Introduction
Præcise og hurtige protein sensing metoder er meget vigtige i medicinsk diagnostik og proteomics. Klassiske protein-afsløring arrays, såsom biochips, er baseret på princippet om "lock-and-key" anerkendelse og kræver specifikke receptorer, såsom aptamerer, antistoffer eller mimetika.
I de seneste år har forskellen sensing inspireret af den menneskelige lugtesans og gustation opstået som et alternativ 1. Denne elektroniske næse / tunge (EN / ET) tilgang er baseret på forskellen binding af analytter til en række krydsreaktive receptorer (CRRs), der ikke behøver at være meget specifik eller selektiv for målmolekylerne således gøre det muligt at overvinde den møjsommelige processen med at udvikle højselektive receptorer. Det er den kombinerede indsats af alle de receptorer, der skaber et tydeligt mønster for hver prøve, som et fingeraftryk, så dets identifikation.
De to centrale udfordringer for udviklingen af elektronic næse / tunge til effektiv protein sensing er produktionen af følerelementer, der har evnen til at skelne mellem strukturelt tilsvarende analytter og passende transduktion for bindingsbegivenheden. Hidtil har undersøgelser indberettet forskellige tilgange til opstilling udvikling 2. For eksempel i en undersøgelse et array-baserede identifikation af proteiner blev udviklet ved hjælp CRRs fremstillet ud fra tetra-carboxyphenylporphyrin derivater ved at koble carboxylgrupperne til forskellige aminosyrer eller dipeptider at give differentierede receptorer besidder en hydrofob kerne til affinitet for proteiner og forskellige ladede periferier for bibringe differentiel binding. Ved hjælp af dette system blev forskellige proteiner og proteinblandinger identificeret ved måling af fluorescens bratkøling af receptorerne ved interaktion med analytterne 3,4. I en anden undersøgelse, et bibliotek af 29 CRRs indeholdende tripeptid og boronsyre dele syntetiseret i en kombinatorisk måde på en hexasubstiindstiftede benzen stillads blev udviklet til at føle proteiner med en indikator-uptake kolorimetrisk detektion 5,6. Med en sådan udformning, hver receptoren viste forskellen bindingskapacitet med proteiner baseret på variansen i peptid-arme, og boronsyrer bistået i differentiering af proteiner fra glycoproteiner. På det seneste har en række sammensat af forskellige kationiske funktionaliserede guld nanopartikler konjugeret med en anionisk fluorescerende polymer poly (p-phenyleneethynylene) (PPE) blevet oprettet for at registrere og identificere proteiner 7. Konkurrencesituationen binding mellem protein analytter og standset PPE / guld nanopartikler komplekser regenererede fluorescens, der producerer forskellige mønstre anerkendelse for proteiner. I denne undersøgelse blev de funktionaliserede nanopartikel-protein interaktioner tunet af varierende fysisk-kemiske egenskaber nanopartikel endegrupper. Endvidere blev det vist, at denne fremgangsmåde er effektiv til proteinanalyse i komplekse og proteinrigt medium, såsomsom human serum ved fysiologisk relevante koncentrationer, hvilket viser potentialet i eT i at profilere ægte prøver til diagnosticering af sygdomstilstande 8.
Selvom meget lovende, disse systemer har nogle iboende begrænsninger. De kræver at designe og syntetisere 5-29 CRRs med ganske komplicerede strukturer. Derudover, i modsætning til det olfaktoriske system, der nulstilles efter hver måling, protein sensing kræver fremstilling af en række per prøve. Endelig er ekstremt vanskelige overvågning realtid bindende begivenheder.
I denne forbindelse blev en kombinatorisk foreslåede tilgang ved hjælp af et lille antal simple og let tilgængelige molekyler med forskellige fysisk-kemiske egenskaber (hydrofile, hydrofobe, positivt ladede, negativt ladet, neutralt etc.) Som byggesten BBS () 9. Ved at blande BBs i varierende og kontrollerede forhold og lade blandingerne til selv at samle på guld overfladen af enprisme, blev en række kombinatoriske overflader byder passende egenskaber til bindende protein oprettet. Især selvstændige samlet monolag på dette system tillader nem indstilling af en række overfladeegenskaber i en meget divergerende måde, så forskellige kombinatoriske krydsreaktive receptorer (CoCRRs) for at være hurtigt og effektivt produceret. Protein sensing blev udført under anvendelse af et optisk detektionssystem overflade plasmon resonans (SPRI). Kort fortalt en bred stråle monokromatisk polariseret lys fra en LED lyser hele CoCRR matrix område på overfladen af prisme. En høj opløsning CCD-videokamera giver real-Tidsforskel billeder på tværs af alle de pletter af CoCRR array. Det fanger alle de lokale ændringer på overfladen af CoCRR vifte med detaljerede oplysninger om bindende begivenheder og kinetiske processer 10. I mellemtiden, med hjælp af imaging software, SPR billeder svarende til pletter konverteres automatisk til variationer af refleksivitet Versus tid, genererer en række kinetiske bindingskurver kaldet sensorgrams. Således Spri tillader en etiket-fri, synkron, parallel og real-time observation af bindende begivenheder. Derudover opnåede CoCRR array er regenererbar og genbruges til proteinanalyse.
