Протокол направлен на оптимизацию конструкции и качество ткани микрочипов для биомаркеров исследований. Она включает в себя аспекты планирования и проектирования, цифрового патологии, виртуального слайд аннотации и автоматизированной ткани выстроив.
Биомаркеров исследования опираются на ткани микрочипов (TMA). TMAs производятся путем многократного переноса небольших ядер ткани от "донора" блока в «получателя» блока, а затем используется для различных биомаркеров приложений. Конструкция обычной ТМА является трудоемким, неточным, и отнимает много времени. Вот, протокол с использованием тканевой Microarrays следующего поколения (ngTMA) изложена. ngTMA основана на планировании ТМА и дизайна, цифровой патологии и автоматизированной ткани microarraying. Протокол проиллюстрировано на примере 134 больных метастатическим колоректальным раком. Гистологические, статистические и логистические аспекты рассматриваются, например, от типа ткани, конкретных гистологических регионах, и типов клеток для включения в ТМА, количество ткани пятна, размер выборки, статистический анализ, и количество ТМА копий. Гистологических препаратов для каждого пациента будут отсканированы и загружены на цифровой платформе веб-. Там, они рассматриваются и Эннotated (отмечены) с использованием 0,6-2,0 мм Диаметр инструмента, многократно используя различные цвета, чтобы отличить области тканей. Блоки-доноров и 12 'получателя блоки загружаются в прибор. Цифровые горки извлекаются и согласован с донором блок изображений. Повторное выстроив аннотированных регионов осуществляется автоматически в результате чего ngTMA. В этом примере, шесть ngTMAs планируется содержащий шесть различных типов тканей / гистологические зоны. Два экземпляра ngTMAs желательны. От трех до четырех слайдов для каждого пациента сканируются; 3 работает сканирования необходимы и осуществляется в течение ночи. Все слайды аннотированный; разные цвета используются для представления различных тканей / зоны, а именно опухоли центр, фронт вторжения, опухоли / стромы, метастазами в лимфатические узлы, метастазы в печени, и нормальные ткани. 17 аннотации / корпус изготовлены; Время для аннотации 2-3 мин / случай. 12 ngTMAs производятся содержащий 4556 пятна. Выстроив время составляет 15-20 ч. Благодаря своей точности, гибкости и скорости, ngTMA является мощныминструмент для дальнейшего повышения качества ТМА используется в клинической и поступательного исследования.
За последние два десятилетия, ткани микрочипы (ТМА) имели значительное воздействие на биомаркера следственных исследований. TMAs существу ткани "архивы", произведенные повторного переноса небольших ядер ткани, как правило, размером от 0,6 до 2,0 мм в диаметре, с парафином "доноров" блоков в единый ТМА "получателя" блока (Рисунок 1) 1. С помощью небольшой размер керна, около 500 различных следов ткани из нескольких или многих разных пациентов могут быть сгруппированы в один ТМА 2.
Использование ТМА для прогностический исследований биомаркеров имеет много преимуществ. Рассмотрим пример, в котором экспрессия белка биомаркера с помощью иммуногистохимии должен быть оценен на 450 пациентах. Вместо того, чтобы выполнять 450 иммуногистохимических пятна на 450 слайдов пациентов секционного из того же числа блоков, небольшие стержни из каждого образца могут быть сгруппированы на одной TМ.А. блок. Даже если несколько ядер взяты из каждого отдельного пациента, минимальное количество блоков производятся. Это имеет значительный эффект резко уменьшая расходы и другие ресурсы, а также сокращение тканей атрофию. Кроме того, это позволяет соответствующим питанием исследования с использованием большого количества тканей, которые будут оценены в тех же экспериментальных условиях.
TMAs есть множество различных приложений. Например, они могут быть использованы для изучения морфологии, экспрессии белка, экспрессию РНК и ДНК аберрации последующим окрашиванием с помощью различных красителей, или после иммуногистохимии или хромогенных и даже флуоресценции в гибридизация 3-7. Недавние исследования также используются TMAS протестировать внутрирегиональной и межлабораторных изменение протоколов окрашивания, установить специфику или чувствительность антител для специфических генных мутаций, и для определения межнаблюдательная воспроизводимость экспрессии белка в международном сотрудничестве <suр> 8-11.
