Halspulsådern Tinkturer för farmakokinetiska och farmakodynamiska Analys av taxaner i möss

Summary

Denna metod har utvecklats med målet att leverera en jämn läkemedelslösning via halspulsådern, för att utvärdera farmakokinetiken för nya läkemedel i musmodeller.

Abstract

När som föreslår att ett läkemedel, läkemedelskombination, eller läkemedelstillförsel till ett nytt system, måste man bedöma farmakokinetiken av läkemedlet i studien modellen. Eftersom användningen av musmodeller är ofta ett viktigt steg i preklinisk läkemedelsforskning och läkemedelsutveckling ^1-8, är det nödvändigt att utforma ett system för att införa läkemedel i möss i en enhetlig, reproducerbart sätt. Helst ska systemet tillåta insamling av blodprover med jämna mellanrum under en viss tid kurs. Möjligheten att mäta läkemedelskoncentrationer av masspektrometri har tillåtit forskare att följa förändringar i plasmaläkemedelsnivåer över tid i enskilda möss ^{1, 9, 10.} I denna studie var paklitaxel infördes i transgena möss som en kontinuerlig arteriell infusion under tre timmar, medan blodprover samtidigt tas av retro-orbital blödningar vid inställda tidpunkter. Karotidartären infusioner är ett potentiellt alternativ till halsvenen infusioner, när sådana faktorer sombrösttumörer eller andra hinder gör hals infusioner opraktiskt. Med denna teknik paklitaxelkoncentrationer i plasma och vävnader uppnått liknande nivåer jämfört med jugular infusion. I den här guiden kommer vi att visa hur man framgångsrikt ANVÄNDA KATETER halspulsådern genom att förbereda en optimerad kateter för individen musmodell, sedan visa hur du sätter och säkra katetern i musen halspulsådern, trä änden av katetern ut genom baksidan av musens hals och haka musen till en pump för att leverera en kontrollerad hastighet av läkemedels tillströmning. Flera låg volym retro-orbital blödningar möjliggör analys av plasmakoncentrationerna av läkemedlet över tiden.

Introduction

Infusion av läkemedel via carotid kan utföras på ett tillförlitligt och reproducerbart sätt genom att optimera utrustning och teknik. Förfarandet är inte invecklat, men det kräver bra kontroll och känsla för detaljer. Överlägsen omsorg och skicklighet behövs för att isolera halspulsådern och föra in katetern, som i allmänhet kan förvärvas genom praktik. Kirurgi av en erfaren tekniker bör inte överstiga en timme. Efter en framgångsrik operation, bör musen förefaller normal och frisk (även om musen kan reagera på den färdiga läkemedelsinfusion), och läkemedlet (-en) kan administreras i en kontrollerad, likformig kontinuerlig dosering. Blodprov tas från ett annat land än halspulsådern site; retro-orbital blödningar varit lätt att samla in och tillfredsställande för analys av läkemedelskoncentrationer.

Katetrar av optimal storlek och form är en ovärderlig tillgång för att utföra en framgångsrik infusion ^11. Vi hittade katetrar tillgängliga commercially ofta för att vara för stor och / eller för flexibla för att möjliggöra bekväm tillgång till musen halspulsådern. Det visade sig vara att föredra framför mode katetrar från polyeten slangen används för att ansluta musen till infusionsspruta. Således, alla slangar, kopplingar och nålar var av konsekventa dimensioner, vilket förenklade infusionsaggregat. Med användning av denna teknik, är det inte nödvändigt att trycka spetsen av katetern in i artären förbi den punkt där det fortfarande är synliga, och blodflödet till karotidartären återställs inte förrän efter det att katetern är initialt fastsatt. Detta minskar riskerna med punktering av artären eller av att ha katetern tryckas ut av det höga trycket av blodflödet. Kateter designen häri inte införlivar en "bump" för att hålla den på plats, så att säkra katetern väl med suturer och kirurgisk tejp är en prioritet.