Denne protokol beskriver konstruktionen af det elektroniske tungen ved hjælp af kun to små molekyler som byggesten og illustrerer dens anvendelse til analyse af almindelige proteiner baseret på endeløse mønstre anerkendelse opnået med Spri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af flere forskellige løsninger, proteinprøver
- Forbered 100 ml phosphatpufferopløsning (PBS-G) indeholdende 50 mM NaH 2PO 4, 50 mM NaCI og 10% glycerol ved pH 6,8.
- Forbered 250 ml HEPES-pufferopløsning indeholdende 10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 0,005% Tween 20 ved pH 7,4.
- Forbered stamopløsning af bygning blok 1 (BB1) laktose og byggesten 2 (BB2) sulfateret laktose (figur 1) på 0,2 mM i PBS-G.
- Forbered 1 ml protein løsninger i HEPES: Et skaft hypogaea lectin (AHL) ved 500 nm, myoglobin ved 1 uM, og lysozym ved 500 nm.
- Forbered 20 ml 1% SDS i ultrarent vand.
2. Forberedelse af CoCRR Array
- Rengør guld overflade af prismet 48 timer før brug med et plasma renere i 3 minutter under disse betingelser: 75% ilt, 25% argon, 0,6 mbar, strøm 40 W.
- Forbered elleve ren og blandet solutions af BB1 og BB2 med [BB1] / ([BB1] + [BB2]) forhold mellem 0 og 100% i trin på 10% til en samlet BB koncentration på 0,1 mM i PBS-G.
- Depositum 8 nl dråber af disse rene og blandede løsninger på prisme overflade ved hjælp af en ikke-kontakt spotter i fire eksemplarer til hver forholdet med 44 pladser i alt (figur 2).
BEMÆRK: 10% glycerol tilsættes i PBS-G er meget vigtigt at reducere fordampning af opløsningsmidlet og ændringen BB koncentrationen efter aflejring. - Placer prisme inde i en petriskål indeholdende 1 ml ultrarent vand og lad det O / N ved stuetemperatur i selvsamling af BB1 og BB2 på guld overflade. Heri antages det, at den gennemsnitlige overflade sammensætning i den blandede SAM'er afspejler sammensætningen af aflejringen blandet opløsning (figur 3) 11.
- Vask grundigt prisme med ultrarent vand og tør under en strøm af argon.
3. Protein Sensing af Spri
- Indstil incubator, hvor SPRI apparatet er placeret ved 25 ° C for at undgå brydningsindeks ændringer induceret af temperaturudsving under protein sensing.
- Indsæt en ikke-funktionaliseret skylning prisme i 10 pi polyetheretherketon (PEEK) flowcelle forbundet til en computerstyret sprøjtepumpe, en afgasser og en 6-port middeltryk indsprøjtningsventil (figur 4). Udfyld flowsystemet med frisk filtreret og afgasset løbebuffer HEPES.
- Fjern skylning prisme og indsæt prisme indeholdende CoCRR array i flow celle. Kør HEPES på 100 ul / min strømningshastighed. Ved hjælp af CCD-kameraet fjerne eventuelle luftbobler på prismen overflade ved at passere løbebuffer hurtigt.
- Definer undersøgelse område for hver plet ved at tegne en cirkel med samme diameter til området af interesse er baseret på en god kontrast billede af rækken, og med hjælp af software integreret i Spri-system.
- Trace plasmon kurver, som repræsenterer afspejleude af trit med kurver i funktion af indfaldsvinklen, for alle de pletter.
- Vælg arbejder vinkel (position, hvor kinetiske kurver bliver optaget) ved den højeste hældning reflektivitetsdataene kurver. Drej scanning spejlet for at fastholde det valgte arbejder vinkel for kinetiske målinger.
- Fortsæt med at køre HEPES gennem flowsystemet indtil reflektivitet signal for alle pletter er stabil og konstant.
- Injicer 1 ml AHL løsning med en sprøjte i prøven løkke (500 ul) med indsprøjtningsventil på position "belastning". Derefter sætte indsprøjtningsventilen til position "injektion". Flowet bruges til alle protein indsprøjtning var 100 ul / min.
- Start kinetiske målinger ved at overvåge reflektivitet variationer mod tiden samtidigt på alle pletter.
- Ved udgangen af protein injektion, skylles array med rindende puffer i 8 min. Endelig injiceres 1 ml 1% SDS at regenerere den.
- Gentag den samme procedure for de andre proteins.
4. Databehandling og analyse
- Efter indtastning af protein løsning i flow celle, molekylær binding forekommer, og fremkalder en forskydning af plasmon kurver og en variation af refleksionsevne. Billedet erhvervelse software konverterer de målte lysintensitet værdier gråskalaniveauer, der giver SPR billeder 5A, og genererer variationen af refleksionsevne versus tid, hvilket giver sensorgrams (figur 5B).
- Brug en matematik computing software til at plotte refleksionsevne (R%) ved udgangen af hvert protein injektion versus [BB1] / ([BB1] + [BB2]) forhold til at generere 2D kontinuerlig evolution-profil (CEP) for hver prøve (figur 5C).
- Tilsæt [BB1] / ([BB1] + [BB2]) forholdet i sensorgrams (figur 5B) til at generere 3D kontinuerlig evolution landskab (CEL) for hvert protein (figur 5D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at undersøge evnen af det elektroniske tungen for blød proteinanalyse blev tre proteiner anvendt: AHL, myoglobin og lysozym. For hvert protein en særskilt 2D kontinuerlig udvikling profil CEP blev genereret af eT, som vist i figur 6.
Desuden, takket være Spri, som er i stand til at overvåge realtid adsorptions- og desorptionskinetik, for hvert protein en tidsafhængig kontinuerlig anerkendelse mønster, kaldet 3D kontinuerlig evolution landskab (CEL), blev genereret. I figur 7 er karakteristiske cels af disse tre proteiner er vist.
Figur 1. Kemiske strukturer af de to byggesten, der bruges i denne protokol til at forberede CoCRR array.51901 / 51901fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Et billede af et prisme efter deponering af 44 dråber af den rene og blandede opløsninger af BB1 og BB2 anvendelse af en ikke-kontakt piezoelektriske spotter hver forholdet i fire eksemplarer. Prismet blev placeret ved siden af et Eppendorf-rør på 1,5 ml.
Figur 3. Skematisk illustration af CoCRR array indeholdende 11 differentierede receptorer, der blev udarbejdet med rene og blandede opløsninger af BB1 og BB2 i forskellige forhold og tillader blandingerne til selv at samle på guld surflade af prisme.
Figur 4. Skematisk illustration af SPRI detektion kombineret med en mikrofluid system.
Figur 5. Skematisk illustration af databehandling til generering af to typer løbende anerkendelse mønster med udviklet elektronisk tunge: 2D kontinuerlig evolution profil og 3D kontinuerlig evolution landskab.
Figur 6. Continuous evolution profiler til tre rene proteiner:. AHL (500 nM), myoglobin (1 uM) og lysozym (500 nM) De blev dannet ved at plotte variationen af refleksivitet (R%) ved udgangen af protein injektion versus [BB1 ] / ([BB1] + [BB2]) forhold.
Figur 7. Landskab af smag: karakteristiske 3D cels i AHL, myoglobin og lysozym genereret af den elektroniske tungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trin til konstruktion af denne eT er dedikeret til at sikre en god reproducerbarhed af systemet. For eksempel at rense guld overflade prisme med en standardiseret procedure før brug, tilsætning af 10% glycerol i de elleve rene og blandede opløsninger af BB1 og BB2 fjerne opløsningsmiddel fordampning under skuds selvsamlende på guldoverfladen af prismen deponering af flere gentagelser for hver [BB1] / ([BB1] + [BB2]) forhold mv. Med hensyn til protein-sensing af Spri, valget af arbejdsvinkel er kritisk. Normalt er det fastlagt ved den højeste hældning reflektivitetsdataene kurver. Desuden er det meget vigtigt at anvende standardiserede eksperimentelle betingelser for hvert protein detektering, såsom arbejdstemperatur, strømningshastighed, etc.. Efter hvert protein injektion, skal CoCRR matrix regenereres til genbrug med en passende løsning, der giver fuldstændig regenerering af systemet uden nogen skader til receptorer.
