O protocolo visa à otimização da construção e qualidade de microarrays de tecido para pesquisa com biomarcadores. Ele inclui aspectos do planejamento e design, patologia digital anotação de slides virtual, e arraying tecido automatizado.
Pesquisa com biomarcadores depende de tissue microarray (TMA). TMA são produzidos por transferência repetida de pequenos fragmentos de tecido a partir de um bloco de "dador" em um bloco de "destinatário" e, em seguida, utilizados para uma variedade de aplicações de biomarcadores. A construção de TMA convencional é de trabalho intensivo, impreciso e demorado. Aqui, um protocolo utilizando tissue microarrays de próxima geração (ngTMA) é descrito. ngTMA é baseada em planejamento TMA e design, patologia digital e microarraying tecido automatizado. O protocolo é ilustrada com um exemplo de 134 pacientes com câncer colorretal metastático. Aspectos histológicos, estatísticos e logísticos são consideradas, tais como o tipo de tecido, as regiões histológicos específicos, e os tipos de células para a inclusão na TMA, o número de pontos de tecido, tamanho da amostra, a análise estatística, e número de cópias de TMA. Lâminas histológicas para cada paciente são digitalizados e enviados para uma plataforma digital com base na web. Lá, eles são vistos e annotated (marcado) usando uma ferramenta de diâmetro 0,6-2,0 mm, várias vezes usando várias cores para distinguir áreas de tecidos. Blocos doadores e 12 blocos de "destinatário" são carregados no instrumento. Diapositivos digitais são recuperadas e combinadas a imagens de blocos de doadores. Arraying repetida de regiões anotados é executada automaticamente, resultando em um ngTMA. Neste exemplo, seis ngTMAs são planejadas com seis diferentes tipos de tecidos / zonas histológicas. São desejados Dois exemplares dos ngTMAs. Três a quatro lâminas para cada paciente são verificados; 3 corridas de verificação são necessárias e realizado durante a noite. Todas as lâminas são anotadas; cores diferentes são usadas para representar os diferentes tecidos / zonas, ou seja, o centro do tumor, invasão frente, tumor / estroma, metástases em linfonodos, metástases hepáticas e tecido normal. 17 anotações / case são feitas; tempo para anotação é de 2-3 min / case. 12 ngTMAs são produzidos contendo 4.556 pontos. Tempo arraying é de 15-20 horas. Devido à sua precisão, flexibilidade e de velocidade, é um poderoso ngTMAFerramenta para melhorar ainda mais a qualidade de TMA utilizado na investigação clínica e de translação.
Ao longo das duas últimas décadas, tissue microarray (TMAs) tiveram um impacto notável sobre estudos de investigação de biomarcadores. TMA são essencialmente de tecido "armazenamento" produzidos pela transferência repetida de pequenos fragmentos de tecido, tipicamente variando em tamanho de 0,6 a 2,0 mm de diâmetro, a partir de blocos de parafina "dadores" num único bloco de TMA "receptor" (Figura 1) 1. Usando um pequeno tamanho do núcleo, aproximadamente 500 diferentes pontos de tecido de poucos ou muitos pacientes diferentes podem ser dispostos em uma TMA 2.
A utilização de TMA para estudos de biomarcadores preditivos de prognóstico ou tem muitas vantagens. Considere o exemplo em que a expressão de uma proteína biomarcador por imuno-histoquímica é para ser avaliada em 450 pacientes. Em vez de executar 450 imunohistoquímica em 450 pacientes lâminas seccionadas a partir do mesmo número de blocos, pequenos núcleos de cada uma das amostras pode ser dispostos em uma única TBloco MA. Mesmo que vários núcleos são retiradas de cada paciente individual, um número mínimo de blocos são produzidos. Isso tem o efeito de diminuir considerável drasticamente os custos e outros recursos, bem como reduzir o desperdício de tecido. Além disso, este estudo permite apropriadamente alimentado usando um grande número de tecidos, a ser avaliada sob as mesmas condições experimentais.
TMAs ter muitas aplicações diferentes. Por exemplo, eles podem ser usados para estudar a morfologia, a expressão da proteína, a expressão de ARN e as aberrações de DNA após coloração com corantes diferentes, ou após a imuno-histoquímica, ou mesmo cromogénico e hibridação in situ fluorescente 3-7. Estudos recentes também têm utilizado TMAs para testar a variação intra e interlaboratorial em protocolos de coloração, estabelecer especificidade ou sensibilidade de anticorpos para as mutações genéticas específicas, e para determinar a reprodutibilidade interobservador da expressão da proteína em colaborações internacionais <sup> 8-11.
