Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Следующее поколение тканей микрочипов (ngTMA) Протокол биомаркера исследований

doi: 10.3791/51893 Published: September 23, 2014

Summary

Протокол направлен на оптимизацию конструкции и качество ткани микрочипов для биомаркеров исследований. Она включает в себя аспекты планирования и проектирования, цифрового патологии, виртуального слайд аннотации и автоматизированной ткани выстроив.

Abstract

Биомаркеров исследования опираются на ткани микрочипов (TMA). TMAs производятся путем многократного переноса небольших ядер ткани от "донора" блока в «получателя» блока, а затем используется для различных биомаркеров приложений. Конструкция обычной ТМА является трудоемким, неточным, и отнимает много времени. Вот, протокол с использованием тканевой Microarrays следующего поколения (ngTMA) изложена. ngTMA основана на планировании ТМА и дизайна, цифровой патологии и автоматизированной ткани microarraying. Протокол проиллюстрировано на примере 134 больных метастатическим колоректальным раком. Гистологические, статистические и логистические аспекты рассматриваются, например, от типа ткани, конкретных гистологических регионах, и типов клеток для включения в ТМА, количество ткани пятна, размер выборки, статистический анализ, и количество ТМА копий. Гистологических препаратов для каждого пациента будут отсканированы и загружены на цифровой платформе веб-. Там, они рассматриваются и Эннotated (отмечены) с использованием 0,6-2,0 мм Диаметр инструмента, многократно используя различные цвета, чтобы отличить области тканей. Блоки-доноров и 12 'получателя блоки загружаются в прибор. Цифровые горки извлекаются и согласован с донором блок изображений. Повторное выстроив аннотированных регионов осуществляется автоматически в результате чего ngTMA. В этом примере, шесть ngTMAs планируется содержащий шесть различных типов тканей / гистологические зоны. Два экземпляра ngTMAs желательны. От трех до четырех слайдов для каждого пациента сканируются; 3 работает сканирования необходимы и осуществляется в течение ночи. Все слайды аннотированный; разные цвета используются для представления различных тканей / зоны, а именно опухоли центр, фронт вторжения, опухоли / стромы, метастазами в лимфатические узлы, метастазы в печени, и нормальные ткани. 17 аннотации / корпус изготовлены; Время для аннотации 2-3 мин / случай. 12 ngTMAs производятся содержащий 4556 пятна. Выстроив время составляет 15-20 ч. Благодаря своей точности, гибкости и скорости, ngTMA является мощныминструмент для дальнейшего повышения качества ТМА используется в клинической и поступательного исследования.

Introduction

За последние два десятилетия, ткани микрочипы (ТМА) имели значительное воздействие на биомаркера следственных исследований. TMAs существу ткани "архивы", произведенные повторного переноса небольших ядер ткани, как правило, размером от 0,6 до 2,0 мм в диаметре, с парафином "доноров" блоков в единый ТМА "получателя" блока (Рисунок 1) 1. С помощью небольшой размер керна, около 500 различных следов ткани из нескольких или многих разных пациентов могут быть сгруппированы в один ТМА 2.

Использование ТМА для прогностический исследований биомаркеров имеет много преимуществ. Рассмотрим пример, в котором экспрессия белка биомаркера с помощью иммуногистохимии должен быть оценен на 450 пациентах. Вместо того, чтобы выполнять 450 иммуногистохимических пятна на 450 слайдов пациентов секционного из того же числа блоков, небольшие стержни из каждого образца могут быть сгруппированы на одной TМ.А. блок. Даже если несколько ядер взяты из каждого отдельного пациента, минимальное количество блоков производятся. Это имеет значительный эффект резко уменьшая расходы и другие ресурсы, а также сокращение тканей атрофию. Кроме того, это позволяет соответствующим питанием исследования с использованием большого количества тканей, которые будут оценены в тех же экспериментальных условиях.

