Introduction
أساليب البروتين الاستشعار الدقيقة والسريعة مهمة جدا في التشخيص الطبي والبروتينات. وتستند المصفوفات للكشف عن البروتين الكلاسيكية، مثل biochips، على "قفل ومفتاح" مبدأ الاعتراف وتتطلب مستقبلات محددة مثل الأبتامرات، والأجسام المضادة، أو علم المحاكاة الحيوية.
في السنوات الأخيرة، والاستشعار التفاضلية مستوحاة من الشم والذوق البشري برزت كبديل 1. هذا الأنف الالكتروني / اللسان ويستند (EN / ET) على نهج التفاضلية ملزمة من التحاليل لمجموعة من مستقبلات عبر رد الفعل (CRRs)، التي لا تحتاج إلى أن تكون محددة للغاية أو انتقائية لالجزيئات المستهدفة وبالتالي تسمح للتغلب على شاقة عملية تطوير مستقبلات انتقائية للغاية. هو استجابة مشتركة من جميع المستقبلات التي تخلق نمطا واضحا لكل عينة، مثل بصمات الأصابع، مما يسمح لها هوية.
التحديات الرئيسية لتطوير اثنين من الكابلات الكهربائية المصريةترونيك الأنف / اللسان للاستشعار عن بروتين فعال هي إنتاج عناصر الاستشعار التي لديها القدرة على التمييز بين التحاليل مماثلة هيكليا ونظام التنبيغ الملائم للحدث ملزم. حتى الآن، وقد أفادت دراسات الطرق المختلفة لتطوير مجموعة 2. على سبيل المثال في دراسة واحدة تم وضع تحديد القائم على مجموعة من البروتينات باستخدام CRRs المحضرة من مشتقات رباعي carboxyphenylporphyrin بواسطة اقتران مجموعات الكربوكسيل لمختلف الأحماض الأمينية أو dipeptides لتوفير مستقبلات الفارق حيازة مسعور الأساسية للتقارب للبروتينات والأطراف اتهم متميزة ل إضفاء التفاضلية ملزمة. باستخدام هذا النظام، تم تحديد البروتينات المختلفة، وخليط من البروتين عن طريق قياس التبريد مضان من المستقبلات على التفاعل مع التحاليل 3،4. في دراسة أخرى، ومكتبة من 29 CRRs تحتوي على حمض ثلاثي الببتيد والأنصاف boronic توليفها بطريقة اندماجي على hexasubstiوقد وضعت tuted سقالة البنزين للاستشعار عن البروتينات مع كشف-مؤشر امتصاص اللونية 5،6. مع مثل هذا التصميم، وأظهر قدرة كل مستقبلات ملزمة التفاضلية مع البروتينات على أساس التباين في أحضان الببتيد، والأحماض boronic ساعدت في التفريق بين البروتينات من بروتينات سكرية. وفي الآونة الأخيرة، تم إنشاء مجموعة تتألف من مختلف الموجبة بين functionalized جزيئات الذهب مترافق مع أنيوني بولي الفلورسنت البوليمر (ف phenyleneethynylene) (PPE) لكشف وتحديد البروتينات 7. ربط تنافسية بين التحاليل البروتين وتطفئ PPE / الذهب المجمعات جسيمات متناهية الصغر مجدد مضان، وإنتاج أنماط الاعتراف متميزة للبروتينات. في هذه الدراسة تم ضبطها بين functionalized التفاعلات جسيمات متناهية الصغر من البروتين من خلال تغيير الخصائص الفيزيائية للجماعات نهاية جسيمات متناهية الصغر. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن هذا النهج هو فعال لتحليل البروتين في مجمع المتوسطة والغنية بالبروتين مثلكما المصل البشري في تركيزات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، مما يدل على إمكانات وآخرون في التنميط عينات حقيقية لتشخيص الحالات المرضية 8.
على الرغم من واعدة جدا، وهذه النظم لديها بعض القيود المتأصلة. أنها تتطلب تصميم وتجميع 5-29 CRRs مع هياكل معقدة للغاية. وبالإضافة إلى ذلك، على عكس نظام حاسة الشم التي تتم إعادة تعيين بعد كل قياس، يتطلب البروتين الاستشعار عن إعداد مجموعة لكل عينة. أخيرا، ورصد في الوقت الحقيقي الأحداث ملزمة صعبة للغاية.
