 5B </ strong>에서)​​. 확인하고 "시작"을 클릭하여 주석의 상단을 클릭합니다.
    참고 :이 선택한 시작 지점에서받는 사람 블록에 직경 0.6 mm의 구멍을 드릴 시작하는 조직 마이크로 어를 묻는 메시지가 나타납니다. 이어서 제 2 단계에서, 펀칭 공구를 이용하면, 기기는 정확한 주석 및 확인 영역에서 도너 선택된 블록으로부터 조직에 구멍을 펀치. 코어는 다음받는 사람 블록에 기증자로부터 전송됩니다.
  12. 약 500 코어 후, 자일 렌의 면봉을 사용하여 드릴 구멍을 뚫는 도구를 청소합니다.
  13. 조직 코어가 (오히려 ngTMA에 펀치보다) 원하는 경우, 블록에 대한 "PCR"도구를 클릭 4 주석까지 확인하고 공격 "시작". 이 펀치와 0.2 ML 튜브에 코어를 전송합니다.
  14. 반복 포인트 제 공여 블록 4.9-4.11 등.
  15. 모든 기증자의 블록을 사용한 후, 조직 마이크로 어레이에 공여 블록의 두 번째 라운드 (61-120)을 입력어 및 단계 4.11에 4.8을 계속합니다.
  16. 프로젝트 진행 드릴링 및 펀칭 (그림 5C)를 발생하는 동안 동안 기증자와받는 사람 블록 이미지를 새로 고칩니다.
  17. 프로젝트를 완료 한 후 "내보내기"를 수행합니다. 기증자와받는 사람 차단 ID로 .xslx 파일을 찾아 내 보낸 폴더에있는 TMA 내의 모든 펀치뿐만 아니라 TMA 레이아웃 / 디자인의 현지화. 내 보낸 폴더 (그림 5D)에서 JPG 이미지로 모든 중첩 주석 모든 기증자 블록 이미지를 저장합니다. 마지막 TMA 블록은 준비가되어 있습니다.

Representative Results

계획 및 설계

여기서는 생체의 특정 시리즈로 조사되는 전이성 대장 암 환자 134 예를 사용 하였다. 뿐만 아니라 ngTMA는 이러한 환자에 대한 계획,하지만 DNA 추출은 일부 특정 유전자 돌연변이 분석옵니다.

ngTMA의 계획 및 설계 단계에서 다음과 같은 측면이 결정되었다. 각 환자에서 6 개의 다른 조직 학적 영역을 조사한다 : 종양 센터, 종양 침윤 앞, 밀도 종양의 영역 (종양 / 기질 상호 작용), 정상 조직, 림프절 전이 및 간 전이 신진. 종양 조직 면적 당 세 종양 반점이 정상 조직 스팟 프로젝트 (N = 환자 당 17 점)으로 포함되어야한다. 이 50 개 이상의 생체 물질이 환자에 조사하는 것이 예정되어 있기 때문에, 최종 ngTMA 두 복사본이 요구된다. 인해 림프절 및 distan의 가능한 작은 크기로t 전이는 모든 조직에 대한 TMA 건설을위한 0.6 mm의 작은 코어 직경이 선택됩니다.

또한, 서로 다른 조직 학적 영역을 포함하는 6 ngTMAs이 생산 될 수 있도록 각 지역이 개별적으로 배열하는 것이 계획되어있다 : ngTMA가) 종양 센터에서 조직을 포함, b)에 침입 앞, C) 종양 신진 지역, D) 정상 조직 , E) 림프절 전이, 및 F) 간전.

0.6 mm의 공구를 이용하여 TMA 디자인, 펀치 사이에 0.4 mm의 거리를 편안하게 선택 될 것이다. 긴 행과 열로 조직 스폿의 평가가 자주 무심이므로, 두 가지 디자인이 선택된다. 조직 면적 당 3 펀치 종양 블록의 경우, 여섯 부분을 포함하는 디자인이 만들어집니다. 이것은 402 티슈 펀치의 총 수에 이르게. 정상 조직 펀치를 들어, 경우 당이 펀치를 포함한다. 총 432 펀치를 맞는 레이아웃이 선택됩니다.