TMAs есть множество различных приложений. Например, они могут быть использованы для изучения морфологии, экспрессии белка, экспрессию РНК и ДНК аберрации последующим окрашиванием с помощью различных красителей, или после иммуногистохимии или хромогенных и даже флуоресценции в гибридизация 3-7. Недавние исследования также используются TMAS протестировать внутрирегиональной и межлабораторных изменение протоколов окрашивания, установить специфику или чувствительность антител для специфических генных мутаций, и для определения межнаблюдательная воспроизводимость экспрессии белка в международном сотрудничестве

Конструкция традиционной ТМА помощью пациента, полученных тканей длинный нескольких Шаг (рисунок 2). Он начинается с поиска возможных соответствующих случаях и отбора диагностических слайдов из архивов в институте патологии, или другого института, откуда они извлекаются. Патологоанатом оценивает каждый слайд каждого конкретного случая и выбирает наиболее представительный слайд для целей исследования. Далее, область интереса отмечен с помощью ручки непосредственно под микроскопом. Это часто сложным и неточным и приводит только в "оценки" о том, где ткани удары должны быть взяты из. Далее, парафиновые блоки, соответствующие этим отмеченных слайдов извлекаются из архива. Быстрое сравнение между блоком и слайд сделан. Использование полуавтоматическом или самодельной ткани arrayer, донор блок штампуют в расчетной области интереса и переносят в получателя ТМА блока. Строительство ТМА используя эту технику выстроив является трудоемким, требует много времени, неточной, и негибкими. Подготовка ТМА из 475 мест в 3-х экземплярах, по оценкам, займет около 84 часов работы.

Новый подход к построению ТМА недавно была введена Институтом патологии, Университет Берна, которая опирается на три составляющие: планирование и проектирование (или консалтинга), цифровой патологии в сочетании с опытом в гистологии и автоматизированная ТМА выстроив 12. Вместе, эта концепция называется следующее поколение тканей микрочипов (ngTMA). Ниже протокол для ngTMA описано на основе примера 134 пациентов с метастатическим колоректальным раком. Здесь, первичные опухоли, а также метастазов в лимфоузлах метастазы в печень и должны быть выстроены в ngTMAs для последующего анализа биомаркеров. Кроме того, небольшие стержни ткани от каждого пациента желательны для будущего экстракции нуклеиновой кислоты.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование было одобрено местным комитетом по этике больницы Insel, Берн, Швейцария (07-10-13). Ткани были получены из опухоли банка Берн, Институт патологии, Университета Берна.

1 Проектирование и дизайн (консалтинг)

  1. Подумайте о том, исследовательского вопроса без ответа. Принятие решения о типах тканей, которые будут включены в проект. Определите, что гистологические структуры важны для ответа на вопрос.
  2. Определить самую полезную диаметр ядра и количество ядер на пациента для проекта. Решать вопрос о числе копий следующего поколения ткани Micro Array (ngTMA) в зависимости от суммы биомаркеров, которые будут исследованы.
  3. Рассмотрим статистические аспекты, такие как размер выборки и анализа после ткани микрочипов (TMA) строится. Определить количество больных для включения в исследование и установить контрольных образцов для массива.
  4. Получить гистологические (илидиагностики) гематоксилин-эозином (H & E) слайды каждого пациента. Кратко рассмотрите слайды и определить те, содержащие соответствующую информацию и гистологии для проекта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: новые разделы парафиновых блоков, если специальная окраска или иммуногистохимии слайд желательно для сканирования слайдов и аннотации, вместо H & E слайдов

2 Слайд Сканирование

  1. Включите ПК и сканера слайдов и открытого программного обеспечения сканирования. Выберите "автоматический режим" для яркого сканирования поля от экрана предварительного просмотра.
  2. Нажмите на кнопку "параметров сканирования", чтобы настроить параметры качества слайд. В это время, выберите ли слайды, которые будут непосредственно сканируется на цифровой платформе, доступной сети или на локальном диске (или внешнего накопителя) и установить тип сканирования и количество точек фокусировки.
  3. Нажмите на кнопку "Параметры сервера" для сканирования на "Case центра". На данном этапе, добавить больше журналов, маркировать все слайды и установитьпапка по делу Центра, где горки должны храниться. Каждый журнал может содержать до 25 слайдов.
  4. Проверить качество / чистота фактических гистологических препаратов для сканирования. При необходимости очистить слайдам с 70% этанола.
  5. Нагрузка до 25 слайдов в журнале с этикетки указывая внутрь (3А)
  6. Поместите журнал в сканер. В течение более чем одного журнала, разместить их на верхней части друг друга.
  7. Сканирование можно запустить слайд нажав на зеленую стрелку (Рисунок 3В). Когда все слайды сканируются, разгрузить журналы и отключить программы, PC и слайд-сканер.