في هذا السياق، اقترح نهج اندماجي باستخدام عدد قليل من جزيئات بسيطة ويمكن الوصول إليها بسهولة مع الخصائص الفيزيائية المختلفة (ماء، مسعور، موجبة، سالبة الشحنة، محايد، الخ.) لبنات البناء (BBS) 9. عن طريق خلط بب في نسب متفاوتة ورقابة والسماح للخليط في تقرير المصير، التجمع على سطح الذهب لالمنشور، تم إنشاء مجموعة من الأسطح اندماجي يضم الخصائص الملائمة للبروتين ملزمة. تجدر الإشارة إلى أن الطبقات الوحيدة الذاتي تجميعها على هذا النظام تسمح السهل ضبط مجموعة من خصائص سطح بطريقة متباينة للغاية، مما المتنوعة اندماجي مستقبلات عبر رد الفعل (CoCRRs) إلى أن يتم إنتاجها بسرعة وكفاءة. تم تنفيذ الاستشعار البروتين باستخدام نظام كشف بصري، سطح مأكل التصوير بالرنين (سبري). لفترة وجيزة، وهو واسع شعاع الضوء المستقطب أحادية اللون من LED تضيء كامل منطقة مجموعة CoCRR على سطح المنشور. توفر كاميرا الفيديو عالية الدقة CCD الصور الفرق في الوقت الحقيقي عبر جميع البقع من مجموعة CoCRR. فإنه يلتقط كافة التغييرات المحلية على السطح من مجموعة CoCRR توفير معلومات مفصلة عن ملزم الأحداث والعمليات الحركية 10. وفي الوقت نفسه، مع مساعدة من برامج التصوير، يتم تحويل الصور SPR الموافق البقع تلقائيا إلى الاختلافات انعكاسية VERSUحان الوقت، وتوليد سلسلة من المنحنيات الحركية ملزمة دعا sensorgrams. وبالتالي، سبري يسمح الملاحظة، متزامن، موازية، خالية من التسمية والوقت الحقيقي من الأحداث ملزمة. بالإضافة إلى ذلك، مجموعة CoCRR عليها regenerable ويمكن إعادة استخدامها لتحليل البروتين.
يصف هذا البروتوكول بناء اللسان الإلكترونية باستخدام اثنين فقط من الجزيئات الصغيرة لبنات البناء ويوضح تطبيقها لتحليل البروتينات المشتركة استنادا إلى أنماط الاعتراف مستمرة تم الحصول عليها مع سبري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد محاليل مختلفة وعينات البروتين
- إعداد 100 مل من محلول العازلة الفوسفات (PBS-G) التي تحتوي على 50 ملي ناه 2 ص 4، 50 مم كلوريد الصوديوم، و 10٪ الجلسرين في درجة الحموضة 6.8.
- إعداد 250 مل من HEPES حل العازلة التي تحتوي على 10 ملي HEPES، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.005٪ توين 20 في درجة الحموضة 7.4.
- إعداد محلول المخزون من عرقلة البناء 1 (BB1) اللاكتوز وبناء كتلة 2 (BB2) مكبرت اللاكتوز (الشكل 1) في 0.2 ملي في PBS-G.
- إعداد 1 مل من حلول البروتين في HEPES: وكتين فقري hypogaea (AHL) في 500 نانومتر، الميوجلوبين في 1 ميكرومتر، والليزوزيم في 500 نانومتر.
- تحضير 20 مل من 1٪ SDS في الماء عالى النقاء.
2. إعداد صفيف CoCRR
- تنظيف السطح الذهب من منظور 48 ساعة قبل استخدامها مع نظافة البلازما لمدة 3 دقائق في ظل هذه الظروف: 75٪ أكسجين و 25٪ الأرجون و0.6 م بار، السلطة دبليو 40
- تحضير محلول أحد عشر النقي والمختلطنانوثانية من BB1 و BB2 مع [BB1] / ([BB1] + [BB2]) نسب بين 0 و 100٪ بزيادات من 10٪ في التركيز الكلي BB من 0.1 ملي في PBS-G.
- إيداع 8 قطرات NL من هذه الحلول النقية والمختلطة على سطح المنشور باستخدام نصاب عدم الاتصال في quadruplicate لكل نسبة 44 مع البقع في المجموع (الشكل 2).