또한, 각각의 경우에, 최대 40.6 mm의 코어를 추가로 펀칭 및 0.2 ml의 튜브에 배치됩니다. 이러한 조직 코어는 또한 주석이됩니다.

튜브 환자 당 4 코어뿐만 아니라, 요약하면, 다른 조직의 6 ngTMAs가 생산 될 것이다 (일 정상 조직 배열 × 2 펀치 X 134 명 5 종양 배열 × 3 펀치는 134 명의 환자를 X). 이와 함께, 2814 주석이 될 것이다.

다음, 선택된 환자에서 해당 H & E 슬라이드는 슬라이드 아카이브에서 검색됩니다. 각각의 경우 간단히 병리학 자에 의해 검토되며, 각 조직 유형의 가장 대표적인 슬라이드가 선택됩니다.

검색

각 조직 학적 섹션의 디지털 슬라이드는 미래의 주석을 위해 만들어집니다. 본 연구의 경우, 3-4 조직 슬라이드 가능성이 인접한 정상 조직, 림프절 전이 및 간 전이 및 추가 슬라이드 콘으로 사용하거나 사용하지 않고, 경우, 기본 대장 암 당 스캔 할정상 점막 이닝.

최대 10 개의 서로 다른 잡지가 완전히 슬라이드 스캐너에로드 될 수 있습니다 따라서 250 슬라이드는 하나의 실행에 스캔 할 수 있습니다. 스캐닝 및 디지털 슬라이드 크기 시간 조직 및 원하는 품질 계수의 크기에 따라 달라진다. 이 스캔 품질의 두드러진 손실없이 모든 주사 작은 파일 크기를 생성 이후 0부터 100까지 여기서 품질 계수의 범위는, (60)의 품질 계수가 선택된다. 작은 생검은 30 초 아래로 스캔 할 수 있지만 2 내지 10 분 걸릴 수있다 본 실시 예에 사용 된 것과 같은 전체 조직 절편이. 디지털 슬라이드 크기도 2메가바이트에서 2 GB까지를 범위로 할 수 있습니다. (60) 품질 계수를 사용 6백메가바이트 및 1기가바이트 일어난다 사이 스캔한다.

(402) 사이 및 536 슬라이드는 3 스캔 실행에 달하는이 프로젝트에 필요합니다. 각 실행 밤새 수행됩니다. 약의 저장 공간 5백기가바이트이​​ 필요합니다. 슬라이드 케이스 센터라는 디지털 플랫폼에 직접 스캔 (ngtma.unibe.pathcasecenter). 케이스 센터는 지정된 사용자 이름과 암호를 입력하여 어디서나 웹 액세스에서 액세스 할 수 있습니다.

주석

주석의 경우, 두 가지 측면이 고려되어야한다 : 1) 다양한 조직 영역을 다른 색 주석 주어져야한다, 2) 주석 번호가 최종 ngTMA의 원하는 매수를 반영해야한다.

이 경우, 하나의 카피에 대한 종양 면적당 3 스폿이 선택되었다. 이 사본의 경우, 각 영역은 6 점을 사용하여 주석을해야합니다. 유용한 원격 전이에 대한 림프절 전이, 청록색 검은 색 지역이 될에 마지막으로 흰색 (종양 / 기질)의 상호 작용, 신진 종양의 영역에 대한 레드, 종양의 침략 앞에 노란색, 종양 센터, 블루, 정상 조직에 대한 녹색 튜브에 사용됩니다. 각각의 경우의 주석 2-3 분을 필요로한다.

ngTMA 건설

이 연구는 6 ngTMA 블록 t이 필요합니다O 12 마지막 블록의 결과로,이 사본으로 구성 될 수있다. 각 블록은 종양 조직 402 반점을 포함하고 각각의 정상 조직 블록은 전체 프로젝트에 걸쳐 4556 점의 합계 268 점을 포함 arrayer에 의해 지원 될 수있는 수신자 블록의 최대 수는 12이다.