Конструкция традиционной ТМА помощью пациента, полученных тканей длинный нескольких Шаг (рисунок 2). Он начинается с поиска возможных соответствующих случаях и отбора диагностических слайдов из архивов в институте патологии, или другого института, откуда они извлекаются. Патологоанатом оценивает каждый слайд каждого конкретного случая и выбирает наиболее представительный слайд для целей исследования. Далее, область интереса отмечен с помощью ручки непосредственно под микроскопом. Это часто сложным и неточным и приводит только в "оценки" о том, где ткани удары должны быть взяты из. Далее, парафиновые блоки, соответствующие этим отмеченных слайдов извлекаются из архива. Быстрое сравнение между блоком и слайд сделан. Использование полуавтоматическом или самодельной ткани arrayer, донор блок штампуют в расчетной области интереса и переносят в получателя ТМА блока. Строительство ТМА используя эту технику выстроив является трудоемким, требует много времени, неточной, и негибкими. Подготовка ТМА из 475 мест в 3-х экземплярах, по оценкам, займет около 84 часов работы.
Новый подход к построению ТМА недавно была введена Институтом патологии, Университет Берна, которая опирается на три составляющие: планирование и проектирование (или консалтинга), цифровой патологии в сочетании с опытом в гистологии и автоматизированная ТМА выстроив 12. Вместе, эта концепция называется следующее поколение тканей микрочипов (ngTMA). Ниже протокол для ngTMA описано на основе примера 134 пациентов с метастатическим колоректальным раком. Здесь, первичные опухоли, а также метастазов в лимфоузлах метастазы в печень и должны быть выстроены в ngTMAs для последующего анализа биомаркеров. Кроме того, небольшие стержни ткани от каждого пациента желательны для будущего экстракции нуклеиновой кислоты.
В данной работе, это протокол для ngTMA изложена. ngTMA является вновь созданной концепция для ткани microarraying включающие планирование и дизайн, цифровой патологии и слайд-аннотации, а также автоматизированное ткани microarraying 12.
По сравнению с обычным ткани microarraying, ngTMA имеет много преимуществ. На первом этапе, планирование и проектирование фаза имеет решающее значение. Основное внимание уделяется отвечая на целевую научно-исследовательскую вопрос. Это следует принимать во внимание гистологические вопросы (например, какие регионы и сколько места я хочу включить?), Статистическая планирования (например, размер выборки? Как я анализирую свои образцы позже?) И техническими проблемами (например, как многие биомаркеры и поэтому, сколько копий ngTMA?). Конкретный ngTMA производится для конкретных потребностей, будь то для скрининга биомаркеров и высокой пропускной или предназначены для изучения конкретных гистологических аспекты лишь на некоторых хорошо выбранной CASэс.
Один, если не самое главное неудобство обычного ткани microarraying является низкая точность, с которой маркировка на гистологических препаратов производятся. Изучение конкретных гистологических структур, клеток или регионах производится почти невозможно. ngTMA позволяет высокой точностью, потому что аннотации размещаются непосредственно на цифровых слайдов. Это позволяет исследователю точно выбрать регионы, которые будут кулаками, в том числе специфических клеток. В этом примере различные области в пределах того же блока ткани штампуют на упорядоченный массив, таких как опухоли центра, вторжение передней и областей опухоли / стромы взаимодействия выделенной в присутствии небольших кластеров опухолевых клеток или даже отдельных клеток. Эта точность может быть достигнута только с помощью ngTMA. В-третьих, потому что слайды сканируются на цифровой платформе веб-сдвиньте осмотр и аннотирования можно сделать с помощью компьютера, а не с микроскопом. Программное обеспечение тканей выстроив предоставляет удобныйинтерфейс с высокой степенью гибкости, поэтому различных макетов и ngTMA дизайна могут быть достигнуты. С ТМА строительство осуществляется автоматически путем сверления, нет особой необходимости для практический маневрирования и количеством времени для строительства значительно снижается. Время для ТМА строительства в этом примере здесь находится между 24 час. Использование традиционного подхода ТМА и оценки 15 ударов в час, этот проект займет около 304 час.