A construção de TMAs tradicional usando tecidos derivados do paciente é um procedimento passo múltiplos de comprimento (Figura 2). Ele começa com uma busca de possíveis casos adequados e seleção de lâminas de diagnóstico dos arquivos em um instituto de patologia, ou outro instituto, de onde são recuperados. O patologista avalia cada slide por caso e seleciona o slide mais representativo para os objetivos do estudo. Em seguida, a região de interesse é marcado usando uma caneta directamente sob o microscópio. Isso é muitas vezes difícil e imprecisa e resulta apenas em uma "estimativa" de onde socos tecido deverão ser tomadas a partir. Em seguida, os blocos de parafina correspondentes a esses slides marcados são recuperadas a partir do arquivo. Uma rápida comparação entre o bloco e slide é feito. Usando um arrayer semi-automatizada ou caseiro tecido, o bloco dador é perfurado na região estimativa de interesse e transferido para um recipiente de blocos TMA. Construção de TMAs usando esta técnica arraying é trabalhoso, demorado e impreciso, e inflexível. Preparando uma TMA de 475 pontos em 3 exemplares é estimada em cerca de 84 horas de trabalho.
Uma nova abordagem para a construção de TMA foi introduzido recentemente pelo Instituto de Patologia da Universidade de Berna, que se baseia em três componentes: planejamento e projeto (ou consultoria), patologia digitais combinados com experiência em histologia e TMA automatizado arraying 12. Juntos, este conceito é chamado de próxima geração Tissue Microarray (ngTMA). Abaixo, um protocolo para ngTMA é descrita com base em um exemplo de 134 pacientes com câncer colorretal metastático. Aqui, os tumores primários, bem como metástases de linfonodos e metástases hepáticas devem ser dispostas em ngTMAs para análise de biomarcadores subseqüente. Adicionalmente, pequenos núcleos de tecido de cada paciente são desejáveis para a extracção de ácido nucleico futuro.
Neste trabalho, um protocolo para ngTMA está delineado. ngTMA é um conceito recém-criado para microarraying tecido que envolve planejamento e design, patologia digital e anotação de slides, bem como automatizado microarraying tecido 12.
Comparado com microarraying tecido convencional, ngTMA oferece muitas vantagens. Em uma primeira etapa, a fase de planejamento e projeto é fundamental. O foco está em responder a uma pergunta de pesquisa orientada. Isso deve levar em consideração as questões histológicos (por exemplo, quais as regiões e quantos pontos eu quero incluir?), O planejamento estatístico (por exemplo, tamanho da amostra? Como posso analisar minhas amostras mais tarde?) E considerações logísticas (por exemplo, como muitos biomarcadores e, portanto, o número de cópias ngTMA?). A ngTMA específica é feita para as necessidades específicas, seja para a triagem de biomarcadores e de alto rendimento ou destinado a estudar os aspectos histológicos específicos em apenas alguns cas bem selecionadoses.
Um deles, se não a, a desvantagem mais importante de microarraying tecido convencional é a baixa precisão com que marcas nas lâminas histológicas são feitas. O estudo das estruturas histológicas, células ou regiões específicas é feito quase impossível. ngTMA permite alta precisão porque as anotações são colocados diretamente nos slides digitais. Isso permite que o pesquisador para selecionar precisamente as regiões a serem perfurados, incluindo células específicas. Neste exemplo, várias áreas dentro do mesmo bloco de tecido são perfurados para fora para arraying, tais como o centro de tumor, frente à invasão e áreas de interação tumor / estroma com destaque para a presença de aglomerados de células tumorais pequenas ou até mesmo uma única célula. Esta precisão só pode ser conseguido usando ngTMA. Em terceiro lugar, porque as lâminas são digitalizadas em uma plataforma digital com base na Web, deslize visualização e anotações podem ser feitas através do computador, em vez de com o microscópio. O software arraying tecido proporciona uma fácil utilizaçãode interface com um elevado grau de flexibilidade, por conseguinte, diferentes disposições de concepção e ngTMA pode ser alcançado. Desde TMA construção é realizada automaticamente por perfuração, há pouca necessidade de se significativamente reduzida prática de manobra e a quantidade de tempo para a construção. O tempo para a construção do TMA, neste exemplo, é aqui entre 24 hr. Usando uma abordagem TMA convencional e estimativa de 15 golpes por hr, o projeto levaria cerca de 304 horas.
ngTMA pode ser aplicado para estudar a expressão de proteínas, o ARNm ou o ADN, bem como combinações destes. Figura 9 ilustra várias destas aplicações para biomarcadores potenciais. Imunohistoquímica padrão podem ser aplicados para determinar o índice de proliferação de cancros utilizando Ki-67. Uma abordagem combinada para investigar a expressão da proteína e a amplificação do ADN por genes, tais como HER2 pode ser utilizado. Os tecidos podem ser reunidos em um único ngTMA para reduzir custos, uso de tecido e outros recursoss. Além disso, o ARNm cromogénico de hibridização in situ para HER2 e outros genes podem ser realizadas para identificar transcritos de mRNA individuais em um grande número de casos, utilizando um número mínimo de lâminas de tecido. A imuno-histoquímica de marcadores imunológicos, tais como CD8 pode ser visualizado no contexto do microambiente do tumor. Imunohistoquímica dupla também pode ser usado para realçar determinadas regiões de interesse, como as interações entre células do sistema imunológico (marcadas em vermelho) e células tumorais (marcadas em marrom) na frente de invasão de cânceres. Tal região de interesse não poderia ter sido capturado usando microarraying tecido convencional.
No entanto, este protocolo contém algumas limitações. O desafio mais importante é a sobreposição entre o bloco de doadores e de slides digital. Vários fatores podem influenciar esta etapa. Em primeiro lugar, o mais tardar a partir da secção de bloqueio deve ser usado para a digitalização de slides. Em muitos casos, a H & E não é a última parte do bloco dador, rather é uma coloração imuno-histoquímica ou outras. Neste caso, também uma lâmina corada pode ser usada, desde que a última mancha é digitalizado e anotada ou um novo H & E deve ser feito. Cuidados também devem ser tomados quando se secções de tecido estão sendo feitas como tecidos podem expandir-se no banho de água que leva a correspondência de um desafio de slides e bloco. Em segundo lugar, no momento em que projectos estão limitados a 12 receptores de blocos TMA transformados em uma única vez. Projetos maiores superiores a 12 TMAs deve ser atribuído a um segundo nome do projeto. Em terceiro lugar, os blocos doadores devem ser feitas a partir de moldes padrão e cassetes como o instrumento não pode ajustar-se a vários tamanhos. Finalmente, blocos dadores deve exceder a altura mínima (4 mm) para conseguir a perfuração óptima. Em alguns casos, isto requer reencaixe dos tecidos.
Centenas de publicações ao longo dos últimos anos destacam a TMA como uma ferramenta de valor inestimável para a pesquisa de biomarcadores. TMA foram usadas para estudar 13 pulmão, colo-rectal 7, breast 14, 15 próstata, pâncreas, 16, 17 da bexiga, e cancros gástricos 18, para citar alguns. Um número crescente de autores combinaram o uso do TMA com a análise de imagens e avanços significativos estão sendo feitos nessa direção 19-21. No entanto, ao lado de um punhado de grupos de pesquisa que tenham publicado idéias inovadoras TMA 22-24, tem sido dada pouca atenção para otimizar a técnica de TMA-se. Microarrayers tecido automatizadas, como o ATA-27 por Estigen / Beecher fornecem projeto de layout e socos tecido expediente e automatizado. Isto representa no entanto apenas um aspecto do conceito ngTMA.
ngTMA é uma melhoria substancial em relação às técnicas convencionais microarraying tecido. Ele incorpora experiência em histologia e design TMA com a flexibilidade de patologia digital ea precisão de anotações digitais com a velocidade ea confiabilidade de construção automatizada TMA. A combinação de ngTMA análise da imagem e para a avaliação de proteína e moleculares biomarcadores será uma ferramenta poderosa para melhorar ainda mais a qualidade da investigação clínica e de translação no futuro.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer à equipe técnica da Unidade de Pesquisa translacional; Mary Economou, José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni ea Equipe de Informática no Instituto de Patologia da Universidade de Berna.
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