e_content "> at vise, at den udviklede eT er ikke kun effektiv til undersøgelse af sukker proteiner som tidligere rapporteret 9, men også for almindelige proteiner, en lectin AHL sammen med to ikke-sukker-bindende proteiner, myoglobin og lysozym blev anvendt. De blev valgt til at have en bred vifte af afgifter i HEPES (pH 7,4):. AHL (isoelektrisk punkt (pi) 6,0), myoglobin (pi 7.2) og lysozym (pi 11) Navnlig, som vist i figur 6, hvert protein har en unik reaktionsmønster. AHL er lidt negativt ladet i HEPES. Dens CEP viser, at det har stærkere samspil med de negativt ladede BB2-rige CoCRRs. Mest sandsynligt er det på grund af vekselvirkningen mellem den positivt ladede domæne af proteinet og BB2-rige CoCRRs . Til myoglobin, som er globalt neutralt i HEPES, er der ikke meget forskel mellem signaler opnået med alle CoCRRs. Når man sammenligner myoglobin i CEP til LMP i AHL og lysozym, selv ved en højere koncentration signalet er meget lower. Som for lysozym, som er positivt ladet i HEPES blev den maksimale signal, der opnås med CoCRR indeholdende ren BB2.Takket være fordelene ved Spri stand til at overvåge realtid adsorptions- og desorptionskinetik, for hvert protein et 3D kontinuerlig evolution landskab blev genereret. Denne form for tidsafhængig anerkendelse mønster bringer supplerende differentieringsparametre til proteinanalyse. Især kan det være yderst nyttigt til at analysere to analytter frembyder lignende affinitet for et sæt CoCRRs men forskellige i deres kinetik interaktion. Som vist i figur 7, er cels er let skelnes. Disse resultater viser, at interaktionen mellem de tre proteiner med CoCRRs er afhængige af deres overfladeegenskaber, såsom fordelingen af hydrofobe, neutrale og ladede aminosyrerester. Både CEP og CEL kan anvendes som "fingeraftryk" for proteinet diskrimination og ProSpectiv identifikation. Således eT er effektiv til analyse af fælles proteiner.
Den heri beskrevne protokol anvender en kombinatorisk fremgangsmåde til at konstruere eT til proteinanalyse. I modsætning til andre fremgangsmåder, der anvender en række molekyler, som er strukturelt kompliceret og besværlig at syntetisere, var der kun to små molekyler anvendes til fremstilling af krydsreaktive receptor matrix stand til at differentiere proteiner med god opløsning i nærværende undersøgelse. Desuden, ifølge den tidligere undersøgelse, eT er stabil, reproducerbar og genbruges 9. Desuden Spri tillader overvågning bindende begivenheder i realtid og skabe nye kontinuerlige anerkendelse mønstre med hidtil uset pålidelighed. I den nærmeste fremtid vil yderligere BBs med supplerende fysisk-kemiske egenskaber blive indført for at øge mangfoldigheden i CoCRR i arrays til analyse af komplekse blandinger i væske eller gas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SPRi apparatus | Horiba Scientific-GenOptics | SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25 °C. | |
| Incubator | Memmert | ||
| Syringe pump | Cavro scientific instruments | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite Degasser | Alltech | AT590507 | |
| 6-port medium pressure injection valve | Upchurch Scientific | The volume of injection loop used is 500 µl. | |
| Femto plasma cleaner (version 7) | Diener Electronic | On-line degassing system with 2 channel. | |
| Spotter | Siliflow | It is a non-contact piezoelectric spotter. | |
| SPRi-Biochip | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes. |
| Erythrina cristagalli lectin | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| Arachis hypogaea lectin | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| CXCL12γ | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Sulfated lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 |
References
- Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
- Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).
- Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors. J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).
- Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins. J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).
- Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. Differential receptors create patterns that distinguish various proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).
- Wright, A. T., Anslyn, E. V. Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition. Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).
- De, M., et al. Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein. Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).
- Hou, Y., et al. Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).
- Campbell, C. T., Kim, G. SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics. Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).
- Stranick, S. J., et al. Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers. Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).