ngTMA могут быть применены для изучения экспрессии белка, мРНК или ДНК, а также их комбинации. Рисунок 9 иллюстрирует некоторые из этих приложений для потенциальных биомаркеров. Стандартный иммуногистохимии может быть применен для определения индекса пролиферации раковых заболеваний с помощью Ki-67. Комбинированный подход, чтобы исследовать экспрессию белка и амплификации ДНК для генов, таких как HER2 может быть использован. Ткани могут быть собраны на одном ngTMA сократить затраты, использование тканей и другой ресурсс. Кроме того, хромогенный мРНК в гибридизация для HER2 и других генов могут быть выполнены, чтобы определить, одиночные транскрипты мРНК в большом количестве случаев, используя минимальное количество ткани слайдов. Иммуногистохимическое иммунных маркеров, таких как CD8 могут быть визуализированы в контексте микроокружения опухоли. Дважды иммуногистохимии также может быть использован, чтобы выделить отдельные области зоны интереса, таких как взаимодействие между иммунными клетками (обозначенный красным цветом) и опухолевых клеток (обозначенный в коричневый цвет) при вторжения перед рака. Такая область интереса не могли быть получены с помощью обычного тканей microarraying.
Тем не менее, этот протокол содержит ряд ограничений. Наиболее важной проблемой является перекрытие между блоком доноров и цифровой слайд. Несколько факторов могут влиять на этот шаг. Во-первых, последнее раздел из блока следует использовать для сканирования слайдов. Во многих случаях, H & E не последний раздел донор блока, КэтR это иммуногистохимическое или другой краситель. В этом случае также окрашивали слайд может быть использован до тех пор, как в последний пятна сканируется и аннотированный или новый Н & Е должно быть сделано. Необходимо также соблюдать осторожность при срезы ткани делаются как ткани могут расширить на водяной бане, что приводит к сложной согласования горкой и блока. Во-вторых, в настоящее время проекты ограничены 12-получателей ТМА блоков обработанных за один раз. Более крупные проекты, превышающие 12 TMAS должны быть назначены на второе имя проекта. В-третьих, доноры блоки должны быть сделаны с использованием стандартных форм и кассет как инструмента не может приспособиться к различным размерам. Наконец, доноры блоки должны превышать минимальную высоту (4 мм) для достижения оптимального бурения. В некоторых случаях, это требует reembedding тканей.
Сотни публикаций за последние несколько лет выделите ТМА как бесценный инструмент для биомаркеров исследований. ТМА были использованы для изучения легких, колоректальный 13 7, BREАСТ 14, простаты 15, поджелудочная железа 16, мочевого пузыря 17, и желудочные 18 раков, чтобы назвать несколько. Все большее число авторов объединили использование ТМА с анализа изображений и значительные успехи, достигнутые в этом направлении 19-21. Тем не менее, рядом с горсткой исследовательских групп, которые опубликованных инновационные идеи TMA 22-24, мало внимания было уделено оптимизации саму технику ТМА. Автоматизированные microarrayers ткани, такие как ATA-27 по Estigen / Бичер предоставляют макета дизайна и целесообразная и автоматизированное тканей штамповки. Это представляет однако только 1 аспект концепции ngTMA.
ngTMA является существенным улучшением по сравнению с традиционными методами ткани microarraying. Она включает в себя экспертизу в гистологии и ТМА дизайна с гибкостью цифровой патологии и точностью цифровых аннотации с скоростью и надежностью автоматизированной ТМА строительства. Сочетание ngTMИ анализа изображений для оценки белковых и молекулярных биомаркеров будет мощным инструментом для дальнейшего повышения качества клинической и трансляционных исследований в будущем.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить технический персонал исследовательского подразделения Переводной; Мэри Economou, Хосе Гальван, Кэролайн Хаммер, Доминик Мюллер, Лилиан Schöni и игрока Информатика в Институте патологии, Университета Берна.
Pannoramic 250 Flash II | 3DHistech | Slide scanner | |
TMA Grandmaster | 3DHistech | Tissue Microarrayer | |
Pannoramic Viewer | 3DHistech | free | Slide viewing software |
Case Center | 3DHistech | Digital slide platform |