3 Цифровой Слайд Аннотация

  1. Введите адрес браузера для цифрового центра управления слайд и скачать бесплатный цифровой программу просмотра слайд.
  2. Откройте цифровой программу просмотра слайд и выберите папку, содержащую цифровые слайды (Рисунок 4а).
  3. Добавить заметки, порядок и управлять Digitaл папку слайд или назначать права пользователей коллегам или добавления вложений в папке.
  4. Нажмите на нужную цифровой слайд, который появляется в цифровом зрителя слайд.
  5. С помощью инструмента масштабирования, оценить слайд и найти области, представляющие интерес для интеграции в ngTMA.
  6. Использование 'ТМА аннотации инструмент', выберите размер желаемого ядра и цвет аннотации. Поместите аннотацию на цифровой слайд, щелкнув по нему (4В).
  7. Переместить аннотацию к желаемым гистологических структур для включения в ngTMA (Рисунок 4C).
  8. Повторите этот процесс аннотации снова при помощи функции аннотаций, выбрав размер сердцевины и нужный аннотации цвет. Повторите осмотр слайд и аннотации на все слайды в папку.
  9. Кроме того, разместить ядер ткани для ПЦР в 0,2 мл пробирки, а не интеграции в ТМА. Авторство слайды, используя разные цвета, чтобы определитьэти пятна для дальнейшего молекулярного анализа.
  10. Создайте список всех случаях с их соответствующими аннотациями и цветов.

4 Tissue микрочипов Строительство

  1. Получить соответствующие парафин ткани блоки для всех аннотированных цифровых слайдов, Сортировать блоки в для ткани microarraying нужном порядке.
  2. Убедитесь, что ткань блокирует иметь минимум толщиной 4 мм. Если нет, reembedding из ткани необходимо.
  3. Включите ПК "ON" и автоматизирован ткани microarrayer инструмента. Откройте программное обеспечение тканей microarrayer и введите имя для проекта
  4. Выполните "Tool Change" и выберите нужный диаметр инструмента для проекта (т.е., 0,6, 1,0, 1,5, или 2,0 мм).
  5. Нагрузка до 12 "Получатель" ТМА блоков в машину. Приведите ID для каждого из 12 блоков
  6. Создание макета ТМА для каждого блока получателя. Соблюдайте дизайн ТМА с числом строк, столбцов и Emptу линии, а также расстояние между ядрами. Создайте новый макет для каждого блока получателя или использовать тот же макет неоднократно.
  7. Поместите курсор на макете блока получатель сделать первый ядро.
  8. Далее, загрузить до 60 доноров блоков в ткани microarrayer (Рисунок 5А). Поместите десять блоков в каждой строке А до F. Дайте каждого блока доноров ID. Соблюдайте изображения каждого донора блока на экране компьютера, приобретенного автоматически ткани microarrayer.
  9. Начиная с первого блока, нажмите "Авто". Соблюдайте аннотированный цифровой слайд хранится в цифровом центре управления слайд (или на внешнем накопителе), используя цифровой зрителя слайд. Посмотреть изображения доноров блока и цифровой слайд бок о бок.
  10. Выберите ориентиры на блок изображения для наложения донор блока изображения с цифровой слайд
  11. После нажатия кнопки "Далее", соблюдать аннотации на увеличения изображения блока. (5В </ STRONG>). Нажмите на вершине аннотации для подтверждения и нажмите кнопку "Пуск".
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это побуждает тканей microarrayer начать бурение отверстий 0,6 мм в диаметре в блоке получателя в выбранной отправной точки. Затем на втором этапе, с помощью инструмента штамповки, инструмент пробивает отверстие в ткани от выбранного блока доноров в точном аннотированной и подтвержденной области. Ядра, которые затем передаются от донора к блоку получателя.
  12. Примерно через 500 ядер, очистить сверла и пробивая инструмент с помощью тампона из ксилола.
  13. Если ядра ткани желательны (вместо ударов в ngTMA), нажмите на кнопку "ПЦР" инструмент для блока, подтвердить до 4 аннотаций и нажмите "Старт". Это будет удар и передавать ядра в 0,2 мл пробирку.
  14. Повторите точки от 4,9 до 4,11 с второй блок донора, и так далее.
  15. После использования все доноры блоков, ввести второй раунд доноров блоков (61-120) в ткани микрочиповэ и продолжить шаги 4,8 до 4,11.
  16. Обновить доноров и блоков получатель изображения, пока прогресс проекта в процессе бурения и штамповки происходит (рисунок 5в).
  17. Выполнить "Экспорт" после завершения проекта. Найдите файл .xslx с донорами и блочных получатель идентификаторов, локализация всех ударов в пределах ТМА а также ТМА макет / дизайн, в экспортируемый папке. Сохранить все доноров блока изображения со всей наложенной аннотации как JPG изображений в папке экспортированной (Рисунок 5D). Последний блок ТМА после этого она готова.