ملاحظة: 10٪ الجلسرين وأضاف في برنامج تلفزيوني-G مهمة جدا لتقليل تبخر المذيبات وتغيير BB تركيز بعد الترسيب. - وضع منظور داخل طبق بتري يحتوي على 1 مل من الماء عالى النقاء وترك الأمر O / N في RT لالتجميع الذاتي للBB1 و BB2 على سطح الذهب. هنا، فمن المفترض أن متوسط تكوين السطح في صواريخ سام مختلط يعكس تكوين ترسب الحل المختلط (الشكل 3) 11.
- اغسل منظور مع الماء عالى النقاء ثم جففه تحت تدفق الأرجون.
3. البروتين الاستشعار بواسطة سبري
- تعيين incubatoالتي يتم وضعها ص جهاز سبري عند 25 درجة مئوية لتجنب التغييرات مؤشر الانكسار الناجم عن اختلاف درجة الحرارة أثناء البروتين الاستشعار عن بعد.
- إدراج منظور غير بين functionalized الشطف في 10 ميكرولتر البولي كيتون الأثير (نظرة خاطفة) تدفق خلية متصلة الكمبيوتر التي تسيطر عليها ضخ حقنة، والغاز الراحل و6 منفذ الضغط المتوسط صمام حقن (الشكل 4). ملء مع نظام تدفق تصفيتها طازجة ونزع الغاز تشغيل HEPES العازلة.
- إزالة منظور الشطف وإدراج منظور تحتوي على مجموعة CoCRR في الخلية التدفق. تشغيل HEPES في 100 ميكرولتر / دقيقة معدل التدفق. بمساعدة كاميرا CCD إزالة أي فقاعات الهواء موجودة على سطح المنشور عن طريق تمرير تشغيل عازلة بسرعة.
- تحديد منطقة الدراسة لكل بقعة عن طريق رسم دائرة مع نفس القطر لمجال الاهتمام على أساس صورة يتناقض بشكل جيد للمجموعة وبمساعدة من البرمجيات المتكاملة في نظام سبري.
- تتبع منحنيات مأكل، والتي تمثل تعكسمنحنيات ivity في وظيفة من زاوية الحادث، لجميع البقع.
- اختيار زاوية (موقف الذي سيسجل المنحنيات الحركية) العمل على أعلى المنحدر من منحنيات انعكاسية. تدوير مرآة المسح لتحديد زاوية العمل المختارة للالقياسات الحركية.
- مواصلة تشغيل HEPES من خلال نظام تدفق حتى إشارة انعكاسية لجميع البقع مستقرة وثابتة.
- حقن 1 مل AHL حل مع حقنة في حلقة العينة (500 ميكرولتر) مع صمام حقن على موقف "تحميل". ثم وضع صمام حقن لوضع "حقن". كان معدل تدفق المستخدمة في كل حقن بروتين 100 ميكرولتر / دقيقة.
- بدء القياسات الحركية من خلال رصد التغيرات انعكاسية مع الزمن في وقت واحد على جميع البقع.
- في نهاية حقن البروتين، وشطف مع مجموعة العازلة تشغيل لمدة 8 دقائق. أخيرا، حقن 1 مل 1٪ SDS لتجديد ذلك.
- كرر نفس الإجراء ع الآخرroteins.
4. تجهيز وتحليل البيانات
- بعد دخول حل البروتين في الخلية التدفق، الجزيئية ملزمة يحدث ويؤدي الى التحول من منحنيات مأكل والاختلاف من انعكاسية. البرنامج الحصول على الصور تحويل القيم قياس شدة الضوء إلى اللون الرمادي مستويات النطاق، وإعطاء الصور SPR الشكل 5A، ويولد اختلاف انعكاسية مقابل الوقت، وإعطاء sensorgrams (الشكل 5B).
- استخدام البرمجيات الحاسوبية في الرياضيات لرسم انعكاسية (R٪) في نهاية كل حقن البروتين مقابل [BB1] / ([BB1] + [BB2]) نسبة لتوليد 2D الشخصي التطور المستمر (CEP) لكل عينة (الشكل 5C).
