Summary
وقد تم تطوير هذه الطريقة بهدف تقديم حل ثابت المخدرات عن طريق الشريان السباتي، لتقييم الدوائية للعقاقير الجديدة في نماذج الماوس.
Abstract
عند اقتراح استخدام المخدرات، مزيج المخدرات، أو توصيل الدواء إلى نظام الرواية، لا بد من تقييم الدوائية للدواء في نموذج الدراسة. كما استخدام نماذج الماوس غالبا ما تكون خطوة حيوية في اكتشاف الأدوية قبل السريرية وتطوير العقاقير 1-8، فمن الضروري تصميم نظام لإدخال المخدرات إلى الفئران في زي، بطريقة استنساخه. من الناحية المثالية، ينبغي أن يسمح النظام بجمع عينات الدم على فترات منتظمة خلال دورة زمنية محددة. القدرة على قياس تركيزات المخدرات-مطياف الكتلة، وقد سمح للمحققين لمتابعة التغيرات في مستويات البلازما المخدرات مع مرور الوقت في الفئران الفردية 1 و 9 و 10. وفي هذه الدراسة، تم إدخال باكليتاكسيل في الفئران المعدلة وراثيا بمثابة ضخ الشرياني المستمر على مدى ثلاثة ساعات، في حين تم أخذ عينات الدم في وقت واحد من قبل تنزف الرجعية المدارية في نقطة زمنية محددة. ضخ الشريان السباتي هي بديل محتمل لضخ حبل الوريد، عندما العوامل مثلالأورام الثديية أو أي عوائق أخرى تجعل ضخ الوريد غير عملي. باستخدام هذه التقنية، وتركيزات باكليتاكسيل في البلازما والأنسجة حققت مستويات مماثلة بالمقارنة مع ضخ الوداجي. في هذا البرنامج التعليمي، سوف نظهر كيفية يقثطر بنجاح الشريان السباتي عن طريق إعداد قسطرة الأمثل لنموذج الفأر الفردي، ثم عرض كيفية إدراج وتأمين القسطرة في الشريان السباتي الماوس، والخيط نهاية القسطرة من خلال الجزء الخلفي من رقبة الفأر، وربط الماوس إلى مضخة لتوفير مراقبة معدل تدفق المخدرات. انخفاض حجم الرجعية المدارية تنزف متعددة تسمح لتحليل تركيز الدواء في البلازما مع مرور الوقت.
Introduction
حقن المخدرات من خلال الشريان السباتي يمكن أن يؤديها بشكل صحيح وبتكاثر عن طريق تحسين المعدات والتقنية. الإجراء ليس معقد، على الرغم من أنها لا تتطلب مراقبة دقيقة والاهتمام بالتفاصيل. وهناك حاجة إلى الرعاية الفائقة والبراعة لعزل الشريان السباتي وإدراج القسطرة، والتي يمكن الحصول عليها عادة من خلال الممارسة. عملية جراحية من قبل فني من ذوي الخبرة وينبغي ألا تتجاوز ساعة واحدة. بعد عملية جراحية ناجحة، يجب أن يظهر الفأر العادي وصحية (على الرغم من أن الماوس قد تتفاعل على ضخ المخدرات الفعلي)، والمخدرات (ق) يمكن أن تدار في ذلك، جرعة مستمرة موحدة تسيطر عليها. يجب أن تؤخذ عينات الدم من موقع آخر من الشريان السباتي. أثبتت تنزف الرجعية الحجاج سهلة لجمع ومرضية لتحليل تركيزات المخدرات.
القسطرة من الحجم الأمثل وشكل رصيدا لا يقدر بثمن في أداء ضخ ناجح 11. وجدنا القسطرة commerciall متاحةذ غالبا ما تكون كبيرة جدا و / أو مرنة جدا للسماح لسهولة الوصول إلى الشريان السباتي الماوس. ثبت أنه أفضل من القسطرة أزياء من أنابيب البولي ايثيلين المستخدمة لتوصيل الماوس إلى ضخ حقنة. وبالتالي، كانت جميع الأنابيب والموصلات والإبر ذات أبعاد متناسقة، الذي مبسطة التجمع الحقن في الوريد. باستخدام هذه التقنية، فإنه ليس من الضروري لدفع طرف القسطرة في الشريان الماضي نقطة حيث لا تزال واضحة، وليس استعادة تدفق الدم إلى الشريان السباتي حتى بعد تأمين القسطرة في البداية. هذا يقلل دفعت مخاطر ثقب شريان أو وجود القسطرة من قبل ارتفاع ضغط تدفق الدم. تصميم قسطرة هنا لا يتضمن "عثرة" ليثبت في مكانه، وبالتالي تأمين القسطرة جيدا مع الغرز الجراحية والشريط هو الأولوية.
قد يكون الحقن أفضل من الحقن المشتركة الرابع بلعة، باعتباره أفضل تقليد للإدارة السريرية للالعقاقير مثل taxanes 3 و 12 و 13. تقنية وصفها هنا وضعت أصلا للسماح ضخ في نماذج الماوس حيث كان يحول دون الوصول إلى حبل الوريد الفخذي أو من خلال نمو الأورام الثديية و / أو الأوعية الدموية المفرط للمنطقة الإدراج. هذه الطريقة قد تكون في كثير من الأحيان المناسب حتى في الفئران الخالية من الورم: على الرغم من عزل والقسطرة في الشريان السباتي هو أكثر قليلا الغازية، وجدنا أنه أفضل من حبل الوريد، لأن الميل الجدار الوداجي لمزق أسفرت الإدراج والفشل لاستكمال أكثر الفاشلة وبالطبع الوقت 3 ساعة.
في حين أن النتائج المعروضة هنا هي من C57BL / 6J (ولدت في منزل) الفئران، وقد استخدمنا هذه التقنية للبث بنجاح باكليتاكسيل إلى عدة سلالات من الفئران، بما في ذلك FVB وسلالات مختلطة، لمتابعة الدوائية في نماذج الماوس التلاعب transgenically إلى أسفل تنظيم وظائف نقل الخلوية. عينات الدم والأنسجة جمعت أظهر المستويات المتوقعة من paclitaxايل، في مجموعة من المستويات التي شهدناها بعد ضخ الوريد 1. قد يكون من المتوقع أن تعمل بشكل جيد على قدم المساواة في نماذج الماوس الأخرى ومع حلول التسريب أخرى هذه التقنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة مركز سرطان المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام فوكس تشيس ومرفق مختبر الحيوان، وجدت لتكون وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية عن المعاملة الإنسانية للحيوانات.
1. إعداد أولي
- إعداد القسطرة: إعداد القسطرة من طول قصيرة من أنابيب البولي ايثيلين، معدلة لتشكيل ضعفت، نهاية اضعافها (الشكل 3A). جعل القسطرة متعددة مقدما وحفظ ما لا نهاية.
- إشعال الموقد بنسن، وضبط لتأسيس لهب ثابت منخفض. عقد أنابيب بالقرب من لهب لتخفيف البولي اثيلين. عندما يبدأ في الذوبان الأنابيب، وسحب ببطء بعيدا طرفي لإنشاء مقطع ضعفت من الأنابيب، وحوالي 0.25 مم OD.
- قطع نهاية مشطوف حوالي 0.75 سم طول القسم رقيقة. وهذا يضمن ما يكفي من الأنابيب ليتم تأمينها في الشريان، دون إنشاء قسطرة طويلة بشكل مفرط.
ملاحظة: نهاية رقيقة طويلة على الالبريد القسطرة لديها الميل إلى تسد. قد حدا طويلة بشكل مفرط أيضا عقد ما يكفي من السوائل لتغيير كبير قدرة القسطرة في حجم السائل. - بلانت نهاية مشطوف عن طريق تمرير بسرعة من خلال لهب - عند تسخينها بشكل صحيح، نهاية مدورة قليلا ويصبح الموسع. السنانير طرف الظهر قليلا، مما يساعد على ترسيخ أنابيب حين إدخالها في الشريان.
- قطع أنابيب 6.0 سم من النقطة التي يبدأ رقيقة. هذا يجعل قسطرة التحكم جدا، وهذا هو طويل بما فيه الكفاية لخيط حتى الخروج من عنق وعقد والعمل مع مريح، ولكن قصيرة بما فيه الكفاية لمنع الفأر من القضم على أنابيب الزائد أو التي تتطلب الكثير من حجم ضخ اضافية لمسح المالحة الأولية .
- تحضير حقنة حوالي 0.2 مل من محلول الهيبارين، وتصدرت مع إبرة اضعافها. ادخال الإبرة في نهاية واسعة من القسطرة (الشكل 3B). ملء القسطرة مع الهيبارين، والحرص على ضمان عدم وجود فقاعات فيالأنبوب. ضبط حقنة الهيبارين والقسطرة جانبا على منطقة معقمة. تعقيم القسطرة بواسطة أشعة جاما، من خلال وضع قسطرة (ق) في طبق بتري، وتعريض إلى 20 جراى من أشعة جاما. إذا لم يكن لديك الوصول إلى مصدر إشعاع غاما، تحقق مع مرفق حيوانك للتحقيق في وسائل أخرى للتعقيم، مثل الغاز أو الكيميائية التعقيم. لا الأوتوكلاف، والبولي إثيلين لا يمكن تعقيمها الحرارة.
- إنشاء الرصاص المالحة (الشكل 3B).
- تحضير حقنة ثانية من حوالي 0.5 مل محلول ملحي معقم، والحرص على ضمان وجود خط فقاعة خالية.
- قطع قطعة من الأنبوب الثاني، ما يقرب من 15 سم، وينزلق على إبرة حقنة اضعافها. إرفاق موصل منفذ إلى نهاية خالية من الأنابيب.
- اختبار هذا التدفق من المياه المالحة هو دون عائق من خلال دفع بسلاسة وحدة تخزين صغيرة من المياه المالحة من خلال الرصاص. استخدام هذا الرصاص المالحة بعد إدخال القسطرة، للتحقق من تدفق من خلالالقسطرة، وطرد خط الدم. ضبط حقنة المالحة جانبا على منطقة معقمة.
- قبل الجراحة، وتعقيم المعدات عن طريق التعقيم، أو بدلا من ذلك من قبل التعقيم الغاز أو تعقيم الزجاج حبة.
- إعداد المنطقة الجراحية المعقمة.
- يمسح مقاعد البدلاء والمجهر الأسطح بالمطهرات مثل الايثانول 70٪ أو ثاني أكسيد الكلور. تغطية مقعد وقاعدة المجهر مع المتاح، وسادة ماصة نظيفة.
- إعداد لوحة الجراحية من خلال تغطية مع اثنين من طبقات نظيفة، ورقة ماصة، بإحكام بشريط لاصق.
- وضع جميع المستلزمات الجراحية (حسب تصنيفها في قائمة المواد) بحيث يمكن الوصول إليها بسهولة.
- قطع ثلاثة أطوال خياطة العقيمة، 8 سم لكل منهما، ويوضع جانبا مع غيرها من اللوازم. وضع الميناء حيث سيكون متاحا بسهولة (الشكل 3B).
2. جراحة
- إعداد الحيوان
- Anesthetize الماوس عن طريق التعرض إلى 2-3٪ الأيزوفلورين في غرفة التخدير متصلة المرذاذ الدقة. سحب الماوس من الغرفة، وحلاقة الشعر من الرقبة / الجذع العلوي الماوس، وأسفل الأذن اليمنى (موقع قسطرة الخروج). إدارة الطب البيطري الفازلين مرهم للعين للعيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير. ضمان الحيوان لا توقظ خلال الاستعدادات الجراحية عن طريق السماح الماوس ما يكفي من الوقت في الغرفة الاستنشاقية قبل الإعدادية (اثنين على الأقل دقيقة)، أو عن طريق إدارة الأيزوفلورين على الماوس عن طريق مخروط الأنف أثناء الإعدادية. العودة الماوس لغرفة التخدير.
- عند الفأر هو خامل بما فيه الكفاية، والانتقال إلى منطقة جراحية معقمة، ومكان مخروط الأنف التخدير فوق الأنف الماوس، والفم، وتحويل تدفق الأيزوفلورين إلى مخروط الأنف. تأكيد التخدير السليم عن طريق معسر مخلب بالملقط. عندما يظهر الماوس أي رد فعل، انتقل إلى الخطوة التالية.
- ضع الماوس على ظهرها، مع رئيس يواجه نحومحقق. تأمين الأذنين، والصدارة والكفوف الكفوف هند-لوحة الجراحي بشريط لاصق أو جهاز الزجرية الأخرى للحفاظ على الماوس ثابتة. تنظيف المنطقة شق مع بوفيدون اليود و 70٪ من الإيثانول.
- عزل الشريان السباتي
- جعل 1 سم قطع طولية قليلا إلى اليمين من خط الوسط من الرقبة. استخدام ملقط لفصل الدهون والعضلات لفضح القصبة الهوائية (الشكل 4A). تحديد موقع مواز الشريان السباتي إلى القصبة الهوائية (الشكل 4B).
- استخدام ملقط لفافة بعناية منفصلة تغمر الشريان (الشكل 4C). بخفة سحب العصب المبهم جانبا من السباتي، وإدراج ملقط في الفضاء بين. ملقط مفتوحة بلطف لخلق فجوة في لفافة، وسحب بعناية بعيدا العصب من الشريان، من شوكة في الشريان بالقرب من الحنجرة (النهاية الأمامية)، بزيادة (الخلفي) قدر المستطاع (لا يقل عن 3 ملم) ( 4D الشكل).
- ازالة أي إعادةفآسيا املتبقي حتى الشريان معزولة جيدا (الشكل 4E). إضافة قطرة من المياه المالحة إلى منطقة الجراحة في بعض الأحيان للحفاظ على رطوبة الأنسجة، وبالتالي أقل هشاشة وأقل عرضة للتمزق بشكل عشوائي.
- التنسيب خياطة وإعداد الشريان لإدخال القسطرة (أرقام 4، 5).
- استخدام ملقط لرسم خيوط الجروح الحرير تحت الشريان. ربط عقدة آمنة لإغلاق الشريان بقدر تجاه الأمامي ممكن (الشكل 4F).
- رسم الموضوع الثاني تحت الشريان. ربط عقدة قابل ليغلق مؤقتا الشريان بقدر تجاه الخلفي ممكن (الشكل 4F).
- رسم الخيط الثالث تحت الشريان. ربط عقدة فضفاضة جدا بين الغرز الأولين، لاستخدامها لتأمين القسطرة بسرعة بعد وضع الشكل (4G).
- عقد ينتهي من جميع الغرز للخروج من الطريق بواسطة ترطيب لهم قليلا من 70٪ من الايثانول.
- مع خياطة، والاستيلاء على عقدة أدنى لسحب الشريان مشدود قليلا. نيك الشريان أعلاه، ولكن قريب جدا، خياطة الأمامية (الشكل 4H). يجب الحرص على عدم قطع عميق جدا، ولكن تأكد من شق للتأكد من فتح هو دون عائق.
- إزالة مليئة الهيبارين القسطرة من حقنة إبرة، في محاولة لتجنب خلق جيوب كبيرة من الهواء على طرفي. التعامل مع القسطرة لوضع شطبة في زاوية مريحة، بشكل عام نحو الانخفاض، وقليلا إلى اليمين (ليستخدمون اليد اليمنى).
- في حين عقد لخياطة للحفاظ على الشريان المتبقية مشدود قليلا، تضاف برفق القسطرة في فتحة (الشكل 4I). استخدام ملقط لعقد خياطة الأمامية وسحب طائرته فوق قسطرة الشرايين (مما أدى إلى ارتفاع مفرط مع القسطرة قد يؤدي في نهاية مشطوف إلى ثقب الشريان). الافراج بعناية القسطرة وخياطة الأمامي.
- تأمين القسطرة من خلال تشديد عقدة الخيط الوسطى، على مقربة من مدخل القسطرة في الشريان. جعل عقدة ثلاثية ضيقة، ولكن تأكد من عدم سحب ضيقة وذلك لعرقلة تدفق من خلال القسطرة. زيادة تأمين القسطرة من خلال ربطه أسفل مع خياطة الأمامية، تحت مدخل الشريان.
- نعلق الرصاص المالحة الى القسطرة عن طريق سد الموصل، في محاولة مرة أخرى لتجنب إدخال فقاعات الهواء إلى خط.
- فهم طرفي الخيط الخلفي وسحب بلطف الى الافراج عن عقدة. مناورة خياطة أسفل الشريان، خلال نهاية القسطرة (لا ازالة الموضوع). يجب أن يتدفق الدم إلى القسطرة. إذا لم يكن هناك تدفق الدم، وتذبذب بلطف قسطرة في محاولة لإزالة انقباض.
- عندما يظهر تدفق دون عائق، واستخدام الخيط الأخير (من الخيط الخلفي) لربط وعقدة إضافية، أعلى قليلا من خياطة المتوسطة.
- بالملقط في كل جهة، واستخدام زوج واحد من ملقط على التمسك القسطرة فقط دون خياطة الأمامية، ومع الآخر، اضغط شبك في القسطرة لذلك سوف ينحني بسهولة إلى الجانب. كرر لإنشاء شبك الثاني. وهذا يسمح للنهاية خالية من القسطرة ليتم سحبها نحو الجزء الخلفي من الرأس الماوس، ودون فرض طرف القسطرة لتحويل أفقيا ضد جدار الشريان.
- تحويل الماوس على على (يسار) الجانب، والحفاظ على مخروط الأنف وضعه فوق الفم والأنف، وتنظيف المنطقة شق مع 70٪ من الإيثانول وبوفيدون اليود. إجراء شق صغير (حوالي 4 مم) أدناه وخلف الأذن اليمنى. استخدام ملقط لعقد رفرف مفتوحة من الجلد، مع العمل على تحقيق جوفاء حادة تحت الجلد لإنشاء قناة عبر الخد، إلى تجويف في الرقبة. فمن المستحسن لجعل التحقيق حول الغدة اللعابية، بدلا من محاولة الذهاب بين الغدة والجلد. استخدام ملقط لتحرير مساحة بعناية لتحقيق للخروج.
- كاتب قابس / منفذ القسطرة من خلال التحقيق للخروج في الرقبة. لا تسحب من الصعب جدا. تأكد القسطرة لا سحق أو تضييق الأوعية الدموية أو الأعضاء.
- إدارة مسكن موضعي لشق الصدر، والجرح وثيق مع الحرير أو المواد الغذائية.
- إزالة الماوس من التخدير، والسماح للحيوان للتعافي في نظيفة، وارتفعت درجة حرارة الفضاء (مكان القفص على رأس وسادة التدفئةأو تحت مصباح الحرارة)، لمدة 30 دقيقة على الأقل.
3. التسريب
- إعداد aliquots من 5 ملغ / مل من محلول باكليتاكسيل / الميثانول.
- قياس 50 ملغ من باكليتاكسيل في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. إضافة 10 مل من الميثانول العقيمة. غطاء الأنبوب. تدور باليد أو على شاكر الدورية في درجة حرارة الغرفة حتى يذوب المسحوق.
- قسامة 500 ميكرولتر من الحل في أنابيب صغيرة آمنة 20، الفريزر، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- قسامة الفردية ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة أو في الحمام 37 درجة مئوية الماء، وذلك مباشرة قبل الحقن.
- إعداد مضخة التسريب (الشكل 6).
- قطع طول طويل من أنابيب البولي ايثيلين حوالي 40 سم. نعلق إبرة اضعافها الى نهاية واحدة، ومنفذ موصل إلى الطرف الآخر.
- وضع المخدرات في المحاقن مع القطر الداخلي المعروف (ومعظم مضخات للبرمجة يتطلب قطر برميل حقنة، من أجل حساب سرعة من الالبريد مضخة الذراع). إرفاق الإبرة إلى حقنة وتحميل المخدرات عن طريق الإبر والأنابيب.
- وضعه في حقنة في مضخة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. الرئيسية المضخة بحيث المخدرات تتدفق بسلاسة من المكونات موصل، وانها مستعدة للتسريب.
- إرفاق الماوس للضخ.
- عقد الماوس ثابتة واستخدام مرقئ لكبح القسطرة، على مقربة من ميناء قابس. إزالة المكونات واستبدال موصل تعلق على حقنة والأنابيب.
ملاحظة: قد يبدأ الدم في التدفق إلى الوراء من خلال أنابيب. - إدارة بسرعة مضخة بسرعة واضحة إلى حجم القسطرة (المحسوبة تجريبيا من خلال مراقبة حجم 6 سم من الأنابيب)، ثم التبديل على الفور إلى معدل ضخ المطلوب.
- عقد الماوس ثابتة واستخدام مرقئ لكبح القسطرة، على مقربة من ميناء قابس. إزالة المكونات واستبدال موصل تعلق على حقنة والأنابيب.
- مواصلة ضخ باكليتاكسيل للدوام لمدة ثلاث ساعات.
- مراقبة أنابيب أحيانا للتحقق من وجود تسرب في التقاطعات حيث أن هذا غالبا ما يكون علامة على وجود انسداد في التدفق على الماوس.مشاهدة الماوس لردود الفعل المتوقعة أو غير المتوقعة إلى ضخ (الخمول أو النشاط المفرط، علامات الانزعاج).
- اعتمادا على طول وطبيعة التسريب، قد الماوس لا تأكل أو تشرب، ولكن يجب التأكد من توفر الغذاء والماء وفقا لسياسة ثابتة للمؤسسة. يكون على بينة من احتمال التجفيف الماوس من خلال جمع كميات كبيرة من الدم.
- مواصلة للحفاظ على الحارة قفص مع وسادة التدفئة أو مصباح، ما لم يظهر الماوس إلى الرغبة في البقاء بعيدا عن الحرارة. إذا لم يكن الموت الرحيم الحيوان في غضون عدة ساعة بعد الجراحة، وتنفيذ خطة للعلاج بعد الجراحة من الحيوانات، بما في ذلك ظروف السكن العقيمة وعلاج الألم بعد العمليات الجراحية.
- تراقب عن كثب على الماوس، وخاصة في أول دقائق قليلة، لضمان عدم سحب الأنابيب من خلال فرط النشاط أو تهيج من أنابيب (التي قد تكون علامة على وجود الإدراج الفقراء). إذا كان الفأر هو عدم الإفراط في نشطة، رصد ومراقبة مستمرةحلقة قد لا يكون ضروريا، ولكن تحقق الماوس بشكل روتيني للتأكد من عدم الحصول على متشابكة الحيوان في الأنبوب. وتسخير ونظام حبل متاح تجاريا، ولكن استخدامها هو خارج نطاق هذا البروتوكول.
- جمع العينات.
- جمع عينات الدم على فترات منتظمة من قبل تنزف تحت الفك السفلي أو الرجعية المدارية (إذا لم البروتوكول الخاص الاستفادة من نماذج ورم الثدي، والنظر في جمع الدم عن طريق قسطرة الوريد إدراجها في نفس الوقت قسطرة الشريان السباتي). يجب الحرص على عدم سحب على خط ضخ. إذا جمع كتبها نزيف الرجعية المدارية، تخدير طفيفة الماوس مع تخدير الاستنشاق (مثل ميثوكسي فلوران) حتى واحد لا يلزم أن انتزاع من القفا لتأمين الماوس.
- تدور في الدم hemocrit الطرد المركزي لفصل خلايا الدم من البلازما. استخدام ملف أو الماس طرف قلم ليسجل أنبوب في مواجهة مرحلة الانفصال. كسر أنبوب وجمع البلازما فقط، إلى صغيرة، أنبوب الفريزر آمن. تخزين في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
ملاحظة: إذا كان جهاز للطرد المركزي hemocrit غير متوفر، نقل عينة من الدم في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة، وتدور في أجهزة الطرد المركزي الصغيرة بسرعة عالية لفصل خلايا الدم من البلازما. جمع البلازما في أنبوب ثان، وتخزينها في -80 درجة مئوية. - الموت ببطء الماوس عن طريق CO 2 الاختناق. جمع الأنسجة (حوالي 20 - 50 ملغ) من أجهزة الفائدة وتجميد فلاش في النيتروجين السائل. تخزين في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
4. تحليل عينة
ملاحظة: جميع العينات لهذا البروتوكول تم تحليل من خلال مختبر خارجي من قبل السائل اللوني، جنبا إلى جنب الطيف الكتلي (LC - MS / MS)، الذي يحسب على تركيزات باكليتاكسيل على النحو التالي:
- استخراج عينات من باكليتاكسيل. التجانس عينات الأنسجة في حمض الخليك 0.1٪، 50٪ الميثانول قبل الاستخراج. استخراج باكليتاكسيل عن طريق استخراج السائل / السائلة، وذلك باستخدام الأثير الميثيل ثالثي بوتيل (MTBE) المحصنة مع معيار التناظرية الداخلي (DOCETAXEL). إزالة MTBE والعينات الجافة. Resuspend في 50٪ الأسيتونتريل، 0.1٪ محلول حامض الخليك.
- إعداد معايير المعايرة. إضافة تركيز معروف من باكليتاكسيل المناسبة لC57BL / 6 المصفوفة للحصول على مجموعة من المعايير النهائي (من 1 إلى 20000 نانوغرام / مل لعينات البلازما، من 0.1 إلى 5000 نانوغرام / مل لعينات الأنسجة). استخراج المعايير في نسختين، وذلك باستخدام نفس الأسلوب بالنسبة للعينات الدراسة أعلاه. قياس الذروة باكليتاكسيل في عينات من قبل HPLC / MS / MS باستخدام التأين electrospray.
- حساب تركيز باستخدام نسبة مساحة باكليتاكسيل لمعيار داخلي. استخدام مقاييس المعايرة لخلق منحنى القياسية، وعينات الدراسة محرف من قبل صالح على المنحنى. تطبيع تركيز عينات الدراسة من وزن يبدأ من العينة قبل التجانس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتبع التوزيع باكليتاكسيل أنماط يمكن التنبؤ بها خلال 3 ساعة الجرعات نظام من 15 دقيقة عالية السرعة التسريب، تليها 165 دقيقة السرعة المنخفضة الحقن في الوريد.
ويبين الشكل 1 مقارنة بين الوريد الوريد، الحقن باكليتاكسيل تركيزات البلازما والشريان السباتي-دفعات. انخفاض تركيزات باكليتاكسيل بسرعة في 15 دقيقة الأولى بعد ضخ كبيرة الحجم الأولي، ثم يستقر على مدى 150 دقيقة المقبل. وبالمقارنة، فإن مستويات باكليتاكسيل في ضخ الفقراء وتبدأ منخفضة نسبيا، وتحوم صعودا وهبوطا طوال الفحص. وكان هذا على الأرجح سببه انسداد في خط ضخ في وقت مبكر. وتشير سجلات فحص زيارتها الماوس قليلا إلى أي رد فعل خارجي على التسريب، مؤيدة فكرة الادارة أدنى من المخدرات. ويبين الشكل 2 المستويات النسبية للباكليتاكسيل في الكبد وأنسجة المخ، وكذلك بلازما الدم، في نهاية ضخ 3 ساعة.
jove_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما ">
تمثل مستويات باكليتاكسيل البلازما خلال الشريان السباتي والوريد ضخ المنحنيات تركيزات باكليتاكسيل البلازما في الفئران الفردية: الرقم 1. تلقى كل فأر ضخ ثنائي الطور، تتكون من الأولية عالية السرعة، 15 دقيقة ضخ 0.42 ملغ / كغ / دقيقة، تليها مباشرة على سرعة منخفضة، 165 دقيقة ضخ 0.021mg / كغ / دقيقة. كانت المنطقة تحت المنحنى (AUC) لالسباتي ضخ ما يقرب من 59 ميكروغرام / مل ∙ دقيقة مقابل لAUC للتسريب الوداجي ما يقرب من 37 ميكروغرام / مل ∙ دقيقة. كان نصف عمر باكليتاكسيل تحسب من المنحنيات الناتجة عن السباتي ضخ 10 دقيقة وللتسريب الوداجي كانت 11 دقيقة. يظهر ضخ السباتي تقريبا مستويات مماثلة من تركيز الدواء مقابل ضخ الوداجي. تركيزات منخفضة مستمرة، أو تركيزات تلك الدورة صعودا وهبوطا، وغالبا ما صEPRESENT ضخ الفقراء.
الشكل 2: تركيز باكليتاكسيل من قبل الأنسجة فور 3 ساعة باكليتاكسيل ضخ وجمع عينة الدم الأخيرة، كان الموت الرحيم الماوس، وجمعت عينات الكبد وأنسجة المخ. تم الحصول عليها باكليتاكسيل مستويات تركيز في البلازما والأنسجة عن طريق تحليل كتلة المواصفات. وتمثل هذه البيانات العينات التي تم جمعها من السباتي تسريب ماوس في الشكل 1.
الرقم 3: أدوات الجراحية. (A) الإنتاج القسطرة: سحب القسطرة الخاصة منها وتبقي بانخفاض النفقات المادية، بينما يسمح للإعادةالباحث لتصميم حجم وشكل القسطرة لعمر وحجم الماوس (ب) إعداد قبل الجراحة: ثلاثة (3) خيوط الحرير، حوالي 8 سم لكل منهما؛ معقم المكونات الميناء؛ حقنة المالحة والرصاص؛ القسطرة، تعلق على حقنة الهيبارين.
الشكل 4: إعداد الشريان السباتي والقسطرة الإدراج. (A) قطع طريق الجلد، والتحرك جانبا الغدد واستخدام ملقط لفصل الدهون بشكل صارخ لفضح العضلات. (ب) استخدام ملقط لبرفق العضلات منفصلة لفضح الجانب الأيمن من القصبة الهوائية. سوف الشريان السباتي تصبح مرئية كما أكبر والأوعية سميكة الجدران، مواز للالقصبة الهوائية. (C) استراحة رباط حول الشريان. (D) العصب المبهم منفصلة من الشريان السباتي. (ه) مواصلة إزالة رباط حتى carotiد معزول تماما على طول تجويف. (F) خياطة عقدة دائمة في الطرف الأمامي، وزلة عقدة في الطرف الخلفي. (G) هي الخيوط خياطة الثالثة تحت السباتي وفضفاضة جدا معقود. ورصدت (H) فقط فوق الشريان الأمامي خياطة. ( I) أدخل القسطرة في الشريان في نيك. الاستيلاء على خياطة الأمامية مع ملقط لسحب الشريان طائرته فوق القسطرة. (J) القسطرة في الشريان السباتي الآمنة مع جميع الغرز الثلاثة.
الرقم 5: وضع خياطة تمثيل تخطيطي للموقع الجراحية قبل وبعد تركيب القسطرة ويتوافق مع صورة الشكل 4G، مع إضافة نك في الشريان، كما في الشكل 4H.
شغل تخطيطي ضخ مجموعة المتابعة الحقنة مع المخدرات، وتوج مع إبرة حادة: الرقم 6. خط البولي ايثيلين تعلق حقنة لالسباتي القسطرة. ضخ حقنة يضغط ببطء، لتقديم جرعة موحدة مباشرة إلى مجرى الدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الشريان السباتي التسريب هو تقنية كبيرة في هذه الدراسة الدوائية باكليتاكسيل. الشريان السباتي التسريب هو طريقة لتوزيع المخدرات بسرعة في جميع أنحاء الدورة الدموية 14. في ساعة ضخ 3 هو أقرب تقليد الإدارة السريرية للعقاقير مثل taxanes من حقن البلعة. الجراحة يمكن أن يؤديها بشكل موثوق من قبل فرد واحد، والوقت لعملية جراحية قصيرة نسبيا، ومعدلات النجاح و> 75٪. بعد أن يتم جمع عينات، لا بد من تحليلها بالطرق المناسبة. كنا مطياف الكتلة لتحديد تركيز باكليتاكسيل في البلازما والأنسجة العينات. لمزيد من التحقق من صحة هذه التقنية، أرسلنا عينات الدم والأنسجة إلى المختبر للتحليل مستقل. وقد رسم هذه البيانات الفردية كما منحنيات تركيز البلازما باكليتاكسيل لكل حيوان اختبار (الشكل 1)، وتمت مقارنة توزيع باكليتاكسيل في أنسجة مختلفة (الشكل 2). في كل حالة، فمن ايمبالغ الأهمية بالنسبة إلى النظر في أفضل طريقة لتحليل توزيع المخدرات و / أو الأيض، وهذا يتوقف على المخدرات ونظام الفائدة. ويمكن أن تشمل الخيارات الأخرى لقياس الأدوية المختلفة HPLC للأشعة فوق البنفسجية أو المناعية 2.
اثنين من العوامل الأساسية الضرورية لنجاح قسطرة الشريان السباتي هي كذلك القسطرة الطراز ومتفوقة عزل الشريان. تشكيل القسطرة وفقا لحجم نموذج الفأر من الأهمية بمكان. إذا كان قطرها قسطرة سميكا جدا، وسوف الإدراج في الشريان يكون صعبا بشكل مفرط، في حين قسطرة رقيقة جدا وسوف يكون من الصعب تأمين ويحتمل أن تسد قبل أو أثناء الحقن في الوريد. كما يجب أن تكون زاوية وحدة من طرف القسطرة في نطاق معتدل. تلميح التي هي حادة جدا قد ثقب في جدار الشريان، في حين أن الطرف الذي هو مملة جدا وسوف يكون من الصعب إدخاله في الشريان. وقد استمدت القياسات الواردة هنا باستخدام البالغ من العمر عشرة أسابيع C57BL / 6J الفئران، ما يقرب من 20 غراما، كقالب نموذج. يجب تحجيمها القياساتصعودا أو هبوطا تجريبيا لتناسب النماذج الفردية.
يجب أن يكون عزل من الشريان السباتي لذلك، عملية متعمدة الحساسة لتجنب أضرار لا داعي للأنسجة لمنع النزيف واسعة النطاق. عموما يمكن تحت الجلد من الدهون يمكن فصلها بسهولة مع انخفاض في ملقط حادة المتوسطة. يجب فصل الأنسجة العضلية خلال الشريان السباتي مع المتوسط إلى غرامة ملقط يميل إلى جانب التحيز لألياف العضلات. إذا كانت الفجوة أكثر اتساعا ضرورية، يجب أن يكون فني دقيق للغاية لتجنب تمزق الأوعية الدموية الصغيرة. مرة واحدة في الشريان السباتي مرئيا، ستظل هناك قدر لا بأس به من رباط الذي يحتاج إلى tweezed بعيدا من الشريان مع ملقط يميل غرامة. أخيرا، يجب فصل العصب المبهم من الشريان السباتي دون ضرر لأحد. عندما يتم عزل الشريان السباتي بشكل صحيح، يجب أن يكون من الممكن إدراج ملقط تحتها، مع مساحة فارغة على جانبي الشريان (انظر الشكل 4E).
عندما تروبلي اطلاق النار ضخ الفقيرة، تبدأ من خلال مراجعة التعليمات على مضخة للتأكد من أن المحقق تمت برمجتها بشكل صحيح المضخة لتقديم جرعة من المتوقع. ثم، والنظر بعناية تغيير حجم الذي سيتم تقديمه في اختبار الحيوانات. يجب أن تحسب التخفيف من المخدرات حتى أن حجم جرعة غير مناسبة: يجب أن لا يكون حجم كبير جدا بالنسبة للحيوان ليتسامح، وسوف مثالي لا تؤثر تأثيرا كبيرا في ضغط الدم. ومع ذلك يجب أن يكون حجم كبير بما فيه الكفاية لمضخة لتسليم موثوق بها، وسوف تخلق تدفق مستمر لتجنب السدادات عند التقاطعات. إذا السدادات تصبح حدثا عاديا، والنظر في التحول إلى مقياس أصغر (قطر أكبر) إبرة والأنابيب. وعلاوة على ذلك، إذا كان المحتوى المخدرات البلازما لا يصل المستويات المتوقعة، ينبغي للباحث التحقق من الفئران بعد الوفاة لتحديد ما إذا القسطرة لا تزال في وضع جيد في الشريان والتدفق الحر، وتعديل شكل / حجم القسطرة حسب الضرورة.