Representative Results

Проектирование и дизайн

Здесь был использован пример 134 пациентов с метастатическим колоректальным раком, которые расследуются в течение определенного ряда биомаркеров. Мало того, что ngTMA планируется для этих пациентов, но выделения ДНК с последующим мутационного анализа для некоторого заданного гена.

Во время планирования и проектирования фазе ngTMA, следующие аспекты были решены. От каждого пациента, 6 различных гистологических регионы будут исследованы: центр опухоли, инвазии опухоли фронт, районы плотной опухоли бутонизации (опухоли / стромы взаимодействие), нормальную ткань, метастазами в лимфатические узлы и метастазами в печень. Три опухолевые пятен на площади опухоли тканей и две нормальные пятна ткани должны быть включены в проект (п = 17 пятен на одного пациента). Так, планируется, что более 50 биомаркеры быть исследованы на этом пациента материала, две копии окончательного ngTMA желательны. В связи с возможным небольшим размером лимфатического узла и Дистант метастазы, небольшой диаметр сердечника 0,6 мм для ТМА строительства для всех тканей выбирается.

Кроме того, планируется, что в каждом регионе отдельно одевался, так что 6 ngTMAs содержащие различные гистологические области будет производиться: ngTMA содержащий тканей из) центр опухоли, б) вторжение спереди, в) опухоли начинающим области, д) нормальная ткань , е) метастазов в лимфатических узлах, и е) метастазы в печень.

Для проектирования ТМА с использованием 0,6 мм инструмент, удобным расстоянием 0,4 мм между ударами будет выбран. Поскольку оценка тканей пятна в длинных строк и столбцов часто утомительно, выбраны два различных конструкций. Для опухолевых блоков с 3 ударов в область ткани, дизайн, содержащий шесть частей создается. Это приводит к общему числу 402 тканевых ударов. Для нормальных ударов ткани, 2 удары в случае должны быть включены. Макет установки 432 ударов в общей сложности будет выбран.

Кроме того, для каждого случая, до 4Ядра в 0,6 мм будет дополнительно штампуют и помещают в 0,2 мл пробирки. Эти ядра ткани также будут аннотированный.

Подводя итог, 6 ngTMAs из различных тканей будет производиться (5 массивов опухолевые х 3 удары х 134 пациентов; 1 нормальный массив ткани х 2 дыроколы х 134 пациентов) в дополнение к 4 ядер на пациента для труб. Взятые вместе, 2814 аннотации будут.

Далее, соответствующие H & E слайды из отобранных пациентов извлекаются из архива слайдов. Каждый случай кратко отзывы патологоанатом и самая представительная слайды каждого типа ткани выбраны.

Сканирование

Цифровые слайды каждого гистологического среза сделаны для будущего аннотации. Для этого исследования, 3-4 ткани горки, которые будут проверяться в случае, т.е. первичной колоректального рака, с или без прилегающих нормальных тканях, метастазов в лимфоузлах и метастазов в печени и, возможно, дополнительный слайд мошенниковсодержащие нормальную слизистую оболочку.