TMA 레이아웃은 각 수신자 블록에 대해 작성되고 프로젝트는 (그림 6A, 6B)에 저장됩니다. 60 조직 블록은 병렬로 조직 마이크로 어에로드 될 수있다; 각 기증자 블록의 이미지가 촬영됩니다. 첫 번째 기증자 블록을 시작으로, 해당 주석이 디지털 슬라이드 케이스 센터에서 검색됩니다. 슬라이드 매칭은 1-3 분 정도 소요될 수있는 수행됩니다. 주석이 확인되고 arrayer (그림 7)를 펀칭 시작하라는 메시지가 표시됩니다. 코어 펀칭 및 전송 시간은 약 12​​ 초이다. 이 절차를 수행하는 동안 코어의 손실을 최소화합니다. 이 프로젝트를으로 배열에 대한 총 시간은 SLI를위한 시간을 포함하여 약 24 시간이다드 / 블록 매칭 및 장비의 재로드. ngTMA의 몇 가지 예는도 8a에 도시되어있다. 이후 분자 분석을위한 코어는이 시간 (도 8b)에 펀칭 할 수 있습니다.

그림 1
그림 1 A) A '기증자'블록. 기증자 블록에서 코어는 펀칭 및 B) 차단 된받는 사람, 또는 조직 마이크로 어레이 (TMA)로 전송됩니다.

그림이
병리학 f를 부여 그림 2 기존의 조직 마이크로 어레이 워크 플로우.) 조직 학적 슬라이드가 아카이브와 B에서 검색됩니다) 또는 검토. CD) 주석이 전송을위한 '추정'영역을 나타내는 슬라이드에 만들어집니다. E)을 해당 조직 블록이 검색됩니다. F) 블록 및 슬라이드 일치에 비교되고있는 G 할 수 있습니다) 때로는 어려운 작업이 될 수. HJ ) 조직 microarraying 다음에 일어난 일. K) 코어 반복적으로 전송 및 L) 최종 TMA가 구성되어있다.

그림 3
슬라이드 (25)까지도 3)는 품질 계수에 대한 조정) 주사. B 각 잡지에 배치 될 수 있고, 크기는 제조 될 수있다. 스캔 진행 상황을 모니터링 할 수 있습니다.

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그림 4) 스캔 슬라이드는 웹 기반의 플랫폼, 케이스 센터. B) 디지털 슬라이드를 볼 수 있습니다에 업로드 할 수 있습니다. TMA 주석 도구는 사용자가 주석 디지털 슬라이드에 직접 배치 할 수 있습니다) 주석. C에 필요한 핵심 크기와 색상을 선택할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
60 블록까지도 5)가 수행되는 조직 마이크로 어, 즉 로우 당 10 공여 블록 (12)과 수신자 블록도. B) 각각의 도너의 이미지 블록에로드 할 수 DIGITA리터 슬라이드가 검색됩니다. 블록과 슬라이드의 매칭이 수행되며, 주석이 블록 펀칭 악기 펀칭 동안으로 배열의 진행 상황을 모니터링 할 수있다. C). D)에 사용되는 천공이 수행 된 후, 레이아웃의 각 스폿의 위치의 수출하지만 또한 해당 주석 각 도너 블록의 화상이 이루어진다.

그림 6
도 6. 선택된 TMA 레이아웃 A) 종양 블록 및 B)으로 배열 정상 조직을 사용 하였다.

그림 7
조직 마이크로 어 소프트웨어의 그림 7. 스크린 샷. 왼쪽의 12 재cipient 블록은 악기에 배치 할 수 있습니다. 아래에서 각 기증자 블록의 이미지를 가져옵니다. 센터, TMA 레이아웃에서는 펀칭 진행뿐만 아니라 주석 각 도너 블록의 확대 된 이미지가 발견된다.

그림 8
그림 8) 새로 만든 ngTMA 블록의 몇 가지 예입니다. B) 추가 조직 펀치 후속 분자 분석을 수행 할 수 있습니다. 이 코어는 펀칭 및 0.2 ml의 튜브에 배치됩니다.