Infusioner kan vara föredraget att de gemensamma iv bolusinjektioner, som ett bättre härma av klinisk administrering avläkemedel såsom taxaner ^{3, 12, 13.} Den teknik som beskrivs här utvecklades ursprungligen för att möjliggöra infusion i musmodeller vari tillträde till jugular eller femoralvenen var uteslutna från brösttumörtillväxt och / eller överdriven vaskularisering av införingsområdet. Denna metod kan ofta vara lämpligt även i tumörfria möss: även isolera och catheterizing halspulsådern är något mer invasiv, fann vi det lämpligt att våldsam attack, eftersom benägenheten hos våldsam attack väggen för att rippa medfört fler misslyckade insättningar och misslyckanden för att slutföra den 3 hr tidsförloppet.

Medan resultaten som visas här är från C57BL / 6J (in-house-uppfödda) möss, har vi använt denna teknik för att framgångsrikt ingjuta paklitaxel i flera stammar av möss, inklusive FVB och blandade-stammar, för att följa farmakokinetiken i musmodeller transgenically manipulerade att nedreglera cellulära transportörfunktioner. De blod- och vävnadsprover uppsamlade uppvisade förväntade nivåer av paclitaxel, i intervallet de nivåer som rådde efter hals infusioner ^1. Denna teknik kan förväntas fungera lika bra i andra musmodeller samt med andra infusionsvätskor.

Protocol

Detta protokoll har godkänts av Fox Chase Cancer Center Institutional Animal Care och användning kommittén och av Laboratory Animal Facility, och befunnits vara i överensstämmelse med de institutionella riktlinjer för human behandling av djur.

1. Inledande Framställning

1. Framställning av kateter: Förbered en kateter från en kort längd av polyetenslang, modifieras till att bilda en förtunnad, trubbiga änden (figur 3A). Göra flera katetrar i förväg och spara på obestämd tid.
   1. Tänd en bunsenbrännare, och justera för att upprätta en låg stadig låga. Håll Lang nära eld för att mjuka polyeten. När slangen börjar smälta, långsamt dra isär de två ändarna för att skapa en förtunnad sektion av röret, ca 0,25 mm OD.
   2. Skär en avfasad ände ca 0,75 cm längs tunna avsnitt. Detta säkerställer tillräckligt slang för att fästas i artär, utan att skapa en alltför lång kateter.
      OBS: En lång tunn ände på the kateter har en benägenhet att täppa. En alltför långa änden kan också hålla tillräckligt med vätska för att påtagligt förändra kateterns vätskekapacitet volym.
   3. Trubbig den fasade änden genom att passera snabbt genom lågan - när det är rätt uppvärmd, blir lätt rundade och förstorade slutet. Spets krokar tillbaka något, vilket bidrar förankra slangen samtidigt som du sätter in i artären.
   4. Klipp slangen 6,0 cm från den punkt där det börjar tunna. Detta gör en mycket hanterbart kateter, som är tillräckligt lång för att trä igenom för att lämna halsen och att hålla och arbeta med bekvämt, men tillräckligt kort för att hindra musen från att gnaga på överflödigt slang eller kräver för mycket extra infusionsvolym för att rensa initial saltlösning .
   5. Förbered en spruta på cirka 0,2 ml heparinlösning, toppad med en trubbig nål. För in nålen i den breda änden av katetern (Figur 3B). Fyll katetern med heparin, var noga med att se till att det inte finns några bubblor islangen. Ställ heparin sprutan och katetern åt sidan på ett sterilt område. Sterilisera katetrar med gammastrålning, genom att placera katetern (er) i en petriskål, och exponering för 20 Gy av y-bestrålning. Om du inte har tillgång till en gammastrålningskälla, kontrollera med din djuranläggning för att undersöka andra sätt att sterilisering, såsom gas- eller kemikalie-sterilisering. Autoklavera inte, såsom polyeten inte kan värmesteriliseras.
2. Skapande av en saltlösning bly (figur 3B).
   1. Förbered en andra spruta av ca 0,5 ml steril koksaltlösning, var noga med att säkerställa en bubbelfri linje.
   2. Skär en andra slang, ca 15 cm, och glida ut på trubbiga sprutnålen. Fäst en anslutningsport till den fria änden av slangen.
   3. Testa att flödet av saltlösning är fri genom att smidigt föra en liten volym saltlösning genom ledningen. Använd denna saltlösning matchens katetrar, för att kontrollera flödet genomkatetern, och för att spola den linje av blod. Ställ salt sprutan åt sidan på ett sterilt område.
3. Före kirurgi, sterilisera utrustning genom autoklavering, eller alternativt genom gassterilisering eller glaspärla sterilisering.
4. Bereda sterila kirurgiska området.
   1. Torka bänk och mikroskop ytor med desinfektionsmedel såsom 70% etanol eller klordioxid. Täck bänk och mikroskopbasen med en ren engångs, absorberande dyna.
   2. Förbered en kirurgisk styrelse genom att täcka med två lager av ren, absorberande papper, säkert fästa med tejp.
5. Lägg ut alla kirurgiska leveranser (som katalogiserats i materiallistan) så att de är lätt åtkomliga.
   1. Skär tre längder av steril sutur, 8 cm vardera, och ställ åt sidan med andra förnödenheter. Placera en hamn där det kommer att vara lätt tillgänglig (figur 3B).

2. Kirurgi

1. Beredning av djur
   1. Anesthetize musen genom exponering för 2-3% isofluran i anestesi kammare ansluten till precisions förångaren. Dra upp musen från kammaren, och raka håret från musens nacke / övre delen av bålen, och under höger öra (platsen för kateter exit). Administrera veterinär vaselin oftalmologiska salva till ögonen för att förhindra torrhet under narkos. Se till att djuret inte vakna under kirurgiska preparat genom att låta musen tillräcklig tid inhalationskammare innan prep (minst två minuter), eller genom att administrera isofluran till musen med hjälp av en noskon under prep. Återgå musen för anestesi kammare.
   2. När musen är tillräckligt inert, flytta till sterila operationsområdet, placera anestesi noskon över musen näsa och mun, och avleda flödet av isofluran till noskon. Bekräfta korrekt anesthetization genom att klämma tassen med pincett; när musen visar ingen reaktion, gå vidare till nästa steg.
   3. Placera musen på rygg, med huvudet vänt motutredare. Säkra öronen, fram tassar och hind-tassar till kirurgiskt styrelse med tejp eller annan hållande anordning för att hålla musen stadigt. Rengör snitt område med povidon-jod och 70% etanol.
2. Isolering av karotidartären
   1. Gör en 1 cm längsgående skurna något till höger om mittlinjen av halsen. Använd pincett för att separera fett och muskler för att exponera luftstrupen (Figur 4A). Lokalisera karotidartären löper parallellt med luftstrupen (Figur 4B).
   2. Använd försiktigt pincett till separat fascia liggande artären (Figur 4C). Lätt dra vagusnerven bortsett från carotis och sätt pincett in i utrymmet mellan. Försiktigt öppna pincett för att skapa en lucka i fascia, och dra försiktigt bort nerven från artären, från gaffeln i artären nära struphuvudet (främre änden), uppåt (bakre) så långt som möjligt (minst 3 mm) ( Figur 4D).
   3. Rensa bort allt reresterande fascia tills artären är väl isolerade (Figur 4E). Lägg en droppe saltlösning för operationen området ibland för att hålla vävnaden fuktig, och därmed mindre sprött och mindre benägna att riva slumpmässigt.
3. Sutur placering och artär förberedelse för katetrar (figurerna 4, 5).
   1. Använd pincett för att dra en silkesutur tråden under artären. Knyt därefter en ordentlig knut att stänga artären så långt in mot den främre som möjligt (Figur 4F).
   2. Rita en andra tråden under artären. Knyt en infällbar knut att tillfälligt stänga artären så långt in mot den bakre som möjligt (Figur 4F).
   3. Rita en tredje tråden under artären. Binda en mycket lös knut mellan de första två suturer, för att användas för att snabbt fästa katetern efter placering (Figur 4G).
   4. Hålla ändarna hos alla suturer ur vägen genom att väta dem med en bit av 70% etanol.
4. Med suturen, ta tag i nedre knut att dra artären något spänd. Nick artären ovan, men mycket nära, den främre suturen (Figur 4H). Var noga med att inte skära för djupt, men kontrollera skåran och se till att öppningen är fri.
5. Ta heparin fylld kateter från sprutnål, försöker undvika att skapa stora luftfickor i vardera änden. Manipulera katetern att placera avfasning på en bekväm vinkel, generellt nedåt, och lite till höger (för högerhänta).
6. Håll till suturen för att hålla artären kvar något spänd, för försiktigt in katetern i slitsen (figur 4I). Använd pincett för att hålla den främre sutur och dra artären ner över kateter (driver upp överdrivet med katetern kan orsaka den avfasade änden att punktera artären). Släpp försiktigt katetern och främre sutur.