До 10 различных журналов может быть полностью загружена в слайд-сканера; Поэтому 250 слайдов можно сканировать за один проход. Время для сканирования и цифровой размер слайдов изменяется в зависимости от размеров ткани и добротности желаемого. Диапазоны добротности от 0 до 100 Здесь, добротность 60 выбран, так как он производит меньший сканирования размер файла без заметной потери качества сканирования. Малые биопсии могут быть отсканированы в рамках 30 сек а в разделах вся ткань, как те, которые используются в этом примере может занять от 2 до 10 мин. Цифровой размер слайд может также варьироваться от 2 Мб до 2 Гб. Использование добротность 60, сканирует между 600 Мб и 1 Гб производятся.

Между 402 и 536 слайдов требуются для этого проекта на общую сумму 3 сканирования работает. Каждый прогон выполняется на ночь. Примерно 500 ГБ места для хранения не требуется. Слайды сканируются непосредственно на цифровой платформе под названием Case центр (ngtma.unibe.pathcasecenter). Дело центр доступен из любой точки мира с веб-доступа, введя назначенный имя пользователя и пароль.

Аннотация

Для аннотации, два аспекта следует считать: 1) различные области тканей следует уделять разных цветов аннотации и 2) количество аннотации должен отражать количество требуемых копий окончательного ngTMA.

В этом случае, 3 места в области опухоли на единственном экземпляре, были выбраны. Для 2-х экземплярах, каждый регион должен иметь аннотацию с помощью 6 мест. Полезны зеленый для нормальной ткани, синий для центра опухоли, желтый для вторжения опухоли спереди, красный для областей опухоли начинающим (опухоль / стромы) взаимодействие, черный для метастазов в лимфоузлах, бирюзы для отдаленных метастазов и, наконец, белый для регионов, чтобы быть используется для труб. Аннотация каждом случае требуется 2-3 мин.

ngTMA Строительство

Это исследование требует 6 ngTMA блоки то быть построен в 2-х экземплярах, в результате чего 12 конечных блоков. Максимальное количество блоков получателей, которые могут быть поддержаны arrayer является 12. Каждый блок опухоль будет содержать 402 тканей пятна и каждый нормальный блок ткани будет содержать 268 мест на общую сумму 4 556 мест по всей проекта.

Макет ТМА создается для каждого блока получателя и сохранении проекта (6А, 6Б). 60 тканевые блоки могут быть загружены в ткани microarrayer параллельно; Образ каждого донора блока берется. Начиная с первого доноров блока, соответствующий аннотированный цифровой слайд извлекается из Case центра. Слайд соответствия выполняется, которые могут занять от 1-3 мин. Аннотации подтверждаются и arrayer будет предложено начать пробивать (рисунок 7). Ядро штамповки и время передвижения составляет примерно 12 сек. Потеря сердечников во время этой процедуры является минимальным. Общее время для выстроив этот проект составляет около 24 ч, в том числе время для SLIде / блок сопоставления и перезагрузка прибора. Некоторые примеры ngTMA показаны на фиг.8А. Сердечники для последующего молекулярного анализа также может быть выбиты в это время (Рисунок 8B).

Рисунок 1
Рисунок 1) 'донор' блок. Анализ кернов из доноров блока штампуют и переносят в B) блока получателя, или ткани микрочипов (TMA).

Рисунок 2
Рисунок 2 Обычный рабочий процесс ткани микрочипов.) Гистологических препаратов извлекаются из архива и B) уделяется патологоанатом F или отзыв. CD) Аннотации сделаны на слайдах с указанием 'сайта' регион для передачи. Е) Соответствующие блоки ткани извлекаются. F) Блок и слайд сравниваются для сравнения, которые могут G) иногда быть сложной задачей. HJ ) тканей microarraying то имеет место. K) Сердечники неоднократно передавала и L) окончательное ТМА строится.

Рисунок 3
Рисунок 3) До 25 слайдов могут быть размещены в каждой журнала для сканирования. B) Корректировки к добротности и размер можно сделать. Сканирование прогресс можно наблюдать.

"SRC =" / файлы / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg "ширина =" 600 "/>
Фигура 4) Отсканированные слайды могут быть загружены на веб-платформы, Case центр. B) Цифровые горки можно просмотреть. В аннотации инструмент ТМА позволяет пользователю выбрать размер ядра и необходимое для аннотации. C) Аннотации могут быть размещены непосредственно на цифровой слайд цвет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5) До 60 блоков могут загружают, а именно 10-доноры блоки в ряду и 12 получателей блоки, а также. B) изображения каждого донора блока ткани microarrayer берется, Digitaл слайд извлекается. Согласование блока и слайда делается и аннотации используются для блока штамповки. C) Ход выстроив можно контролировать, когда прибор штамповки. D) После штамповки выполняется, экспорт расположения каждого пятна в макете, но также образ каждого донора блока с соответствующими аннотациями производится.