그림 9
그림 ngTMA 바이오 마커 응용 프로그램 (9) 예. 대장 암에서 Ki67의 A) 면역 조직 화학 염색. 듀얼 HER2의 면역 조직 화학 / 현장에서) 저 단백질 (갈색의 표현) 및 센트로 (빨간색)에의 HER2 유전자 (검정) 상대없이 증폭 B를 보여주는 하이브리드 분석, C) 단백질 (갈색)과의 HER2 유전자 증폭의 고 발현을 ( 유방암 ngTMA 단일 mRNA의 성적을 보여주는의 HER2 현장 하이브리드의 중심 소체 (빨간색). D) 원체 검은 색) 상대. 대장 암의 CD8에 대한 E) 면역 조직 화학. F) 팬 아세포 마커 AE1 / AE3 (갈색 이중 면역 조직 화학 염색, 종양 세포) 및 CD68 (적색,. 대 식세포) 대장 암에서 종양 미세 환경을 강조은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

본 논문에서는 ngTMA을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. ngTMA 계획 및 디자인, 디지털 병리 및 슬라이드 주석을 포함하는 조직 microarraying뿐만 아니라 자동화 된 조직 microarraying 12 새로 설립 된 개념이다.

기존의 조직 microarraying에 비해 ngTMA은 많은 이점을 제공한다. 제 1 단계에서, 계획 및 설계 상 매우 중요하다. 초점은 대상 연구 질문에 대답입니다. 이 고려해야 할 조직 학적 문제 (예를 들어, 얼마나 많은 관광 명소가 내가 원하는 않는 지역과 포함하는 방법?), 통계 계획 (예를 들어, 표본의 크기? 나중에 내 샘플을 분석하는 방법은?) 및 물류 고려 사항 (예를 들어, 어떻게 많은 바이오 마커 때문에 얼마나 많은 ngTMA 복사?). 특정 ngTMA는 바이오 마커 검사 및 높은 처리량에 대한 것인지, 특정 요구했다 또는 몇 잘 선택 CAS의 특정 조직 학적 측면을 연구하기위한 것입니다에스.

하나가 아닌 경우, 기존의 조직 microarraying의 가장 중요한 단점은 조직 학적 슬라이드의 표시가 만들어지는과 낮은 정확도이다. 특정 조직 학적 구조, 세포 또는 지역의 연구는 거의 불가능 이루어집니다. 주석이 디지털 슬라이드에 직접 배치되기 때문에 ngTMA 높은 정확성을 위해 수 있습니다. 이 정확하게 영역을 선택할 수있는 연구원이 특정 세포를 포함, 펀칭 할 수 있습니다. 이 예에서, 동일한 조직 블록 내의 다양한 영역들은 그러한 작은 종양 세포 클러스터 또는 단일 세포의 존재에 의해 강조 종양 센터, 내습 전면 및 종양 / 기질 상호 작용의 영역으로서,으로 배열 대해 펀칭된다. 이 정확도는 ngTMA을 사용하여 달성 될 수있다. 슬라이드를 웹 기반의 디지털 플랫폼으로 스캔하기 때문에 셋째, 볼을 밀어 주석이 컴퓨터를 통해이 아닌 현미경으로 할 수있다. 조직으로 배열 소프트웨어는 사용자 친화적 인 제공유연성의 고차 따라서 다른 레이아웃 및 디자인 ngTMA 인터페이스가 달성 될 수있다. TMA 건설 시추에 의해 자동으로 수행되어 있기 때문에, 손에 기동 및 건설 시간이 크게 줄어 듭니다 거의 필요가있다. 여기이 예에서 TMA 건설을위한 시간은 24 시간 사이입니다. 기존 TMA 접근 방식을 사용하고 시간 당 15 펀치를 추정하는이 프로젝트는 약 304 시간을 걸릴 것이다.

ngTMA 단백질 발현의 mRNA 또는 DNA뿐 아니라 이들의 조합을 연구하기 위해 적용될 수있다. 9 잠재적 바이오 마커에 ​​이러한 애플리케이션의 몇몇 예시도. 표준 면역 조직 화학은 기-67을 이용하여 암의 증식 지수를 결정하기 위해 적용될 수있다. 이러한 HER2와 같은 유전자 단백질 발현과 DNA 증폭을 조사하기 위해 결합 방법이 사용될 수있다. 조직은 비용, 조직 및 다른 자원 사용량을 줄이기 위해 단일 ​​ngTMA 함께 수집 될 수있다의. 또한, HER2 유전자 및 기타 원위치 혼성화에서 발색은 mRNA의 조직 슬라이드의 최소 수를 사용하는 경우에는 많은 수의 단일의 mRNA 전 사체를 식별하기 위해 수행 될 수있다. 이러한 면역 CD8 마커의 면역는 종양 미세 환경의 컨텍스트에서 시각화 될 수있다. 이중 면역 조직 화학 염색은 또한 암의 침략 앞에 (갈색에 표시) 면역 (빨간색으로 표시) 세포와 종양 세포 사이의 상호 작용으로 관심의 특정 영역을 강조하는 데 사용할 수 있습니다. 관심의 이러한 영역은 기존의 조직 microarraying를 사용하여 캡처 한 수 없었다.

