Introduction
Presise og raske protein sensing metoder er svært viktig i medisinsk diagnostikk og proteomikk. Klassiske protein-detektering matriser, slik som biochips, er basert på "lås-og nøkkel"-prinsippet gjenkjennelse og krever spesifikke reseptorer så som antistoffer, aptamerer eller mimetika.
I de senere årene har differensial sensing inspirert av den menneskelige luktesans og gustation dukket opp som et alternativ en. Denne elektroniske nese / tungen (NO / ET) tilnærming er basert på differensial binding av analytter til en rekke kryssreaktive reseptorer (CRRs), som ikke trenger å være svært spesifikke og selektive for målmolekylene dermed tillate å overvinne den møysommelige prosessen med å utvikle svært selektive reseptorer. Det er den kombinerte respons av alle reseptorene som skaper et tydelig mønster for hver prøve, for eksempel et fingeravtrykk, slik at dens identifikasjon.
De to sentrale utfordringer for utvikling av elektronic nese / tungen for effektiv protein avføling er tilvirkning av følerelementer som har evnen til å skille mellom strukturelt lignende analytter og passende transduksjon system for bindingshendelse. Inntil nå har studier rapportert ulike tilnærminger til matrise utvikling to. For eksempel i en studie en matrise basert identifikasjon av proteinene ble utviklet ved hjelp CRRs fremstilt fra tetra-carboxyphenylporphyrin derivater ved kobling av karboksylgruppene til ulike aminosyrer eller dipeptider å gi differensial reseptorer besitter en hydrofob kjerne for affinitet for proteiner og forskjellige ladede periferier for formidle differensial bindende. Ved hjelp av dette systemet, ble forskjellige proteiner og proteinblandinger identifiseres ved måling av fluorescensslukking av reseptorene ved interaksjon med analyttene 3,4. I en annen studie, et bibliotek med 29 CRRs inneholder tripeptid og borsyre moieties syntetisert i en kombinatorisk måte på en hexasubstidisjoneres benzen stillaset ble utviklet for avføling av proteiner med en indikator-opptak kolorimetrisk deteksjon 5,6. Med en slik utforming, hver reseptor viste differensial bindingskapasitet med proteiner basert på variasjon i den peptid-armene, og boronsyrer assisterte i differensiering av proteiner fra glykoproteiner. Mer nylig har en rekke sammensatt av ulike kationiske funksjon gull nanopartikler konjugert med et anionisk fluorescerende polymer poly (p-phenyleneethynylene) (PPE) er opprettet for å oppdage og identifisere proteiner 7. Konkurranse binding mellom protein analytter og slukket PPE / gullnanopartikkel komplekser regenerert fluorescens, produsere tydelige anerkjennelse mønstre for proteiner. I denne studien ble de funksjonnanopartikkel-protein interaksjoner finjustert av varierende fysiske og kjemiske egenskaper nanopartikkel endegrupper. Videre ble det vist at denne metoden er effektiv for proteinanalyse i kompleks og protein-rikt medium, f.ekssom menneskelig serum ved fysiologisk relevante konsentrasjoner, og dermed viser potensialet i eT i profilering reelle prøver for å diagnostisere sykdomstilstander åtte.
Selv om svært lovende, disse systemene har noen iboende begrensninger. De krever å designe og syntetisere 5-29 CRRs med ganske kompliserte strukturer. I tillegg, i motsetning til den olfaktoriske system som tilbakestilles etter hver måling, trenger protein sensing fremstilling av en rekke per prøve. Endelig overvåkning i sanntid bindingsbegivenheter er ekstremt vanskelig.
I denne sammenheng, ble et kombinatorisk metode foreslått ved hjelp av et lite antall enkle og lett tilgjengelige molekyler med forskjellige fysisk-kjemiske egenskaper (hydrofile, hydrofobe, positivt ladet, negativt ladet, nøytral, etc.) Som byggestener (BBS) 9. Ved å blande BBs i varierende og kontrollerte proporsjoner og lar blandinger å selv montere på gull overflaten av enprisme, ble en rekke kombinatoriske overflater med passende egenskaper for bindende protein opprettet. Spesielt, de selv montert monolayers på dette systemet tillater enkel tuning av en rekke overflateegenskaper i en svært avvikende måte, slik at ulike kombinatoriske kryssreaktive reseptorer (CoCRRs) for å være raskt og effektivt produsert. Protein sensing ble utført ved hjelp av et optisk deteksjonssystem, overflate plasmonresonans imaging (SPRI). Kort, tennes en bred-stråle monokromatisk polarisert lys fra en lysdiode hele CoCRR matrisen område på overflaten av prismet. En høy oppløsning CCD videokamera gir real-time forskjellen bilder på tvers av alle stedene på CoCRR array. Den fanger opp alle de lokale endringer i overflaten av matrisen CoCRR gi detaljert informasjon om bindings hendelser og kinetiske prosesser 10. I mellomtiden, med hjelp av bildebehandlingsprogrammer, SPR bilder tilsvarende flekker blir automatisk konvertert til variasjoner av reflektivitet Versus tid, genererer en serie med kinetiske bindings kurver kalt sensorgrams. Dermed tillater SPRI en etikett-fri, synkron, parallelt, og real-time observasjon av bindende hendelser. I tillegg er det oppnådde CoCRR matrisen regenererbar og gjenbrukbare for proteinanalyse.
Denne protokollen beskriver byggingen av den elektroniske tungen ved å bruke bare to små molekyler som byggeklosser og illustrerer sin søknad for analyse av vanlige proteiner basert på kontinuerlig anerkjennelse mønstre oppnådd med SPRI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av ulike løsninger og proteinprøver
- Forbered 100 ml fosfatbufferløsning (PBS-G) inneholdende 50 mM NaH 2 PO 4, 50 mM NaCl og 10% glycerol ved pH 6.8.
- Forbered 250 ml av HEPES-buffer-løsning inneholdende 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005% Tween 20 ved pH 7,4.
- Forbered stamløsning av byggeblokk 1 (BB1) laktose og byggeblokk 2 (BB2) sulfatert laktose (figur 1) ved 0,2 mM i PBS-G.
- Forbered 1 ml av proteinløsninger i HEPES: En rachis hypogaea lectinet (AHL) ved 500 nM, myoglobin ved 1 mikrometer, og lysozym ved 500 nM.
- Forbered 20 ml 1% SDS i ultrarent vann.
2. Utarbeidelse av CoCRR Array
- Rens gull overflate av prismet 48 timer før bruk med en plasmarenser i 3 min under disse betingelser: 75% oksygen, 25% argon, 0,6 mbar, strøm 40 W.
- Forbered elleve ren og blandet løsning;ns av BB1 BB2 og med [BB1] / ([BB1] + [BB2]) forholdstall mellom 0 og 100% ved trinn på 10% ved et totalt BB konsentrasjon på 0,1 mM i PBS-G.
- Innskudd 8 nl dråper av disse rene og blandede løsninger på prismet overflaten ved hjelp av en ikke-kontakt spotter i fire eksemplarer for hver ratio med 44 plasser totalt (figur 2).
MERK: 10% glyserol tilsatt i PBS-G er svært viktig for å redusere fordampning av oppløsningsmidlet og endringen av BB-konsentrasjon etter avsetning. - Plasser prismet i en petriskål inneholdende 1 ml ultrarent vann, og lar det O / N ved RT for egen sammensetning av BB1 BB2 og på gulloverflaten. Heri er det forutsatt at den gjennomsnittlige overflatesammensetningen i den blandede Sams reflekterer sammensetningen av avsetning blandet løsning (Figur 3) 11.
- Vask grundig prismet med ultrarent vann, og deretter tørkes det under en strøm av argon.
3. Protein Sensing av SPRI
- Sett incubator der Spri anordningen er plassert ved 25 ° C for å unngå brytningsindeksendringer indusert av temperaturvariasjonen under protein avføling.
- Sett i en ikke-funksjonalisert skylling prisme i 10 mL polyeter eter-keton (PEEK) strømningscellen som er koblet til en datastyrt sprøytepumpe, en avgasser og en 6-port mellomtrykksinjeksjonsventil (figur 4). Fyll i strømningssystem med friskt, filtrert og avgasset rennende buffer HEPES.
- Fjern skylle prisme og sett prisme som inneholder CoCRR array i strømningscellen. Run HEPES til en 100 mL / min strømningshastighet. Ved hjelp av CCD-kameraet fjerne eventuelle luftbobler som er tilstede på overflaten ved å passere prismet rennende buffer raskt.
- Definer studieområde for hver spot ved å tegne en sirkel med samme diameter for området av interesse basert på en godt kontrast bilde av tabellen, og med hjelp av integrert programvare i SPRI system.
- Trace plasmon kurver, som representerer reflektereivity kurver i funksjon av hendelsen vinkel, for alle stedene.
- Velg den arbeidsvinkel (posisjon ved hvilken kinetiske kurver vil bli registrert) ved den høyeste skråningen av reflektiviteten kurver. Rotere skanning speilet for å fikse det valgte arbeidsvinkel for kinetiske målinger.
- Fortsett å kjøre HEPES gjennom strømningssystemet før reflektivitet signal for alle plassene er stabil og konstant.
- Injiser 1 ml AHL oppløsningen med en sprøyte inn i prøvesløyfen (500 ul) med injeksjonsventilen på posisjon "load". Deretter satte injeksjonsventilen i posisjon "injeksjon". Den strømningshastighet som brukes til alle protein-injeksjon var 100 mL / min.
- Begynn kinetiske målinger ved å overvåke variasjoner i refleksjonsevnen mot tiden samtidig på alle stedene.
- Ved slutten av proteininjeksjon, skyll matrisen med rennende buffer i 8 min. Til slutt, injisere en ml 1% SDS å regenerere den.
- Gjenta fremgangsmåten for den andre proteins.
4. databehandling og analyse
- Etter oppføring av proteinoppløsningen i strømningscellen, molekylær binding oppstår og induserer en forskyvning av de plasmon kurver og en variant av reflektivitet. Bildeinnlastingen programvare konverterer de målte lysintensitet verdier til Gråtonenivåer, noe som gir SPR bilder Figur 5A, og genererer variasjonen av refleksjon i forhold til tid, noe som gir sensorgrams (Figur 5B).
- Bruk en matte dataprogramvare for å plotte reflektivitet (R%) i enden av hvert protein injeksjon versus [BB1] / ([BB1] + [BB2])-forhold for å generere 2D kontinuerlig utvikling profil (CEP) for hver prøve (figur 5C).
- Tilsett [BB1] / ([BB1] + [BB2]) forholdet i sensorgrams (figur 5B) for å generere 3D kontinuerlig utvikling liggende (CEL) for hvert protein (figur 5D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å undersøke muligheten av elektroniske tungen for vanlige proteinanalyse ble tre proteiner brukt: AHL, myoglobin og lysozym. For hvert protein, en distinkt 2D kontinuerlig utvikling profil, CEP, ble generert ved ET, som vist i figur 6.
Videre, takket være SPRI, som er i stand til å overvåke sanntids adsorpsjon og desorpsjon kinetikk, for hvert protein en tidsavhengig kontinuerlig gjenkjenningsmønster, kalt 3D kontinuerlig utvikling liggende (CEL), ble generert. På figur 7, er karakteristiske cels av disse tre proteiner er vist.
Figur 1. Kjemiske strukturer av de to byggeklosser som brukes i denne protokollen for å forberede CoCRR array.51901 / 51901fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Et bilde av et prisme etter avsetning av de 44 dråper av den rene og blandede løsninger av BB1 BB2 og ved hjelp av en ikke-kontakt piezoelektrisk markeringshylsen med hver forholdet i kvadruppel. Prismet ble plassert ved siden av et Eppendorf-rør på 1,5 ml.
Figur 3. Skjematisk illustrasjon av CoCRR array som inneholder 11 differensial reseptorer som var forberedt med rene og blandede løsninger av BB1 og BB2 på ulike forholdstall og lar blandinger til selv montere på gull surside av prismet.
Figur 4. Skjematisk illustrasjon av Spri deteksjonssystem i kombinasjon med et mikrofluidsystem.
Figur 5. Skjematisk illustrasjon av databehandling for generering av to typer av kontinuerlige mønstergjenkjenning med utviklet elektroniske tungens 2D kontinuerlig utvikling profil og 3D kontinuerlig utvikling landskapet.
Figur 6. Continuous evolution profiler i tre rene proteiner:. AHL (500 nM), myoglobin (1 mM), og lysozym (500 nM) De ble generert ved å plotte variant av reflektivitet (R%) i enden av proteininjeksjon versus [BB1 ] / ([BB1] + [BB2])-forhold.
Figur 7. Landscape av smak: karakteristiske 3D Cels av AHL, myoglobin og lysozym generert av elektroniske tungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trinn for konstruksjon av denne eT er dedikert til å sikre god reproduserbarhet av systemet. For eksempel, for å rense gull prismets overflate med en standardisert prosedyre før bruk, å tilsette 10% glycerol i de elleve rene og blandede løsninger av BB1 BB2 og fjerne oppløsningsmidlet ved fordampning BB-er selv-sammenstillingen på gulloverflaten av prismet, innskudds flere replikater for hver [BB1] / ([BB1] + [BB2]) ratio, etc. Som for protein avføling av SPRI, er valget av den arbeidsvinkel kritisk. Vanligvis er det fast på det høyeste helningen på kurvene reflektivitet. I tillegg, er det svært viktig å bruke standardiserte eksperimentelle betingelser for hvert protein avføling, for eksempel arbeidstemperatur, strømningshastighet, etc.. Etter hvert protein injeksjon må CoCRR matrisen bli regenerert for gjenbruk med en passende løsning som tillater fullstendig regenerering av systemet uten å skade reseptorer.
e_content "> For å demonstrere at den utviklede Et er ikke bare effektive for studiet av sukkerbindende proteiner som tidligere rapportert 9, men også for vanlige proteiner, en lectin AHL sammen med to ikke-sukker-bindende proteiner myoglobin og lysozym ble anvendt. De ble valgt for å ha en rekke av avgifter i HEPES (pH 7,4):. AHL (isoelektrisk punkt (pI) 6,0), myoglobin (pI 7.2) og lysozym (11 pI) Spesielt, som vist i figur 6, besitter hvert protein en unik reaksjonsmønster. AHL er litt negativt ladet i HEPES. Dens CEP viser at den har sterkere samhandling med de negativt ladede BB2 rike CoCRRs Mest sannsynlig er det på grunn av samspillet mellom de positivt ladede domenet av protein og BB2-rike CoCRRs. . For myoglobin, som er globalt nøytral i HEPES, er det ikke mye forskjell mellom signaler oppnådd med alle CoCRRs. Når man sammenligner myoglobin i CEP til steinsopp av AHL og lysozym, selv ved en høyere konsentrasjon signalet er mye lower. Som for lysozym, noe som er positivt ladet i HEPES, ble den maksimale signal oppnådd med CoCRR inneholdende ren BB2.Takket være fordelene ved Spri stand til å overvåke sanntids adsorpsjon og desorpsjon kinetikk, for hvert protein en 3D kontinuerlig utvikling liggende ble generert. Denne form for tidsavhengig gjenkjenning mønster bringer tilleggsdifferensieringsparametere for proteinanalyse. Spesielt, kan det være svært nyttig for å analysere to analytter presentere den lik affinitet for et sett med CoCRRs men ulike i sine kinetikk for interaksjon. Som vist i figur 7, er cels er lett gjenkjennelig. Disse resultatene viser at interaksjonen mellom de tre proteinene med CoCRRs er avhengig av deres overflateegenskaper slik som fordelingen av hydrofobe, nøytrale og ladede aminosyre-rester. Både CEP og CEL kan brukes som "fingeravtrykk" for protein diskriminering og PROSPECtive identifikasjon. Dermed er eT effektive for analyse av vanlige proteiner.
Protokollen er beskrevet heri benytter en kombinatorisk metode for å konstruere eT for proteinanalyse. I motsetning til andre tilnærminger som bruker en rekke molekyler som er strukturelt komplisert og arbeidskrevende å syntetisere, ble bare to små molekyler som brukes til å forberede kryssreaktive reseptor rekke stand til å skille proteiner med god oppløsning i denne studien. I tillegg, i henhold til den tidligere undersøkelsen, er eT stabil, reproduserbar og gjenbruk 9. Videre Spri tillater overvåking bindende hendelser i sanntid og genererer nye kontinuerlig anerkjennelse mønstre med enestående pålitelighet. I nær fremtid, vil flere BBs med komplementære fysisk-kjemiske egenskaper bli introdusert for å øke mangfoldet i CoCRR i arrays for analyse av komplekse blandinger i væske eller gass.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SPRi apparatus | Horiba Scientific-GenOptics | SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25 °C. | |
| Incubator | Memmert | ||
| Syringe pump | Cavro scientific instruments | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite Degasser | Alltech | AT590507 | |
| 6-port medium pressure injection valve | Upchurch Scientific | The volume of injection loop used is 500 µl. | |
| Femto plasma cleaner (version 7) | Diener Electronic | On-line degassing system with 2 channel. | |
| Spotter | Siliflow | It is a non-contact piezoelectric spotter. | |
| SPRi-Biochip | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes. |
| Erythrina cristagalli lectin | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| Arachis hypogaea lectin | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| CXCL12γ | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Sulfated lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 |
References
- Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
- Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).
- Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors. J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).
- Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins. J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).
- Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. Differential receptors create patterns that distinguish various proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).
- Wright, A. T., Anslyn, E. V. Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition. Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).
- De, M., et al. Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein. Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).
- Hou, Y., et al. Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).
- Campbell, C. T., Kim, G. SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics. Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).
- Stranick, S. J., et al. Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers. Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).