Рисунок 6
Рисунок 6. Эти макеты ТМА были использованы для упорядоченный массив) опухолевые блоки и б) нормальных тканей.

Рисунок 7
Рисунок 7. Скриншот программного обеспечения тканей microarrayer. Слева, 12 повторноcipient блоки могут быть помещены в приборе. На дне, образы каждого донора блока принимаются. В центре, на макете ТМА, прогресс штамповки, а также увеличенные изображения каждого донора блока с аннотациями найден.

Рисунок 8
Рисунок 8) Некоторые примеры вновь созданных ngTMA блоков. B) Дополнительные удары ткани могут быть приняты для последующего молекулярного анализа. Эти жилы штампуют и помещают в 0,2 мл пробирки.

Рисунок 9
Рисунок 9. Примеры биомаркеров приложений ngTMA.) Иммуногистохимия окрашивание Ki67 в колоректального рака. Двойной HER2 иммуногистохимии / неидентифицированными анализ показывает B) низкую экспрессию белка (коричневый) и не амплификации гена Her2 (черный) по отношению к центромеры (красный), в) высокий уровень экспрессии белка (коричневый) и амплификации генов Her2 ( черный) по отношению к центромеры (красный). D) хромогенные на месте гибридизации Her2 показывая одинокий стенограммы мРНК при раке молочной железы ngTMA. E) Иммуногистохимия для CD8 в колоректального рака. F) Двухместный иммуногистохимии пятно для пан-цитокератин маркера AE1 / AE3 (коричневый; опухолевых клеток) и CD68 (красный;. Макрофагов), подчеркнув микросреду опухоли при раке прямой кишки Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

В данной работе, это протокол для ngTMA изложена. ngTMA является вновь созданной концепция для ткани microarraying включающие планирование и дизайн, цифровой патологии и слайд-аннотации, а также автоматизированное ткани microarraying 12.

По сравнению с обычным ткани microarraying, ngTMA имеет много преимуществ. На первом этапе, планирование и проектирование фаза имеет решающее значение. Основное внимание уделяется отвечая на целевую научно-исследовательскую вопрос. Это следует принимать во внимание гистологические вопросы (например, какие регионы и сколько места я хочу включить?), Статистическая планирования (например, размер выборки? Как я анализирую свои образцы позже?) И техническими проблемами (например, как многие биомаркеры и поэтому, сколько копий ngTMA?). Конкретный ngTMA производится для конкретных потребностей, будь то для скрининга биомаркеров и высокой пропускной или предназначены для изучения конкретных гистологических аспекты лишь на некоторых хорошо выбранной CASэс.

Один, если не самое главное неудобство обычного ткани microarraying является низкая точность, с которой маркировка на гистологических препаратов производятся. Изучение конкретных гистологических структур, клеток или регионах производится почти невозможно. ngTMA позволяет высокой точностью, потому что аннотации размещаются непосредственно на цифровых слайдов. Это позволяет исследователю точно выбрать регионы, которые будут кулаками, в том числе специфических клеток. В этом примере различные области в пределах того же блока ткани штампуют на упорядоченный массив, таких как опухоли центра, вторжение передней и областей опухоли / стромы взаимодействия выделенной в присутствии небольших кластеров опухолевых клеток или даже отдельных клеток. Эта точность может быть достигнута только с помощью ngTMA. В-третьих, потому что слайды сканируются на цифровой платформе веб-сдвиньте осмотр и аннотирования можно сделать с помощью компьютера, а не с микроскопом. Программное обеспечение тканей выстроив предоставляет удобныйинтерфейс с высокой степенью гибкости, поэтому различных макетов и ngTMA дизайна могут быть достигнуты. С ТМА строительство осуществляется автоматически путем сверления, нет особой необходимости для практический маневрирования и количеством времени для строительства значительно снижается. Время для ТМА строительства в этом примере здесь находится между 24 час. Использование традиционного подхода ТМА и оценки 15 ударов в час, этот проект займет около 304 час.