그럼에도 불구하고,이 프로토콜은 몇 가지 제한 사항이 포함되어 있습니다. 가장 중요한 과제는 공여 블록 및 디지털 슬라이드 사이의 중첩이다. 여러 가지 요인이 단계에 영향을 미칠 수있다. 먼저, 블록의 최신 섹션 슬라이드 스캐닝을 위해 사용되어야한다. 많은 경우에, H & E는 공여 블록 rathe의 마지막 섹션 아니다연구는 면역 조직 화학 또는 다른 얼룩입니다. 마지막 얼룩이 스캔 주석 또는 새로운 H & E가 이루어져야한다이 경우, 또한 염색 한 슬라이드는 이용 될 수있다. 조직 슬라이드 블록의 도전적인 일치에 이르게 물을 욕조에 확장 수 있으므로 조직 섹션이 만들어지고있는 경우주의가 또한주의해야한다. 둘째, 순간 프로젝트는 한 번에 처리 12받는 TMA 블록으로 제한된다. 12 TMAs를 초과하는 큰 프로젝트는 두 번째 프로젝트 이름에 할당해야합니다. 셋째, 기증자 블록은 다양한 크기 자체를 조정할 수 없습니다 기기 등의 표준 금형 및 카세트를 사용해야합니다. 마지막으로 공여 블록은 최적의 천공을 달성하기 최소 높이 (4mm)를 초과해야한다. 일부 경우에서, 이것은 조직 reembedding을 필요로한다.

지난 몇 년 동안 출판 수백명의 바이오 마커 연구를위한 귀중한 도구로 TMA를 강조 표시합니다. TMAs는 폐암 13, 대장 7, BRE를 연구하는 데 사용되었습니다AST (14), 전립선 암 (15), 췌장 (16), 방광 (17), 그리고 위 18 암, 몇 가지 이름을 지정합니다. 저자의 수가 증가하고 이미지 분석 상당한 진보가이 방향으로 19 ~ 21 절에서 이루어지고있다와 TMAs의 사용을 결합했다. 그러나, 혁신적인 TMA 아이디어 22-24을 게시 한 연구 그룹의 소수 옆에 작은 관심은 TMA 기술 자체를 최적화하기 위해 주어졌다. 같은 ATA-27 Estigen / 비처하는 등 자동화 된 조직 microarrayers는 레이아웃 설계 및 편법 및 자동화 된 조직 펀치를 제공 할. 그러나 이것은 ngTMA 개념의 단지 한 측면을 나타냅니다.

ngTMA은 기존의 조직 microarraying 기술을 통해 상당한 개선이다. 그것은 디지털 병리의 유연성과 속도와 자동화 된 TMA 건설의 신뢰성 디지털 주석의 정밀도와 조직 학적 및 TMA 디자인에 대한 전문 지식을 통합합니다. ngTM의 조합단백질 분자 바이오 마커의 평가 용 화상 분석은 상기 미래 임상 연구 및 병진의 품질을 향상 할 수있는 강력한 도구가 될 것이다.

Acknowledgments

저자는 중개 연구단의 기술 직원을 감사하고 싶습니다; 메리 Economou, 호세 갈반, 캐롤라인 망치, 도미니크 뮐러 Liliane Schöni 및 병리학 연구소 정보학 팀, 베른의 대학.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pannoramic 250 Flash II 3DHistech Slide scanner
TMA Grandmaster 3DHistech Tissue Microarrayer
Pannoramic Viewer 3DHistech free Slide viewing software
Case Center 3DHistech Digital slide platform

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References

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바이오 마커 연구 차세대 조직 마이크로 어레이 (ngTMA) 프로토콜
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Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).More

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).

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