وusefulnوفاق سطيف هذه الطريقة قد تكون محدودة بسبب عوامل مثل حجم والصحة العامة للموضوع، وطول الوقت المقصود من التسريب. الجراحة والحقن يمكن أن يرهق موضوعا المتعثرة بالفعل. حتى في حيوان سليم، قسطرة الشريان السباتي هي مناسبة فقط للدفعات قصيرة المدى، وعادة عدة ساعات إلى عدة أيام. النظر في طرق لتخفيف الألم وسوف تستخدم إذا أظهرت الفئران علامات الانزعاج ردا على حقن المخدرات، مثل التطبيقات المتكررة للتخدير موضعي لجرح المواقع، أو المسكنات النظامية وقائية. سيكون من الضروري أن يكون كل عمل الحيوانية المعتمدة من قبل المنظمة الحيوانية المحلية أو التنظيمية IACUC، للحصول على الأذونات المناسبة لتنفيذ هذا الإجراء. إذا كان من الضروري أن يكون هناك ضخ أطول، أو أن يكون الماوس البقاء على قيد الحياة التسريب لفترة طويلة من الزمن، لا بد من استكشاف طرق بديلة التسريب.
بعد أن يتقن perfusions الشريان السباتي في الدراسةوالدوائية للباكليتاكسيل، ونحن نخطط لاستخدام هذه التقنية في المستقبل لتحقيق آثار المخدرات الأخرى، وجهري Abcc10 في C57BL / 6J والفئران FVB، ونماذج الماوس الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نود أن نعترف مرفق FCCC مختبر الحيوان لما قدموه من دعم في هذا المشروع. نشكر مختبرات وولف، وشركة لمساعدتهم في تحليل مستويات باكليتاكسيل في البلازما والأنسجة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح K01CA120091 لEHB، وCA06927 لفوكس تشيس للسرطان مركز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene tubing 0.024” OD X 0.011” ID | Braintree Scientific, Inc. | PE10 | |
| 3 Blunted needles (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | NB-30 | |
| Stainless steel port plug (28 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | PP-28 | Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal. |
| 2 Stainless steel connector plugs (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | C-30 | |
| Three 1 cc syringes | Becton, Dickinson and Co. | 309659 | |
| Sterile 0.9% Saline solution | Hospira | 0409-7984-37 | |
| Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution | Braintree Scientific, Inc. | HGS | |
| Silk suture | Braintree Scientific, Inc. | SUT-S 113 | |
| Vanna Scissors (micro-scissors) | World Precision Instruments | 14122 | This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well. |
| Hartman Mesquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 501705 | |
| Betadine Swabsticks | Perdue Products L.P. | BSWS1S | |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1160-01 | May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia. |
| Paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Micro Capillary Tube Sealant | Fisher Scientific | 02-678 | |
| C57BL/6J mice | Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred | ||
| API 4000 Q-Trap mass spetrometer | Applied Biosystems |
References
- Gallo, J. M., Li, S., Guo, P., Ma Reed, K., J, The Effect of P-Glycoprotein on Paclitaxel Brain and Brain Tumor Distribution in Mice. Cancer Research. 63 (16), 5114-5117 (2003).
- Sonnichen, D. S., Relling, M. V.
- Gianni, L., et al. Nonlinear Pharmacokinetics and Metabolism of Paclitaxel and Its Pharmacokinetic / Pharmacodynamic Relationship in Humans. Journal Clinical Oncology. 13 (1), 180-190 (1995).
- Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. Nonlinear Pharmacokinetics of Paclitaxel in Mice Results from the Pharmaceutical Vehicle Cremophor EL. Cancer Research. 56 (9), 2112-2115 (1996).
- Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. Determination of paclitaxel and metabolites in mouse plasma, tissues, urine and faeces by semi-automated reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 664, 383-391 (1995).
- Bradshaw-Peirce, E. L., Eckhardt, S. G., Gustafson, D. L. A Physiologically Based Pharmacokinetic Model of Docetaxel Disposition: from Mouse to Man. Clinical Cancer Research. 13, 2768-2778 (2007).
- Eiseman, J. L., et al. Plasma Pharmacokinetics and Tissue Distribution of Paclitaxel in CD2F1 Mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 34 (6), 465-471 (1994).
- Schinkel, A. H., et al. Normal Viability and Altered Pharmacokinetics in Mice Lacking mdr1-type (drug-transporting) P-glycoproteins. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 4028-4033 (1997).
- Fraser, I. J., Dear, G. J., Plumb, R., L’Affineur, M., Fraser, D., Skippen, A. J. The Use of Capillary High Performance Liquid Chromatography with Electrospray Mass Spectrometry for the Analysis of Small Volume Blood Samples from Serially Bled Mice to Determine the Pharmacokinetics of Early Discovery Compounds. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 13 (23), 2366-2375 (1999).
- Bateman, K. P., et al. Reduction of Animal Usage by Serial Bleeding of Mice for Pharmacokinetic Studies: Application of Robotic Sample Preparation and Fast Liquid Chromatography – Mass Spectrometry. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 754 (1), 245-251 (2001).
- Berndt, K., Vogel, J., Buehler, C., Vogt, P., Born, W., Fuchs, B. A new method for repeated drug infusion into the femoral artery of mice. J. Am. Assoc. Lab Animal Sci. 51 (6), 825-831 (2012).
- Fergusson, G., Ethier, M., Zarrouki, B., Fontés, G., Poitout, V. A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat. J. Vis. Exp. (78), (2013).