ngTMA могут быть применены для изучения экспрессии белка, мРНК или ДНК, а также их комбинации. Рисунок 9 иллюстрирует некоторые из этих приложений для потенциальных биомаркеров. Стандартный иммуногистохимии может быть применен для определения индекса пролиферации раковых заболеваний с помощью Ki-67. Комбинированный подход, чтобы исследовать экспрессию белка и амплификации ДНК для генов, таких как HER2 может быть использован. Ткани могут быть собраны на одном ngTMA сократить затраты, использование тканей и другой ресурсс. Кроме того, хромогенный мРНК в гибридизация для HER2 и других генов могут быть выполнены, чтобы определить, одиночные транскрипты мРНК в большом количестве случаев, используя минимальное количество ткани слайдов. Иммуногистохимическое иммунных маркеров, таких как CD8 могут быть визуализированы в контексте микроокружения опухоли. Дважды иммуногистохимии также может быть использован, чтобы выделить отдельные области зоны интереса, таких как взаимодействие между иммунными клетками (обозначенный красным цветом) и опухолевых клеток (обозначенный в коричневый цвет) при вторжения перед рака. Такая область интереса не могли быть получены с помощью обычного тканей microarraying.

Тем не менее, этот протокол содержит ряд ограничений. Наиболее важной проблемой является перекрытие между блоком доноров и цифровой слайд. Несколько факторов могут влиять на этот шаг. Во-первых, последнее раздел из блока следует использовать для сканирования слайдов. Во многих случаях, H & E не последний раздел донор блока, КэтR это иммуногистохимическое или другой краситель. В этом случае также окрашивали слайд может быть использован до тех пор, как в последний пятна сканируется и аннотированный или новый Н & Е должно быть сделано. Необходимо также соблюдать осторожность при срезы ткани делаются как ткани могут расширить на водяной бане, что приводит к сложной согласования горкой и блока. Во-вторых, в настоящее время проекты ограничены 12-получателей ТМА блоков обработанных за один раз. Более крупные проекты, превышающие 12 TMAS должны быть назначены на второе имя проекта. В-третьих, доноры блоки должны быть сделаны с использованием стандартных форм и кассет как инструмента не может приспособиться к различным размерам. Наконец, доноры блоки должны превышать минимальную высоту (4 мм) для достижения оптимального бурения. В некоторых случаях, это требует reembedding тканей.

Сотни публикаций за последние несколько лет выделите ТМА как бесценный инструмент для биомаркеров исследований. ТМА были использованы для изучения легких, колоректальный 13 7, BREАСТ 14, простаты 15, поджелудочная железа 16, мочевого пузыря 17, и желудочные 18 раков, чтобы назвать несколько. Все большее число авторов объединили использование ТМА с анализа изображений и значительные успехи, достигнутые в этом направлении 19-21. Тем не менее, рядом с горсткой исследовательских групп, которые опубликованных инновационные идеи TMA 22-24, мало внимания было уделено оптимизации саму технику ТМА. Автоматизированные microarrayers ткани, такие как ATA-27 по Estigen / Бичер предоставляют макета дизайна и целесообразная и автоматизированное тканей штамповки. Это представляет однако только 1 аспект концепции ngTMA.