- إضافة [BB1] / ([BB1] + [BB2]) النسبة في sensorgrams (الشكل 5B) لتوليد 3D المشهد تطور مستمر (CEL) لكل بروتين (الشكل 5D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للتحقيق في قدرة اللسان الإلكتروني لتحليل البروتين المشترك، استخدمت ثلاثة بروتينات: AHL، الميوجلوبين والليزوزيم. لكل بروتين، و2D الشخصي التطور المستمر متميزة، CEP، تكونت من قبل وآخرون، كما هو مبين في الشكل 6.
وبالإضافة إلى ذلك، وذلك بفضل سبري، والتي هي قادرة على رصد الوقت الحقيقي الامتزاز والمج حركية، لكل بروتين وقت نمط الاعتراف المستمر يعتمد، ودعا 3D المشهد تطور مستمر (CEL)، تكونت. في الشكل 7، وتظهر CELS المميزة لهذه البروتينات الثلاثة.
الهياكل الرقم 1. الكيميائية اثنين من لبنات البناء المستخدمة في هذا البروتوكول لإعداد مجموعة CoCRR.51901 / 51901fig1highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 2. صورة المنشور بعد إيداع 44 قطرات من الحلول النقية والمختلطة وBB1 BB2 باستخدام كهرضغطية نصاب عدم الاتصال مع بعضها النسبة في quadruplicate. وضعت المنشور بجانب أنبوب إيبندورف 1.5 مل.
الرقم 3. توضيح تخطيطي لمجموعة تحتوي على 11 CoCRR مستقبلات التفاضلية التي أعدت مع حلول النقية والمختلطة وBB1 BB2 في نسب مختلفة، والسماح للخليط في تقرير المصير، التجمع على سور الذهبوجه المنشور.
الرقم 4. توضيح تخطيطي لنظام الكشف سبري جنبا إلى جنب مع نظام ميكروفلويديك.
الشكل 5. توضيح تخطيطي العلاج البيانات لتوليد نوعين من نمط الاعتراف المستمر مع اللسان الإلكترونية المتقدمة: 2D المستمر الشخصي التطور والتطور المستمر 3D المناظر الطبيعية.
الشكل المستمر و 6.ق ملامح تطور لثلاثة بروتينات نقية: AHL (500 نانومتر)، الميوجلوبين (1 ميكرومتر)، والليزوزيم (500 نانومتر) تم إنشاؤها من قبل المتهم بالتآمر في الاختلاف من انعكاسية (R٪) في نهاية البروتين حقن مقابل [BB1 ] / ([BB1] + [BB2]) النسبة.
الرقم 7. المناظر الطبيعية الذوق: CELS 3D المميزة لAHL، الميوجلوبين والليزوزيم الناتجة عن اللسان الإلكتروني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ملتزمون الخطوات الأكثر أهمية لبناء هذا ET لضمان استنساخ جيد للنظام. على سبيل المثال، وتنظيف سطح الذهب من منظور مع إجراءات موحدة قبل الاستخدام، واضاف ان 10٪ من الجلسرين في أحد عشر حلول النقية والمختلطة وBB1 BB2 للقضاء على تبخر المذيبات خلال بب تجميع الذاتي على سطح الذهب من المنشور، إيداع مكررات متعددة لكل [BB1] / ([BB1] + [BB2]) نسبة، الخ. أما بالنسبة للبروتين عن طريق الاستشعار عن سبري، واختيار زاوية العمل أمر بالغ الأهمية. عادة، فهي ثابتة على أعلى المنحدر من منحنيات انعكاسية. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم جدا للاستخدام ظروف تجريبية موحدة لكل الاستشعار البروتين، مثل درجة حرارة العمل، ومعدل التدفق، الخ. بعد كل حقن البروتين، يجب إعادة إنشاء مجموعة CoCRR لإعادة استخدامها مع الحل المناسب الذي يسمح تجديد كامل للنظام من دون أي ضرر لمستقبلات.
e_content "> لإثبات أن ET المتقدمة ليست فعالة فقط لدراسة السكر ملزم البروتينات كما ذكرت سابقا 9، ولكن أيضا للبروتينات مشتركة، واحدة AHL كتين جنبا إلى جنب مع اثنين من البروتينات غير الملزم السكر الميوجلوبين والليزوزيم استخدمت وهم تم اختيار لدينا مجموعة متنوعة من التهم في HEPES (7.4 درجة الحموضة): AHL (نقطة تساوي الكهربية (PI) 6.0)، الميوجلوبين (PI 7.2) والليزوزيم (PI 11) والجدير بالذكر، كما هو مبين في الشكل 6، كل بروتين تمتلك فريدة من نوعها نمط الاستجابة. AHL قليلا واتهم سلبا في HEPES. معارض CEP لها أن لديها تفاعل أقوى مع CoCRRs-BB2 الغنية سالبة الشحنة. على الأرجح، هو بسبب التفاعل بين المجال موجبة الشحنة من البروتين وCoCRRs BB2 الغنية على سبيل الميوجلوبين، والتي هي محايدة عالميا في HEPES، وليس هناك فرق كبير بين الإشارات التي تم الحصول عليها مع كل CoCRRs. عند مقارنة الميوجلوبين في CEP إلى الفطر الابيض من AHL والليزوزيم، حتى عند تركيز أعلى من الإشارة الكثير لوور. أما بالنسبة الليزوزيم، الذي اتهم بشكل إيجابي في HEPES، تم الحصول على إشارة القصوى مع CoCRR تحتوي BB2 النقي.بفضل مزايا سبري قادرة على رصد الوقت الحقيقي الامتزاز والمج حركية، لكل بروتين تكونت تطور مستمر المشهد 3D. هذا النوع من نمط الاعتراف تعتمد على الوقت يجلب المعلمات التمايز التكميلية للتحليل البروتين. خاصة، يمكن أن يكون مفيدا للغاية لتحليل اثنين التحاليل تقديم تقارب مماثل لمجموعة من CoCRRs لكن اختلاف في حركية تفاعلها. كما هو مبين في الشكل 7، ويمكن تمييزها بسهولة CELS. وتبين هذه النتائج أن تفاعل البروتينات الثلاثة مع CoCRRs يعتمد على خصائص سطحها مثل توزيع مخلفات الأحماض الأمينية الكارهة للماء ومحايدة ومشحونة. كلا CEP وCEL يمكن استخدام "بصمات" لتمييز البروتينات وprospecتحديد موانع. وهكذا، فإن ET فعالة لتحليل البروتينات المشتركة.
يستخدم بروتوكول الموصوفة هنا نهج اندماجي لبناء وآخرون لتحليل البروتين. على عكس المناهج الأخرى التي تستخدم عددا من الجزيئات التي هي هيكليا معقدة وشاقة لتجميع، واستخدمت اثنين فقط من الجزيئات الصغيرة لإعداد مجموعة مستقبلات عبر تفاعلية قادرة على تمييز البروتينات مع قرار جيد في الدراسة. بالإضافة إلى ذلك، وفقا للتحقيق السابق، وآخرون غير مستقرة، وقابلة لإعادة الاستخدام استنساخه 9. وعلاوة على ذلك، يسمح سبري رصد الأحداث ملزمة في الوقت الحقيقي وتوليد أنماط جديدة مع اعتراف مستمرة الموثوقية غير مسبوقة. في المستقبل القريب، وسيتم عرض بب إضافية مع الخصائص الفيزيائية والكيميائية التكميلية لزيادة تنوع CoCRR في المصفوفات لتحليل مخاليط معقدة في الغاز السائل أو في.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SPRi apparatus | Horiba Scientific-GenOptics | SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25 °C. | |
| Incubator | Memmert | ||
| Syringe pump | Cavro scientific instruments | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite Degasser | Alltech | AT590507 | |
| 6-port medium pressure injection valve | Upchurch Scientific | The volume of injection loop used is 500 µl. | |
| Femto plasma cleaner (version 7) | Diener Electronic | On-line degassing system with 2 channel. | |
| Spotter | Siliflow | It is a non-contact piezoelectric spotter. | |
| SPRi-Biochip | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes. |
| Erythrina cristagalli lectin | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| Arachis hypogaea lectin | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| CXCL12γ | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Sulfated lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 |
References
- Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
- Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).
- Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors. J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).
- Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins. J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).
- Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. Differential receptors create patterns that distinguish various proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).
- Wright, A. T., Anslyn, E. V. Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition. Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).
- De, M., et al. Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein. Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).
- Hou, Y., et al. Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).
- Campbell, C. T., Kim, G. SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics. Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).
- Stranick, S. J., et al. Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers. Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).
