Summary
שיטה זו פותחה במטרה לספק פתרון תרופתי קבוע באמצעות העורק הראשי, כדי להעריך את הפרמקוקינטיקה של תרופות חדשניות במודלים של עכברים.
Abstract
כאשר מציעים את השימוש של תרופה, שילוב תרופות, או אספקת סמים למערכת רומן, יש להעריך את הפרמקוקינטיקה של התרופה במודל המחקר. ככל שהשימוש במודלים של עכברים הוא לעתים קרובות צעד חיוני בגילוי תרופות פרה-קליני ופיתוח תרופות 1-8, יש צורך לתכנן מערכת להציג תרופות לעכברים במדים, אופן לשחזור. באופן אידיאלי, המערכת צריכה לאפשר איסוף דגימות דם במרווחים זמן קבוע על מסלול זמן מוגדר. היכולת למדוד ריכוזי תרופה על ידי ספקטרומטר מסה, אפשרה לחוקרים לעקוב אחר השינויים ברמות תרופה בפלזמה לאורך זמן בעכברים בודדים 1, 9, 10. במחקר זה, פקליטקסל הוכנס עכברים הטרנסגניים כעירוי דם מתמשך על פני שלוש שעות, ואילו דגימות דם נלקחו בו זמנית על ידי דימומי רטרו מסלולית בנקודות זמן מוגדר. חליטות עורק התרדמה הן חלופה פוטנציאלית לחליטות וריד הצוואר, כאשר גורמים כמוגידולי החלב או מכשולים אחרים לעשות חליטות הצוואר מעשיות. שימוש בטכניקה זו, ריכוזי פקליטקסל בפלזמה וברקמות השיגו רמות דומות בהשוואה לעירוי הצוואר. במדריך זה, אנו נדגים כיצד לצנתר את העורק הראשי בהצלחה על ידי הכנת קטטר מותאם למודל העכבר הבודד, ולאחר מכן להציג כיצד להוסיף ולהבטיח את הצנתר לתוך עורק הצוואר עכבר, חוט סוף הצנתר דרך חזרה צווארו של העכבר, ולחבר את העכבר למשאבה כדי לספק קצב מבוקר של זרם סמים. דימומי רטרו מסלולית נפח נמוך מרובים מאפשרים ניתוח של ריכוזי תרופה בפלזמה לאורך זמן.
Introduction
עירוי תרופות דרך עורק התרדמה ניתן לבצע באופן אמין וreproducibly על ידי אופטימיזציה של ציוד וטכניקה. ההליך הוא לא מסובך, למרות שזה דורש בקרה טובה ותשומת לב לפרטים. טיפול ומיומנות מעולים יש צורך לבודד את העורק הראשי ולהכניס את הצנתר, אשר בדרך כלל ניתן לרכוש באמצעות תרגול. ניתוח על ידי טכנאי מנוסה לא יעלה על שעה אחת. לאחר ניתוח מוצלח, העכבר צריך להופיע נורמלי ובריא (אם כי העכבר עשוי להגיב לעירוי התרופה בפועל), ותרופה (ים) עשויה להיות מנוהלת במינון רציף, אחיד בשליטה. דגימות דם חייבות להילקח מאתר אחר מאשר העורק הראשי; דימומי רטרו מסלולית הוכיחו קל לאסוף ומניח את דעת לניתוח של ריכוזי תרופה.
צנתרים של גודל אופטימלי וצורה הם נכס לא יסולא בפז בביצוע עירוי מוצלח 11. מצאנו commerciall זמין הצנתריםy לעתים קרובות להיות גדול ו / או גמיש מדי כדי לאפשר גישה נוחה לעורק הראשי עכבר מדי. זה הוכיח עדיף על צנתרים אופנה מצינורות פוליאתילן המשמשים לחיבור העכבר למזרק העירוי. כך, כל צינורות, המחברים והמחטים היו בממדים עולים בקנה אחד, שפשוט הרכבה עירוי. השימוש בטכניקה זו, אין צורך לדחוף את קצה הצנתר לתוך העורק מעבר לנקודה שבה עדיין גלוי, וזרימת דם לעורק הראשי לא שוחזרה עד לאחר קטטר תחילה מאובטח. הפעולה זו מפחיתה את הסכנות של ניקוב העורק או שיש קטטר נדחפו החוצה על ידי הלחץ הגבוה של זרימת דם. עיצוב קטטר במסמך זה אינו כולל "להקפיץ" להחזיק אותו במקום, ולכן הבטחת קטטר גם עם תפרים ואספלנית היא בראש סדר עדיפויות.
חליטות עשויות להיות עדיפות על זריקות בולוס iv המשותפים, כטובות יותר חקיין של ממשל הקליני שלתרופות כגון taxanes 3, 12, 13. הטכניקה המתוארת כאן פותחו במקור כדי לאפשר לעירוי לתוך מודלים של עכברים שבי גישה לוריד הצוואר או הירך נמנעה בגלל צמיחת גידול החלב ו / או כלי דם יתר של אזור ההחדרה. שיטה זו עשויה לעתים להיות מתאימה גם בעכברים ללא גידול, למרות שבידוד וcatheterizing התרדמה הוא מעט יותר פולשנית, שמצאנו אותו עדיף על הצוואר, כי הנטייה של קיר הצוואר לקרוע הביאה הוספות וכישלונות כדי להשלים נכשלו יותר כמובן זמן 3 שעות.