ngTMA является существенным улучшением по сравнению с традиционными методами ткани microarraying. Она включает в себя экспертизу в гистологии и ТМА дизайна с гибкостью цифровой патологии и точностью цифровых аннотации с скоростью и надежностью автоматизированной ТМА строительства. Сочетание ngTMИ анализа изображений для оценки белковых и молекулярных биомаркеров будет мощным инструментом для дальнейшего повышения качества клинической и трансляционных исследований в будущем.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить технический персонал исследовательского подразделения Переводной; Мэри Economou, Хосе Гальван, Кэролайн Хаммер, Доминик Мюллер, Лилиан Schöni и игрока Информатика в Институте патологии, Университета Берна.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pannoramic 250 Flash II 3DHistech Slide scanner
TMA Grandmaster 3DHistech Tissue Microarrayer
Pannoramic Viewer 3DHistech free Slide viewing software
Case Center 3DHistech Digital slide platform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, 844-847 (1998).
  2. Tzankov, A., Went, P., Zimpfer, A., Dirnhofer, S. Tissue microarray technology: principles, pitfalls and perspectives--lessons learned from hematological malignancies. Exp Gerontol. 40, 737-744 (2005).
  3. Barlund, M., et al. Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis. J Natl Cancer Inst. 92, 1252-1259 (2000).
  4. Bubendorf, L., et al. Survey of gene amplifications during prostate cancer progression by high-throughout fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays. Cancer Res. 59, 803-806 (1999).
  5. Garcia-Caballero, T., et al. Dual-colour CISH is a reliable alternative to FISH for assessment of topoisomerase 2-alpha amplification in breast carcinomas. Breast Cancer Res Treat. 81-89 (2014).
  6. Schraml, P., et al. Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types. Clin Cancer Res. 5, 1966-1975 (1999).
  7. Zlobec, I., et al. Role of RHAMM within the hierarchy of well-established prognostic factors in colorectal cancer. Gut. 57, 1413-1419 (2008).
  8. Hsu, F. D., et al. Tissue microarrays are an effective quality assurance tool for diagnostic immunohistochemistry. Mod Pathol. 15, 1374-1380 (2002).
  9. Marin, C., et al. Detection of BRAF p.V600E Mutations in Melanoma by Immunohistochemistry Has a Good Interobserver Reproducibility. Arch Pathol Lab Med. 71-75 (2014).
  10. Polley, M. Y., et al. An International Ki67 Reproducibility Study. J Natl Cancer Inst. 1897-1906 (2013).
  11. Zlobec, I., Terracciano, L., Jass, J. R., Lugli, A. Value of staining intensity in the interpretation of immunohistochemistry for tumor markers in colorectal cancer. Virchows Arch. 451, 763-769 (2007).
  12. Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: an example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types. J Transl Med. 11, 104 (2013).
  13. Yoshida, A., et al. Immunohistochemical detection of ROS1 is useful for identifying ROS1 rearrangements in lung cancers. Mod Pathol. 711-720 (2014).
  14. Droeser, R., et al. Differential pattern and prognostic significance of CD4+, FOXP3+ and IL-17+ tumor infiltrating lymphocytes in ductal and lobular breast cancers. BMC Cancer. 12, 134 (2012).
  15. Fleischmann, A., et al. Androgen receptors are differentially expressed in Gleason patterns of prostate cancer and down-regulated in matched lymph node metastases. Prostate. 71, 453-460 (2011).
  16. Wang, T., et al. Pattern of breast cancer susceptibility gene 1 expression is a potential prognostic biomarker in resectable pancreatic ductal adenocarcinoma. Pancreas. 42, 977-982 (2013).
  17. Fleischmann, A., Rotzer, D., Seiler, R., Studer, U. E., Thalmann, G. N. Her2 amplification is significantly more frequent in lymph node metastases from urothelial bladder cancer than in the primary tumours. Eur Urol. 60, 350-357 (2011).
  18. Zhang, Z. Q., et al. Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray. World J Gastroenterol. 19, 7795-7803 (2013).
  19. Chaux, A., et al. The epidermal growth factor receptor is frequently overexpressed in penile squamous cell carcinomas: a tissue microarray and digital image analysis study of 112 cases. Hum Pathol. 44, 2690-2695 (2013).
  20. McKenna, S. J., Amaral, T., Akbar, S., Jordan, L., Thompson, A. Immunohistochemical analysis of breast tissue microarray images using contextual classifiers. J Pathol Inform. 4, S13 (2013).
  21. Pages, F., et al. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med. 353, 2654-2666 (2005).
  22. Komiya, A., et al. Application of a new technique, spiral tissue microarrays constructed using needle biopsy specimens, to prostate cancer research. Int J Oncol. 44, 195-202 (2014).
  23. Quintayo, M. A., et al. Virtual tissue microarrays: A novel and viable approach to optimising tissue micro-arrays for biomarker research applied to Ductal Carcinoma in Situ (DCIS). Histopathology. 2-8 (2014).
  24. Torata, N., et al. Tissue tablet method: an efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray. Hum Pathol. 45, 143-152 (2014).
Следующее поколение тканей микрочипов (ngTMA) Протокол биомаркера исследований
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).More

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter