이 프로토콜은 바이오 마커 연구를위한 건설 및 조직 마이크로 어레이의 품질을 최적화하는 것을 목표로하고있다. 그것은 계획 및 디자인, 디지털 병리학, 가상 슬라이드 주석 및 자동화 된 조직으로 배열의 측면을 포함한다.
바이오 마커 연구는 조직 마이크로 어레이 (TMA)에 의존한다. TMAs는 '수신자 블록으로'공여체 '작은 블록으로부터 조직 코어의 반복 전송에 의해 제조 한 후 바이오 마커 다양한 애플리케이션에 사용된다. TMAs 종래의 구조는 노동 집약적 부정확하고 시간 소모적이다. 여기서, 차세대 조직 마이크로 어레이를 사용하여 프로토콜 (ngTMA)가 개설된다. ngTMA는 TMA 계획 및 디자인, 디지털 병리학, 그리고 자동화 된 조직 microarraying을 기반으로합니다. 프로토콜은 134 전이성 직장 결장암 환자의 예를 사용하여 설명한다. 조직 학적 통계 및 물류 측면은 이러한 TMA, TMA 복사본 티슈 반점, 샘플 크기, 통계 분석 수, 및 번호에 포함 조직 유형, 특정 조직 학적 영역, 및 세포 유형으로 고려된다. 각 환자에 대한 조직 학적 슬라이드 스캔 및 웹 기반의 디지털 플랫폼에 업로드됩니다. 거기에, 그들은 볼 수 있으며 앤 아르otated 0.6-2.0 mm 직경 도구, 조직 영역을 구별하기 위해 다양한 색상을 사용하여 여러 번 사용하여 (표시). 기증자 블록 12 '받는 사람'블록은 악기에로드됩니다. 디지털 슬라이드를 검색 및 기증자 블록 이미지를 일치합니다. 주석 영역의 반복으로 배열 자동 ngTMA의 결과로 수행됩니다. 이 예에서, 여섯 ngTMAs은 여섯 가지 조직 유형 / 조직 학적 영역을 포함하는 계획이다. ngTMAs의 두 사본이 요구된다. 스캔 각 환자에 대한 사 슬라이드에 세; 3 스캔 실행이 필요 하룻밤을 수행합니다. 모든 슬라이드는 주석 아르; 다른 색상은 서로 다른 조직 / 영역, 즉 종양 센터, 침략 앞에, 종양 / 기질, 림프절 전이, 간 전이, 및 정상 조직을 나타내는 데 사용됩니다. 17 주석 / 케이스 통합됩니다 주석을위한 시간은 2-3 분 / 케이스입니다. 12 ngTMAs는 4,556 점을 포함하는 생산됩니다. 시간들을 배열하면 15 ~ 20 시간이다. 때문에 정밀도, 유연성, 속도, ngTMA은 강력하다상기 TMAs의 품질을 개선하는 도구 및 병진 임상 연구에 사용되는.
지난 20 년 동안 조직 마이크로 어레이 (TMAs)는 바이오 마커 조사 연구에 현저한 영향을 미치고있다. TMAs는 파라핀 '기증자'블록에서 단일 TMA '받는 사람'블록으로, 기본적으로 (그림 1) 일반적으로 직경 0.6 ~ 2.0 mm에서 크기에 이르기까지 작은 조직 코어의 반복 전송, 생산 조직 "아카이브"의 아르 한. 작은 크기의 코어를 사용하여, 몇 개의 또는 많은 다른 환자로부터 약 500 가지 조직 스팟은 한 TMA (2)에 배열 될 수있다.
예후 또는 예측 바이오 마커 연구 TMAs의 사용은 많은 장점을 가지고있다. 면역 조직 화학 염색에 의한 단백질 바이오 마커의 발현은 450 명에서 평가 될 예를 생각해 보자. 오히려 블록의 동일한 번호는 구획 (450), 환자 (450)에 슬라이드 면역 얼룩을 수행하는 것보다, 각 샘플에서 작은 코어는 단일 T 상에 배열 될 수있다MA 블록. 다수의 코어는 각각의 개별 환자에서 촬영하더라도, 블록의 최소 개수가 일어난다. 이것은 크게 비용 및 기타 리소스를 감소뿐만 아니라 조직의 낭비를 줄이는 상당한 효과가있다. 조직의 다수를 사용이 또한 적절히 구동있게 연구는 동일한 실험 조건 하에서 평가한다.
TMAs는 다양한 응용 프로그램을 가지고있다. 예를 들어, 이들은 형태학, 단백질 발현, RNA 발현 및 다른 염료 염색 다음 DNA 수차를 연구하는 데 사용할 수 있거나, 동일계 하이브리드 화 3-7 또는 면역 형광 발색 심지어 후. 최근의 연구는 또한, 염색 프로토콜에 내 및 실험실 간 변동을 테스트 특이 또는 특정 유전자 돌연변이에 대한 항체의 감도를 설정하고 국제 협력에서의 단백질 발현의 관찰자 간 재현성을 결정하기 위해 TMAs를 사용했다 <sup> 8-11.
환자 유래의 조직을 사용하여 기존의 TMAs의 건설은 긴 다중 단계 절차 (그림 2)입니다. 그것은 그들이이 검색되는 곳에서 병리학 연구소, 기타 연구소에서 가능한 적절한 경우에 대한 검색 및 아카이브에서 진단 슬라이드의 선택으로 시작된다. 병리학 경우 당 각 슬라이드를 평가하고 연구의 목적을 위해 가장 대표적인 슬라이드를 선택합니다. 다음으로, 관심 영역은 현미경 하에서 직접 펜을 사용하여 표시된다. 이것은 종종 도전과 부정확 만 조직 펀치가에서 촬영해야하는 위치의 "추정"가 발생합니다. 다음으로,이 표시된 슬라이드에 해당하는 파라핀 블록은 아카이브에서 검색됩니다. 블록과 슬라이드 사이의 빠른 비교가 이루어집니다. 반자동 또는 제 티슈 arrayer 사용 도너 블록은 예상 관심 영역에 펀칭하고 수신자 TMA 블록으로 전송. 이으로 배열 기술을 사용 TMAs의 건설 노동 집약적, 시간이 소요, 부정확하고, 유연성이다. 3 부에서 475 점의 TMA 준비는 일의 84 시간이 걸릴 것으로 추정된다.
계획 및 설계 (또는 컨설팅), 조직 학적 전문 지식 및 자동화 된 TMA 12으로 배열과 결합 된 디지털 병리 : TMAs의 건설에 대한 새로운 접근 방식은 최근 병리학 연구소, 세 가지 구성 요소에 의존 베른의 대학에 의해 소개되었다. 함께,이 개념은 차세대 조직 마이크로 어레이 (ngTMA)라고합니다. 이하, ngTMA위한 프로토콜은 전이성 직장 결장암 (134)와 환자의 예에 기초하여 설명한다. 여기서, 일차 종양뿐만 아니라 림프절 전이 및 간전 후속 바이오 마커 분석을위한 ngTMAs으로 배열하여야한다. 또한 각 환자의 작은 조직 코어는 향후 핵산 추출을 위해 요구된다.
본 논문에서는 ngTMA을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. ngTMA 계획 및 디자인, 디지털 병리 및 슬라이드 주석을 포함하는 조직 microarraying뿐만 아니라 자동화 된 조직 microarraying 12 새로 설립 된 개념이다.
기존의 조직 microarraying에 비해 ngTMA은 많은 이점을 제공한다. 제 1 단계에서, 계획 및 설계 상 매우 중요하다. 초점은 대상 연구 질문에 대답입니다. 이 고려해야 할 조직 학적 문제 (예를 들어, 얼마나 많은 관광 명소가 내가 원하는 않는 지역과 포함하는 방법?), 통계 계획 (예를 들어, 표본의 크기? 나중에 내 샘플을 분석하는 방법은?) 및 물류 고려 사항 (예를 들어, 어떻게 많은 바이오 마커 때문에 얼마나 많은 ngTMA 복사?). 특정 ngTMA는 바이오 마커 검사 및 높은 처리량에 대한 것인지, 특정 요구했다 또는 몇 잘 선택 CAS의 특정 조직 학적 측면을 연구하기위한 것입니다에스.
하나가 아닌 경우, 기존의 조직 microarraying의 가장 중요한 단점은 조직 학적 슬라이드의 표시가 만들어지는과 낮은 정확도이다. 특정 조직 학적 구조, 세포 또는 지역의 연구는 거의 불가능 이루어집니다. 주석이 디지털 슬라이드에 직접 배치되기 때문에 ngTMA 높은 정확성을 위해 수 있습니다. 이 정확하게 영역을 선택할 수있는 연구원이 특정 세포를 포함, 펀칭 할 수 있습니다. 이 예에서, 동일한 조직 블록 내의 다양한 영역들은 그러한 작은 종양 세포 클러스터 또는 단일 세포의 존재에 의해 강조 종양 센터, 내습 전면 및 종양 / 기질 상호 작용의 영역으로서,으로 배열 대해 펀칭된다. 이 정확도는 ngTMA을 사용하여 달성 될 수있다. 슬라이드를 웹 기반의 디지털 플랫폼으로 스캔하기 때문에 셋째, 볼을 밀어 주석이 컴퓨터를 통해이 아닌 현미경으로 할 수있다. 조직으로 배열 소프트웨어는 사용자 친화적 인 제공유연성의 고차 따라서 다른 레이아웃 및 디자인 ngTMA 인터페이스가 달성 될 수있다. TMA 건설 시추에 의해 자동으로 수행되어 있기 때문에, 손에 기동 및 건설 시간이 크게 줄어 듭니다 거의 필요가있다. 여기이 예에서 TMA 건설을위한 시간은 24 시간 사이입니다. 기존 TMA 접근 방식을 사용하고 시간 당 15 펀치를 추정하는이 프로젝트는 약 304 시간을 걸릴 것이다.
ngTMA 단백질 발현의 mRNA 또는 DNA뿐 아니라 이들의 조합을 연구하기 위해 적용될 수있다. 9 잠재적 바이오 마커에 이러한 애플리케이션의 몇몇 예시도. 표준 면역 조직 화학은 기-67을 이용하여 암의 증식 지수를 결정하기 위해 적용될 수있다. 이러한 HER2와 같은 유전자 단백질 발현과 DNA 증폭을 조사하기 위해 결합 방법이 사용될 수있다. 조직은 비용, 조직 및 다른 자원 사용량을 줄이기 위해 단일 ngTMA 함께 수집 될 수있다의. 또한, HER2 유전자 및 기타 원위치 혼성화에서 발색은 mRNA의 조직 슬라이드의 최소 수를 사용하는 경우에는 많은 수의 단일의 mRNA 전 사체를 식별하기 위해 수행 될 수있다. 이러한 면역 CD8 마커의 면역는 종양 미세 환경의 컨텍스트에서 시각화 될 수있다. 이중 면역 조직 화학 염색은 또한 암의 침략 앞에 (갈색에 표시) 면역 (빨간색으로 표시) 세포와 종양 세포 사이의 상호 작용으로 관심의 특정 영역을 강조하는 데 사용할 수 있습니다. 관심의 이러한 영역은 기존의 조직 microarraying를 사용하여 캡처 한 수 없었다.
그럼에도 불구하고,이 프로토콜은 몇 가지 제한 사항이 포함되어 있습니다. 가장 중요한 과제는 공여 블록 및 디지털 슬라이드 사이의 중첩이다. 여러 가지 요인이 단계에 영향을 미칠 수있다. 먼저, 블록의 최신 섹션 슬라이드 스캐닝을 위해 사용되어야한다. 많은 경우에, H & E는 공여 블록 rathe의 마지막 섹션 아니다연구는 면역 조직 화학 또는 다른 얼룩입니다. 마지막 얼룩이 스캔 주석 또는 새로운 H & E가 이루어져야한다이 경우, 또한 염색 한 슬라이드는 이용 될 수있다. 조직 슬라이드 블록의 도전적인 일치에 이르게 물을 욕조에 확장 수 있으므로 조직 섹션이 만들어지고있는 경우주의가 또한주의해야한다. 둘째, 순간 프로젝트는 한 번에 처리 12받는 TMA 블록으로 제한된다. 12 TMAs를 초과하는 큰 프로젝트는 두 번째 프로젝트 이름에 할당해야합니다. 셋째, 기증자 블록은 다양한 크기 자체를 조정할 수 없습니다 기기 등의 표준 금형 및 카세트를 사용해야합니다. 마지막으로 공여 블록은 최적의 천공을 달성하기 최소 높이 (4mm)를 초과해야한다. 일부 경우에서, 이것은 조직 reembedding을 필요로한다.
지난 몇 년 동안 출판 수백명의 바이오 마커 연구를위한 귀중한 도구로 TMA를 강조 표시합니다. TMAs는 폐암 13, 대장 7, BRE를 연구하는 데 사용되었습니다AST (14), 전립선 암 (15), 췌장 (16), 방광 (17), 그리고 위 18 암, 몇 가지 이름을 지정합니다. 저자의 수가 증가하고 이미지 분석 상당한 진보가이 방향으로 19 ~ 21 절에서 이루어지고있다와 TMAs의 사용을 결합했다. 그러나, 혁신적인 TMA 아이디어 22-24을 게시 한 연구 그룹의 소수 옆에 작은 관심은 TMA 기술 자체를 최적화하기 위해 주어졌다. 같은 ATA-27 Estigen / 비처하는 등 자동화 된 조직 microarrayers는 레이아웃 설계 및 편법 및 자동화 된 조직 펀치를 제공 할. 그러나 이것은 ngTMA 개념의 단지 한 측면을 나타냅니다.
ngTMA은 기존의 조직 microarraying 기술을 통해 상당한 개선이다. 그것은 디지털 병리의 유연성과 속도와 자동화 된 TMA 건설의 신뢰성 디지털 주석의 정밀도와 조직 학적 및 TMA 디자인에 대한 전문 지식을 통합합니다. ngTM의 조합단백질 분자 바이오 마커의 평가 용 화상 분석은 상기 미래 임상 연구 및 병진의 품질을 향상 할 수있는 강력한 도구가 될 것이다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 중개 연구단의 기술 직원을 감사하고 싶습니다; 메리 Economou, 호세 갈반, 캐롤라인 망치, 도미니크 뮐러 Liliane Schöni 및 병리학 연구소 정보학 팀, 베른의 대학.
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