בעוד שהתוצאות מופיעות כאן הן מC57BL / 6-י (ב- הוליד בית) עכברים, השתמשנו בטכניקה זו כדי להחדיר בהצלחה פקליטקסל לכמה זנים של עכברים, כוללים FVB ומעורבים-זנים, כדי לעקוב הפרמקוקינטיקה במודלים של עכברים שהופעלו transgenically ללמטה לווסת פונקציות טרנספורטר סלולריות. דגימות הדם ורקמה שנאספו הראו רמות צפויות של paclitaxאל, בטווח של הרמות שנראו לאחר חליטות הצוואר 1. טכניקה זו ניתן לצפות כי עבודה לא פחות טובה במודלים של עכברים אחרים ועם פתרונות עירוי אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה למלחמה בסרטן מרכז מוסדי טיפול בבעלי חיים והשימוש פוקס צ'ייס ועל ידי מתקן בעלי החיים במעבדה, ונמצא כי בהתאם להנחיות מוסדיות ליחס אנושי לבעלי חיים.
1. ראשוני הכנה
- הכנת קטטר: הכן קטטר מאורך קצר של צינורות פוליאתילן, שונה כדי ליצור סוף קהה (איור 3 א) דליל,. הפוך צנתרים מרובים מראש ולחסוך זמן בלתי מוגבל.
- להדליק מבער בונזן, ולהתאים להקמת להבה יציבה נמוכה. להחזיק צינורות קרובים ללהבה כדי לרכך פוליאתילן. כאשר צינורות מתחילים להתמוסס, למשוך לאט בין שני הקצוות כדי ליצור סעיף דליל של צינורות, כ מ"מ OD 0.25.
- חותך סוף משופע כ 0.75 סנטימטר לאורך דק סעיף. הדבר מבטיח מספיק צינורות להיות מאובטחים בעורק, מבלי ליצור צנתר ארוך מדי.
הערה: סוף דק וארוך על היש קטטר דואר נטייה לסתום. סוף ארוך מדי יכול גם להחזיק מספיק נוזל לשנות קיבולת נפח הנוזל של הצנתר באופן משמעותי. - להקהות את הסוף המשופע על ידי עובר במהירות דרך הלהבה - כאשר מחומם כראוי, הסוף נעשה מעט מעוגל ומוגדל. ווי הקצה מעט לאחור, מה שעוזר לעגן את צינורות תוך שהוא מחדיר לתוך העורק.
- חותך את 6.0 סנטימטר צינורות מהנקודה שבה מתחילה דק. זה עושה את צנתר לניהול מאוד, זה מספיק זמן לחוט ועד ליציאה מהצוואר ולהחזיק ולעבוד בנוחות, אבל קצר מספיק כדי למנוע את העכבר ממכרסם בצינורות עודפים או דורשים יותר מדי תוספת עירוי נפח כדי לנקות מלוח ראשוני .
- הכן מזרק של כ 0.2 מיליליטר פתרון הפרין, עקף עם מחט קהה. הכנס מחט לתוך הקצה הרחב של הצנתר (איור 3 ב). מלא קטטר עם הפרין, להיות זהיר, כדי להבטיח שאין בועות בצינורות. הגדר את מזרק הפרין וקטטר בצד על שטח סטרילי. לעקר צנתרים על ידי קרינת גמא, על ידי הצבת קטטר (ים) בצלחת פטרי, וחושף עד 20 Gy של קרינת גמא. אם אין לך גישה למקור קרינת גמא, לבדוק עם מתקן בעל החיים שלכם לחקור באמצעים אחרים של עיקור, כגון גז או כימי-עיקור. אל חיטוי, פוליאתילן לא ניתן לעקר בחום.
- יצירת להוביל מלוח (איור 3 ב).
- הכן מזרק שני בסך של כ 0.5 מיליליטר תמיסת מלח סטרילית, להיות זהיר, כדי להבטיח קו-חופשית בועה.
- חותכים חתיכה שנייה של צינור, כ -15 סנטימטרים, ולהחליק על מחט המזרק הקהה. צרף יציאת מחבר לקצה החופשי של הצינור.
- לבדוק את הזרימה של מי מלח היא בלא הפרעה על ידי בצורה חלקה קידום נפח קטן של תמיסת מלח באמצעות העופרת. השתמש להוביל מלוח זה לאחר הכניסה קטטר, כדי לבדוק את הזרימה דרךקטטר, ולשטוף את הקו של דם. הגדר את המזרק מלוח בצד על שטח סטרילי.
- לפני הניתוח, לעקר ציוד על ידי מעוקר, או לחלופין על ידי עיקור גז או עיקור חרוז זכוכית.
- הכן אזור ניתוח סטרילי.
- נגב את משטחי ספסל ומיקרוסקופ עם אתנול כגון 70% חומר חיטוי או כלור דו-חמצני. לכסות ספסל ובסיס מיקרוסקופ עם כרית חד פעמית, סופגת נקייה.
- הכן לוח כירורגית על ידי כיסוי עם שתי שכבות של נייר נקי, סופג, מחוברים היטב עם נייר דבק.
- להוציא את כל הציוד כירורגי (כפי שקוטלג בחומרי רשימה), כך שהם נגישים בקלות.
- חותך שלושה אורכים של תפר סטרילי, 8 סנטימטרים כל אחת, ומניח בצד עם אספקה אחרת. הנח נמל שבו יהיה זמין בקלות (איור 3 ב).
2. ניתוח
- הכנת בעלי החיים
- Anesthעכבר etize על ידי חשיפה לisoflurane 2-3% בתא הרדמה מחובר למכשיר אידוי דיוק. לסגת עכבר מן החדר, ולגלח את השיער מהצוואר / גופו העליון של העכבר, ומתחת לאוזן ימין (אתר של יציאת קטטר). נהל משחה וטרינרי וזלין עיניים לעיניים למניעת יובש ואילו בהרדמה. ודא בעלי החיים לא יתעורר בזמן הכנות כירורגית על ידי מתן זמן מספיק עכבר בתא שאיפה לפני הכנה (לפחות שתי דקות), או על ידי מתן isoflurane לעכבר באמצעות חרטומו בזמן הכנת שיעורים. חזור עכבר לתא הרדמה.
- כאשר העכבר הוא מספיק אינרטי, לעבור לאזור ניתוח סטרילי, מקום חרטום הרדמה מעל אפו של העכבר ופה, ולהטות את זרימת isoflurane לחרטום. לאשר הרדמה נאותה על ידי צובט כפה עם מלקחיים; כאשר העכבר לא מראה שום תגובה, המשך לצעד הבא.
- מקם את העכבר על גבה, עם הראש פונה לכיווןחוקר. אבטח את האוזניים, קדמי ואחוריים כפות-רגליים ללוח כירורגית עם דבק או התקן ריסון אחר כדי לשמור על העכבר יציב. נקה את אזור החתך עם povidone- יוד ו -70% אתנול.
- בידוד של עורק התרדמה
- הפוך 1 סנטימטר אורך לחתוך מעט ימינה של קו האמצע של הצוואר. שימוש במלקחיים כדי להפריד בין שרירים שומן ולחשוף את קנה הנשימה (איור 4 א). אתר מקביל ריצת העורק הראשי לקנה הנשימה (איור 4).
- להשתמש בזהירות במלקחיים כדי fascia הנפרד מעל העורק (איור 4C). קל למשוך את העצב התועה מלבד התרדמה, והכנס את מלקחיים לתוך החלל שביניהם. מלקחיים בעדינות פתוחים כדי ליצור פער בfascia, ומושכים בזהירות את העצב מהעורק, מהמזלג בעורק ליד הגרון (הקצה הקדמי), עד (אחורי) ככל האפשר (לפחות 3 מ"מ) ( 4D איור).
- לסלק כל מחדשfascia הנותר עד העורק הוא מבודד היטב (איור 4E). הוסף טיפה של תמיסת מלח לאזור הניתוח מדי פעם כדי לשמור על רקמה לחה, ולכן פחות שביר ופחות נוטה לקריעה באופן אקראי.
- מיקום תפר והכנת עורק להכנסת קטטר (איורים 4, 5).
- שימוש במלקחיים כדי למשוך ממנו חוט תפר משי תחת העורק. לקשור קשר מאובטח לסגור את העורק ככל כיוון הקדמי ככל האפשר (איור 4F).
- למשוך ממנו חוט שני בעורק. לקשור קשר לשליפה כדי לסגור באופן זמני את העורק ככל כיוון האחורי ככל האפשר (איור 4F).
- למשוך ממנו חוט שלישי תחת העורק. לקשור קשר רופף מאוד בין שני התפרים הראשונים, שישמש כדי לאבטח במהירות את הקטטר לאחר המיקום (איור 4G).
- החזק קצות כל תפרי מהדרך על ידי הרטבתם עם קצת 70% אתנול.
- עם התפר, לתפוס את הקשר נמוך יותר כדי למשוך את העורק מעט מתוח. ניק העורק מעל, אבל קרוב מאוד ל, התפר הקדמי (איור 4H). היזהר שלא לחתוך עמוק מדי, אבל לבדוק את החריץ לוודא הפתיחה היא בלא הפרעה.
- הסר קטטר מלא הפרין ממחט מזרק, מנסה להימנע מיצירת כיסים גדולים של אוויר בשני קצותיו. מניפולציות קטטר למצב הטיה בזווית נוחה, בדרך כלל כלפי מטה, ומעט ימינה (לימין handers).
- בעודו מחזיקים בתפר כדי לשמור על העורק שנותר מעט מתוח, בעדינות להכניס קטטר לתוך חריץ (איור 4I). השתמש במלקחיים כדי להחזיק את התפר הקדמי ומושך החוצה את העורק מעל קטטר (דוחף את יתר על המידה עם הצנתר עלול לגרום לסוף המשופע לנקב את העורק). זהירות לשחרר את תפר קטטר וקדמי.
- לאבטח את הצנתר על ידי הידוק הקשר של תפר האמצע, קרוב לכניסה של הצנתר לתוך העורק. הפוך קשר משולש הדוק, אבל כדי להיות בטוח שלא למשוך כל כך חזק כמו לחסום את הזרימה דרך קטטר. נוסף לאבטח את הצנתר על ידי קשירה אותו עם התפר הקדמי, מתחת לכניסה לעורק.
- צרף להוביל המלוחים לקטטר באמצעות תקע המחבר, שוב מנסה למנוע החדרת בועות אוויר לתוך הקו.
- לתפוס את הקצוות של התפר האחורי ומשוך בעדינות כדי לשחרר את הקשר. לתמרן את התפר כלפי מטה את העורק, על הקצה של הצנתר (לא להסיר את החוט). דם צריך לזרום לקטטר; אם אין זרימת דם, בעדינות לכשכש קטטר לינסה להסיר את המועקה.
- כאשר הזרימה מופיעה בלא הפרעה, להשתמש בחוט האחרון (מהתפר האחורי) כדי לקשור קשר נוסף, מעט מעל אמצע התפר.
- עם מלקחיים בכל יד, להשתמש בזוג אחד של מלקחיים להחזיק בקטטר ממש מתחת לתפר הקדמי, ועם אחרים, לחץ שריטה לקטטר כך בקלות תוטה לצד. חזור על פעולה כדי ליצור שריטה שנייה. זה מאפשר את הקצה החופשי של קטטר להיות משך לכיוון חלק האחורי של ראשו של העכבר, מבלי לאלץ את קצה הצנתר להפוך רוחבי על הקיר של העורק.
- הפך את העכבר על הצד שלה (משמאל), שמירה על חרטומו ממוקם מעל הפה והאף, ולנקות את אזור החתך עם 70% אתנול ו povidone- יוד. לעשות חתך קטן (כ -4 מ"מ) מתחת ומאחורי אוזן ימין. שימוש במלקחיים כדי להחזיק את הדש הפתוח של עור, תוך כדי העבודה הבדיקה החלולה הבוטה מתחת לעור כדי ליצור ערוץ דרך הלחי, אל החלל בצוואר. מומלץ להביא את הבדיקה סביב בלוטת הרוק, במקום לנסות ללכת בין הבלוטה ואת העור. שימוש במלקחיים כדי לשחרר את מרחב לבדיקה כדי לצאת בזהירות.
- חוט תקע / קטטר נמל באמצעות בדיקה כדי לצאת בצוואר. אל תמשכו חזק מדי; להיות בטוח קטטר לא ריסוק או הצרת כלי דם או איברים.
- נהל משכך כאבים אקטואליים לחתך בחזה, וקרוב פצע עם משי או סיכות.
- הסר עכבר מן ההרדמה, ולאפשר לבעלי חיים להתאושש בנקי, חימם חלל (כלוב מקום בחלק העליון של כרית חימוםאו תחת מנורת חום), לפחות 30 דקות.
3. עירוי
- הכן aliquots של 5 מ"ג / מיליליטר פתרון של פקליטקסל / מתנול.
- מדוד 50 מ"ג של פקליטקסל לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. להוסיף 10 מיליליטר של מתנול סטרילי. צינור כובע. לסובב ביד או על שייקר מסתובב בטמפרטורת חדר עד האבקה נמס.
- Aliquot 500 μl של פתרון לתוך צינורות בטוחים 20 קטן, מקפיא, ולאחסן ב -20 ° C.
- aliquot הפשרה בודד בטמפרטורת חדר או באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, מייד לפני העירוי.
- הכן את משאבת העירוי (איור 6).
- לחתוך באורך של צינורות פוליאתילן בסך של כ 40 סנטימטר ארוך. צרף מחט קהה בקצה אחד, ויציאת מחבר לאחר.
- צייר את התרופה לתוך מזרק עם פנימי בקוטר ידוע (רוב המשאבות לתכנות תדרוש הקוטר של חבית המזרק, על מנת לחשב את המהירות של הזרוע משאבת ה). צרף את המחט למזרק ולטעון את התרופה דרך המחט והצינורות.
- מקם את המזרק לתוך המשאבה על פי הוראות היצרן. ראש המשאבה כך שהתרופה זורמת בצורה חלקה את תקע המחבר, והוא מוכן לעירוי.
- צרף עכבר כדי לשאוב.
- החזק את העכבר יציב ולהשתמש בhemostat כדי לצבוט קטטר, קרוב לתקע היציאה. הסר תקע ולהחליף עם המחבר המצורף למזרק והצינורות.
הערה: דם עשוי להתחיל לזרום בחזרה דרך צינורות. - במהירות לנהל משאבה מהר כדי לנקות את עוצמת הקול של הצנתר (מחושב באופן אמפירי באמצעות התבוננות הנפח של 6 סנטימטר של צינורות), מייד לאחר מכן לעבור לקצב העירוי הרצוי.
- החזק את העכבר יציב ולהשתמש בhemostat כדי לצבוט קטטר, קרוב לתקע היציאה. הסר תקע ולהחליף עם המחבר המצורף למזרק והצינורות.
- המשך עירוי פקליטקסל למהלך זמן של שלוש שעות.
- צג צינורות מדי פעם כדי לבדוק אם קיים דליפה בצמתים כמו זה הוא לעתים קרובות סימן לחסימה בזרימה לעכבר.צפה בעכבר לתגובות צפויות או בלתי צפויות לעירוי (עייפות או היפראקטיביות, סימנים של אי נוחות).
- בהתאם לאורך והאופי של העירוי, העכבר לא יכול לאכול או לשתות, אבל כדי להיות בטוח כדי לספק גישה למזון ומים בהתאם למדיניות שנקבעה במוסד. להיות מודע לפוטנציאל של התייבשות העכבר דרך אוסף של כמויות גדולות של דם.
- תמשיך לשמור על חם כלוב עם כרית חימום או מנורה, אלא אם העכבר נראה רוצה להתרחק מהחום. אם בעל חיים לא הורדם בתוך מספר שעות לאחר ניתוח, ליישם תכנית לטיפול שאחרי ניתוח של בעלי חיים, ובכלל זה תנאים סטריליים דיור וטיפול בכאב לאחר ניתוח.
- להשגיח מקרוב על העכבר, במיוחד בכמה דקות הראשונות, כדי להבטיח שהיא לא לשלוף את צינורות דרך היפראקטיביות, או גירוי מצינורות (שעשוי להיות סימן של הכנסת עניים). אם העכבר אינו על-אקטיבי בקרת תהליך, קבועטבעת לא עשויה להיות נחוצה, אבל לבדוק את העכבר באופן שיגרתי כדי לוודא שבעלי החיים לא להסתבך בצינור. מערכת לקשור רתמת והם זמינים באופן מסחרי, אך השימוש בם הוא מעבר להיקף של פרוטוקול זה.
- איסוף דגימות.
- לאסוף דגימות דם במרווחי זמן קבועים על ידי דימומי submandibular או רטרו מסלולית (אם הפרוטוקול שלך לא עושה שימוש במודלים של גידול החלב, לשקול אוסף של דם באמצעות צנתר הצוואר הוכנס באותו הזמן כמו קטטר התרדמה). היזהר שלא למשוך את קו העירוי. אם איסוף על ידי דימומי רטרו מסלולית, קל להרדים את העכבר עם הרדמה שאיפה (למשל methoxyflurane) כך שאף אחד לא צריך לתפוס בעורפו כדי לאבטח את העכבר.
- ספין דם בצנטריפוגה hemocrit להפריד תאי דם מפלזמה. השתמש בעט קובץ או יהלומים-קצה להבקיע צינור בפנייה של ההפרדה פאזות. לשבור צינור ולאסוף פלזמה בלבד, לתוך צינור קטן, מקפיא-בטוח. אחסן ב--80 מעלות צלזיוס עד לניתוח.
הערה: אם צנטריפוגה hemocrit אינה זמינה, להעביר דגימת דם לתוך צינור מיקרו צנטריפוגות, וספין במייקרו צנטריפוגות במהירות גבוהה כדי להפריד בין תאי דם מפלזמה. לאסוף פלזמה לתוך צינור שני, ולאחסן ב -80 ° C. - להרדים עכבר על ידי CO 2 מחנק. לאסוף רקמה (כ 20-50 מ"ג) מאיברים של עניין ובזק הקפאה בחנקן נוזלי. חנות ב -80 ° C עד ניתוח.
ניתוח 4. לדוגמא
הערה: כל דוגמאות לפרוטוקול זה נותח באמצעות מעבדה מחוץ על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה הנוזלית-טנדם מסה (LC - MS / MS), אשר חישבו את ריכוזי פקליטקסל כדלקמן:
- לחלץ פקליטקסל מדגימות. Homogenize דגימת רקמה ב0.1% חומצה אצטית, מתנול 50% לפני המיצוי. לחלץ פקליטקסל על ידי מיצוי נוזלי / נוזל, באמצעות אתר טרט-בוטיל ברומיד (MTBE) מועשר ברמה האנלוגית פנימי (docetaxel). הסר MTBE ודגימות יבשות. Resuspend ב -50 אצטוניטריל%, 0.1% תמיסת חומצה אצטית.
- הכנת תקני כיול. להוסיף ריכוז ידוע של פקליטקסל לנכס C57BL / 6 מטריצה להשיג טווח סופי של סטנדרטים (בין 1 ל 20,000 / מיליליטר ng עבור דגימות פלזמה, בין 0.1 ל 5,000 ng / ml לדגימות רקמה). לחלץ סטנדרטים בשני עותקים, באותה השיטה כמו לדגימות המחקר לעיל. למדוד שיא פקליטקסל בדגימות על ידי HPLC / MS / MS ניצול יינון electrospray.
- חישוב ריכוז באמצעות יחס השטח של פקליטקסל לתקן פנימי. השתמש בסטנדרטים לכיול כדי ליצור עקומה סטנדרטית, ודגימות מחקר אינטרפולציה על ידי התאמה על העקומה. לנרמל ריכוז של דגימות מחקר של משקל התחלה של מדגם לפני הומוגניזציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפצת פקליטקסל כדלקמן דפוסים צפויים במשטר מינון 3 שעות של עירוי במהירות גבוהה 15 דקות, ואחרי עירוי במהירות נמוכה 165 דקות.
איור 1 מציג השוואה של ריכוזי וריד הצוואר-עירוי פקליטקסל הפלזמה ועורק-חליטות התרדמה. ריכוזי פקליטקסל לרדת במהירות בדקות הראשונות שלאחר 15 עירוי בנפח גבוה ראשוני, ולאחר מכן להתמתן על דקות 150 הבאות. לשם השוואה, רמות פקליטקסל בעירוי עני להתחיל נמוך יחסית, ומרחפות למעלה ולמטה לאורך assay. זה היה ככל הנראה נגרם על ידי חסימה בקו הראשון בעירוי. רשומות של assay להראות. היה העכבר קטן ללא תגובה חיצונית לעירוי, מאמת את הרעיון של ממשל נחותים של תרופת איור 2 מראה רמות יחסי של פקליטקסל בכבד וברקמת המוח, כמו גם פלזמה דם, בסוף עירוי 3 שעות.
jove_content "FO: לשמור על-together.within עמודים =" תמיד ">
איור 1:. Curves רמות פקליטקסל פלזמה בתרדמה וחליטות הצוואר מייצג ריכוזי פקליטקסל פלזמה בעכברים בודדים. כל עכבר קיבל עירוי-פאזית, בהיקף של מהירות גבוהה ראשונית, 15 עירוי דקות של 0.42 מ"ג / קילוגרם / דקה, ומייד אחריו במהירות נמוכה, 165 עירוי דקות של 0.021mg / קילוגרם / דקה. השטח מתחת לעקומה (AUC) לעירוי התרדמה היה כ 59 מיקרוגרם / מיליליטר ∙ דקות לעומת AUC עירוי הצוואר של כ 37 מיקרוגרם / מיליליטר ∙ דקות. זמן מחצית החיים של פקליטקסל מחושב מהעקומות שנוצרו עבור עירוי התרדמה היו 10 דקות ועירוי הצוואר היה 11 דקות. עירוי התרדמה תערוכות בערך רמות שווה ערך של ריכוז תרופה בהשוואה לעירוי הצוואר. ריכוזים רציפים נמוכים, או ריכוזים שמחזור למעלה ולמטה, לעתים קרובות represent עירוי עני.
איור 2:. ריכוז פקליטקסל על ידי רקמה מייד לאחר עירוי 3 שעות פקליטקסל ואוסף של דגימת הדם שעברה, העכבר היה מורדמים, ודגימות כבד ורקמת המוח נאספו. רמות ריכוז פקליטקסל בפלזמה וברקמות נרכשו על ידי ניתוח מסה-מפרט. נתונים אלה מייצגים דגימות שנאספו מתרדמת העירוי-העכבר באיור 1.
איור 3: אבזרי כירורגי. () ייצור צנתר: משיכה צנתרים אלה של ממשיך את הוצאות מהותיות, ובמקביל לאפשר מחדשמחפש לגודל וצורה של צנתר לגיל עכבר וגודל להתאים (ב) הכנת לפני ניתוח:. שלושה (3) תפרי משי, כ 8 סנטימטרים כל אחת; תקע נמל סטרילי; מזרק מלוח ועופרת; צנתר, מחובר למזרק הפרין.
איור 4: הכנת עורק התרדמה והחדרת קטטר. (א) חותך דרך עור, לזוז הצידה בלוטות ולהשתמש במלקחיים כדי נפרד גס שומן לחשוף שרירים. (ב) שימוש במלקחיים בעדינות שרירים נפרדים לחשוף צד ימין של קנה הנשימה. העורק הראשי יהיה גלוי כגדול, כלי עבי חומה, פועל במקביל לקנה נשימה. (ג) fascia הפסקה סביב עורק. (ד) עצב התועה נפרד מעורק הראשי. (E) המשך להסיר fascia עד carotiד מבודד לחלוטין לאורך החלל. קשר תפר (F) קבוע בגפיים קדמי, ואת קשר להחליק בגפיים האחוריים. (G) תפר שלישי הוא מושחל תחת התרדמה ומאוד קשר בקשר חלש. עורקים (H) הוא חתוכות מעל התפר קדמי. ( I) הכנס קטטר לתוך ניק בעורק. תפוס את התפר קדמי עם מלקחיים כדי למשוך עורק מעל קטטר. (J) קטטר מאובטח בעורק הראשי בכל שלושת תפרים.
איור 5:.. מיקום תפר ייצוג סכמטי של אתר כירורגית לפני ואחרי קטטר התקנה מתכתב עם צילום איור 4G, עם התוספת של ניק בעורק, כמו באיור 4H.
איור 6:. סכמטי של עירוי הגדרת מזרק מלא בסמים, ותרים עם מחט קהה. קו פוליאתילן מייחס מזרק לקטטר התרדמה. משאבה דוחסת לאט מזרק, כדי לספק מינון אחיד ישירות לתוך זרם הדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עירוי בעורק התרדמה הוא טכניקה משמעותית במחקר זה של הפרמקוקינטיקה פקליטקסל. עירוי בעורק התרדמה הוא שיטה להפצה במהירות בסמים לאורך מערכת הדם 14. עירוי שעה 3 הוא קרוב יותר חקיין של ממשל הקליני של תרופות כגון taxanes מאשר זריקות בולוס. הניתוח יכול להתבצע באופן אמין על ידי אדם אחד, זמן ניתוח הוא קצר יחסית, ואחוזי הצלחה> 75%. לאחר דגימות שנאספו, הם חייבים להיות מנותחים על ידי השיטות המתאימות. אנחנו השתמשנו ספקטרומטר מסה כדי לקבוע את ריכוז פקליטקסל בדגימות פלזמה ורקמות. כדי לאמת את הטכניקה הזו עוד יותר, שלחנו דגימות דם ורקמה למעבדה עצמאית לניתוח. נתונים אלה היו להתוות כעקומות ריכוז בודדות פלזמה פקליטקסל עבור כל חיה שנבדקה (איור 1), וההפצה של פקליטקסל הושוותה ברקמות שונות (איור 2). בכל מקרה, זה important לשקול את השיטה הטובה ביותר כדי לנתח הפצת סמים ו / או חילוף חומרים, בהתאם למערכת של עניין הסמים ו. אפשרויות אחרות למדידה של תרופות שונות עשויות לכלול HPLC-UV או immunoassays 2.
שני גורמים עיקריים חיוניים לצנתור עורק תרדמה מוצלח הם גם צנתרים מיושנים ובידוד עורק מעולה. עיצוב צנתרים בהתאם לגודל של מודל העכבר הוא בעל חשיבות עליונה. אם קוטר הצנתר עבה מדי, הכנסה לתוך העורק תהיה קשה יתר על המידה, ואילו צנתר דק מדי יהיה קשה יותר לאבטח ועלול לסתום לפני או במהלך עירוי. גם הזווית והחדות של קצה הצנתר חייבת להיות בטווח בינוני; טיפ שהוא חד מדי עלול לנקב את קיר העורק, ואילו קצה שהוא משעמם מדי יהיה קשה להכניס לתוך העורק. המדידות הניתנות כאן נגזרו באמצעות עכברי C57BL / 6-י עשרה שבועות בן, כ 20 גרמו, כתבנית מודל. מדידות חייבות להיות מדורגותלמעלה או למטה באופן אמפירי כדי שיתאים לדגמים בודדים.
בידוד של עורק התרדמה חייב להיות תהליך עדין, מכוון, כדי למנוע נזק מיותר לרקמות ולמניעת דימום בקנה מידה גדולה. תת עורי שומן בדרך כלל ניתן להפריד בקלות עם נמוך למלקחיים חדים בינוניים. רקמת שריר מעל הצוואר צריכה להיות מופרדת עם מדיום לקנוס שקצהו מלקחיים לאורך ההטיה של סיבי השריר. אם פער נרחב יותר יש צורך, הטכנאי חייב להיות מאוד זהיר, כדי למנוע פקיעת כלי דם קטנים. ברגע שהצוואר גלוי, עדיין יהיה סכום הוגן של fascia שצריך מרטו מהעורק עם מלקחיים קנס היטה. לבסוף, העצב התועה חייב להיות מופרד מהעורק הראשי ללא נזק או. כאשר עורק התרדמה מבודדת כראוי, זה צריך להיות אפשרי להכניס את המלקחיים מתחת, עם חלל ריק משני הצדדים של העורק (ראה איור 4E).
כאשר Trouחליטות עניות ירי ble, יתחילו בסקירה של ההוראות המופיעה על המשאבה כדי להיות בטוח שהחוקר כבר מתוכנת המשאבה כדי לספק את המינון הצפוי כראוי. ואז, לשקול בזהירות לשנות את הנפח שיהיה מציגה לבעלי חי המבחן. הדילול של תרופה חייב להיות מחושב כך שמינון הנפח מתאים: הנפח לא חייב להיות גדול מדי עבור בעלי החיים לסבול, ובאופן אידיאלי לא משפיעים על לחץ דם באופן משמעותי; עדיין הנפח חייב להיות גדול מספיק למשאבה כדי לספק באופן אמין, ותיצור זרימה קבועה, כדי למנוע סתימות בצמתים. אם הכפכפים הפכו עניין שבשגרה, לשקול ברצינות מעבר למד קטן מחט (בקוטר גדול יותר) וצינורות. יתר על כן, אם התוכן של תרופה בפלזמה לא מגיע לרמות צפויות, החוקר צריך לבדוק את העכברים אחרי מותו כדי לקבוע אם הצנתר נשאר במקום טוב בעורק וחופשי זורם, ולשנות את הצורה / הגודל של צנתר בהתאם לצורך.
UsefulnESS של שיטה זו עשויה להיות מוגבל על ידי גורמים כגון הגודל ומצב בריאותו הכללית של הנושא, ואורך המיועד של זמן של העירוי. הניתוח והעירוי יכולים overtax נושא המצוקה כבר. גם בבעלי חיים בריאים, קטטר בעורק התרדמה הוא רק מתאים לחליטות טווח קצרות, כמה בדרך כלל שעות עד מספר ימים. חשבתי מה שיטות של שיכוך כאבים יהיה בשימוש אם עכברים להראות סימנים של חוסר נוחות בתגובה לעירוי התרופה, כגון בקשות חוזרות ונשנות של הרדמה מקומית לפצוע אתרים, או משככי כאבים מערכתיים מנע. זה יהיה הכרחי כדי לקבל כל העבודה בבעלי החיים אושרה על ידי הארגון המקומי לבעלי החיים רגולציה או IACUC, כדי להשיג את ההרשאות המתאימות לביצוע הליך זה. אם יש צורך יש לי עירוי יותר, או כדי לקבל את העכבר לשרוד העירוי לתקופה ארוכה של זמן, שיטות עירוי חלופיות חייבים להיחקר.
לאחר שהזלפות עורק הראשי שולטים במחקרשל הפרמקוקינטיקה של פקליטקסל, בכוונתנו להשתמש בטכניקה זו בעתיד כדי לחקור את ההשפעות של סמים אחרים, ומאפנני Abcc10 בC57BL / 6-י והעכברים FVB, והמודלים של עכברים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות למתקן FCCC בעלי החיים במעבדה על תמיכתם בפרויקט זה. אנו מודים וולף מעבדות, Inc על עזרת בניתוח רמות פקליטקסל בפלזמה וברקמות. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מעניקה K01CA120091 לEHB, וCA06927 פוקס צ'ייס במרכז הסרטן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene tubing 0.024” OD X 0.011” ID | Braintree Scientific, Inc. | PE10 | |
| 3 Blunted needles (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | NB-30 | |
| Stainless steel port plug (28 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | PP-28 | Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal. |
| 2 Stainless steel connector plugs (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | C-30 | |
| Three 1 cc syringes | Becton, Dickinson and Co. | 309659 | |
| Sterile 0.9% Saline solution | Hospira | 0409-7984-37 | |
| Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution | Braintree Scientific, Inc. | HGS | |
| Silk suture | Braintree Scientific, Inc. | SUT-S 113 | |
| Vanna Scissors (micro-scissors) | World Precision Instruments | 14122 | This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well. |
| Hartman Mesquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 501705 | |
| Betadine Swabsticks | Perdue Products L.P. | BSWS1S | |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1160-01 | May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia. |
| Paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Micro Capillary Tube Sealant | Fisher Scientific | 02-678 | |
| C57BL/6J mice | Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred | ||
| API 4000 Q-Trap mass spetrometer | Applied Biosystems |
References
- Gallo, J. M., Li, S., Guo, P., Ma Reed, K., J, The Effect of P-Glycoprotein on Paclitaxel Brain and Brain Tumor Distribution in Mice. Cancer Research. 63 (16), 5114-5117 (2003).
- Sonnichen, D. S., Relling, M. V.
- Gianni, L., et al. Nonlinear Pharmacokinetics and Metabolism of Paclitaxel and Its Pharmacokinetic / Pharmacodynamic Relationship in Humans. Journal Clinical Oncology. 13 (1), 180-190 (1995).
- Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. Nonlinear Pharmacokinetics of Paclitaxel in Mice Results from the Pharmaceutical Vehicle Cremophor EL. Cancer Research. 56 (9), 2112-2115 (1996).
- Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. Determination of paclitaxel and metabolites in mouse plasma, tissues, urine and faeces by semi-automated reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 664, 383-391 (1995).
- Bradshaw-Peirce, E. L., Eckhardt, S. G., Gustafson, D. L. A Physiologically Based Pharmacokinetic Model of Docetaxel Disposition: from Mouse to Man. Clinical Cancer Research. 13, 2768-2778 (2007).
- Eiseman, J. L., et al. Plasma Pharmacokinetics and Tissue Distribution of Paclitaxel in CD2F1 Mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 34 (6), 465-471 (1994).
- Schinkel, A. H., et al. Normal Viability and Altered Pharmacokinetics in Mice Lacking mdr1-type (drug-transporting) P-glycoproteins. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 4028-4033 (1997).
- Fraser, I. J., Dear, G. J., Plumb, R., L’Affineur, M., Fraser, D., Skippen, A. J. The Use of Capillary High Performance Liquid Chromatography with Electrospray Mass Spectrometry for the Analysis of Small Volume Blood Samples from Serially Bled Mice to Determine the Pharmacokinetics of Early Discovery Compounds. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 13 (23), 2366-2375 (1999).
- Bateman, K. P., et al. Reduction of Animal Usage by Serial Bleeding of Mice for Pharmacokinetic Studies: Application of Robotic Sample Preparation and Fast Liquid Chromatography – Mass Spectrometry. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 754 (1), 245-251 (2001).
- Berndt, K., Vogel, J., Buehler, C., Vogt, P., Born, W., Fuchs, B. A new method for repeated drug infusion into the femoral artery of mice. J. Am. Assoc. Lab Animal Sci. 51 (6), 825-831 (2012).
- Fergusson, G., Ethier, M., Zarrouki, B., Fontés, G., Poitout, V. A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat. J. Vis. Exp. (78), (2013).