Säkrande av katetern och initiering av blodflöde (Figurerna 4J, 5B).

1. Säkra katetern genom att dra åt knut av mitten sutur, nära ingången av katetern in i artären. Gör en stram trippel knut, men tänk på att inte dra så hårt att de hindrar flödet genom katetern. Ytterligare säkra katetern genom att binda den med den främre sutur, nedanför ingången till artären.
2. Fäst saltlösning ledningen till katetern med hjälp av förbindelseproppen, återigen försöker att undvika att införa luftbubblor i ledningen.
3. Ta tag i ändarna på den bakre sutur och dra försiktigt för att lossa knuten. Manöver suturen ned artären, över änden av katetern (ta inte bort tråden). Blod ska flyta in i katetern; om det inte finns något blodflöde, försiktigt vicka kateter för att försöka avlägsna förträngningen.
4. När flödet verkar obehindrat, använd den sista tråden (från bakre sutur) för att knyta ytterligare en knut, något över mitten suturen.

Temporary tätning av katetern. Spola katetern av blod, sedan använda en peang för att spänna fast änden av katetern nära kontakten. Ta bort kontakt och ersätta det med portplugg för att täta änden av katetern, och ta bort hemostat.

Omplacering kateter för att lämna bak i nacken.

1. Med pincett i varje hand, använd en pincett för att hålla fast vid katetern strax under främre sutur, och med den andra, tryck på en knut i katetern så att den lätt kommer att böjas åt sidan. Upprepa för att skapa en andra kink. Detta tillåter den fria änden av katetern att dras mot baksidan av musens huvud, utan att tvinga spetsen av katetern för att slå i sidled mot väggen av artären.
2. Vänd på musen på dess (vänster) sidan, att hålla noskonen placerad över munnen och näsan, och rengör snitt område med 70% etanol och povidon-jod. Göra ett litet snitt (ungefär 4 mm) nedanför och bakom höger öra. Använd pincett för att hålla öppna flik av hud, samtidigt som du arbetar den trubbiga ihåliga sond under huden för att skapa en kanal genom kinden, till hålrummet i nacken. Det är lämpligt att ta med sonden runt spottkörteln, istället för att försöka gå mellan körteln och huden. Använd pincett för att försiktigt frigöra ett utrymme för sonden att avsluta.
3. Tråd port plugg / kateter genom sond för att avsluta i nacken. Dra inte för hårt; vara säker på att katetern inte krossning eller bromsande blodkärl eller organ.

Nedläggning och återhämtning. Administrera lokalsmärtstillande (t.ex. bupivakain) till skulder snitt, och täcka såret med vattentäta, kirurgisk tejp. Applicera ett andra bit tejp för att ytterligare säkra katetern.

1. Administrera lokalsmärtstillande till bröstet snitt, och nära såret med silke eller häftklamrar.
2. Ta bort musen från anestesi, och låt djuret att återhämta sig i en ren, uppvärmd plats (plats bur ovanpå en värmedynaeller under en värmelampa), i minst 30 minuter.

3. Infusion

1. Förbered alikvoter av 5 mg / ml lösning av paklitaxel / metanol.
   1. Mät 50 mg av paclitaxel i en 15 ml centrifugrör. Tillsätt 10 ml steril metanol. Kapsylröret. Rotera för hand eller på en roterande skakanordning vid rumstemperatur tills pulvret är upplöst.
   2. Alikvot 500 pl lösning i 20 små, frys säkra rör och förvara vid -20 ° C.
   3. Tö individuell alikvot vid rumstemperatur eller i 37 ° C vattenbad, omedelbart före infusion.
2. Förbereda infusionspumpen (Figur 6).
   1. Skär en lång längd av polyeten slang på ca 40 cm. Bifoga ett trubbigt nål till ena änden och en koppling till den andra.
   2. Upprätta läkemedel i en spruta med en känd innerdiameter (de flesta programmerbara pumpar kräver diameter sprutcylindern, för att beräkna hastigheten på the pumparmen). Sätt fast nålen på sprutan och ladda läkemedlet genom nålen och slangen.
   3. Placera sprutan i pumpen enligt tillverkarens anvisningar. Fylla pumpen så att läkemedlet flödar jämnt ut kontaktstiftet, och den är klar för infusion.
3. Fäst musen för att pumpa.
   1. Håll musen stadigt och använd hemostat att klämma kateter, nära hamnen pluggen. Ta bort pluggen och ersätt med kontakten ansluten till sprutan och slangen.
      OBSERVERA: Blod kan börja strömma tillbaka genom slangen.
   2. Snabbt administrera en snabb pump för att tömma volymen av katetern (beräknad empiriskt genom att observera volymen av 6 cm av slangen), sedan omedelbart växla till den önskade infusionshastighet.
4. Fortsätt Paclitaxel infusion under tre timmars tidsförlopp.
   1. Övervaka slangen ibland för att leta efter läckor i korsningar eftersom detta är ofta ett tecken på en blockering i flödet till musen.Titta på musen för förväntade eller oväntade reaktioner på infusionen (letargi eller hyperaktivitet, tecken på obehag).
   2. Beroende på längd och typ av infusion, kan det hända att musen inte äta eller dricka, men tänk på att ge tillgång till mat och vatten enligt institutets fastställd policy. Var medveten om risken för dehydratisering av musen genom insamling av stora mängder blod.
   3. Fortsätt att hålla buren varm med en värmedyna eller lampa, om inte musen tycks vilja att hålla sig borta från värmen. Om djuret inte avlivas inom flera timmar efter operationen, genomföra planen för postkirurgisk behandling av djur, inklusive sterila bostadsförhållanden och behandling för postoperativ smärta.
   4. Håll ett vakande öga på musen, speciellt i första några minuter, för att säkerställa att det inte dra ut slangen genom hyperaktivitet eller irritation från slangen (som kan vara ett tecken på en dålig insättning). Om musen inte är över-aktiva, konstant monitoringen kanske inte nödvändigt, men kontrollera musen rutinmässigt för att vara säker på att djuret inte trassla i slangen. Sele och tjuder systemet är kommersiellt tillgängliga, men deras användning är utanför ramen för detta protokoll.
5. Insamling av prover.
   1. Samla blodprov med jämna mellanrum submandibulära eller retro-orbital blödningar (Om protokollet inte utnyttjar av brösttumörmodeller, överväga insamling av blod via en jugular kateter samtidigt som hals kateter). Var noga med att inte dra i infusionsslang. Om uppsamling genom retro-orbital blödningar, lätt söva musen med ett inhalationsanestetikum (t.ex. metoxifluran) så man behöver inte ta tag i nackskinnet för att säkra musen.
   2. Spin blod i hemocrit centrifugen för att separera blodceller från plasma. Använd en fil eller diamantpenna att göra mål rör vid ansiktet på fasseparation. Bryt röret och bara samla plasma, i små, frys säker slang. Lagra vid -80 ° C fram till analys.
      OBS: Om en hemocrit centrifug inte är tillgänglig, överföra blodprovet in i mikro-centrifugrör, och snurra i en mikrocentrifug vid hög hastighet för att separera blodceller från plasma. Samla plasma till ett andra rör, och förvara vid -80 ° C.
   3. Euthanize musen genom CO ₂ kvävning. Samla vävnad (ca 20-50 mg) från organ av intresse och flash frysa i flytande kväve. Förvara vid -80 ° C fram till analys.

4. Provanalys

NOTERA: Alla prover för detta protokoll analyserades genom en utanför laboratoriet genom vätskekromatografi-tandem-masspektrometri (LC - MS / MS), som beräknas de paclitaxel-koncentrationer enligt följande:

1. Utdrag paklitaxel från prover. Homogenisera provet vävnad i 0,1% ättiksyra, 50% metanol före extraktion. Extrahera paclitaxel genom vätske / vätske-extraktion, med användning av metyl-tert-butyleter (MTBE) som berikats med en intern analog (docetaxel) -standarden. Ta bort MTBE och torra prover. Resuspendera i 50% acetonitril, 0,1% ättiksyralösning.
2. Förbered kalibreringsstandarder. Lägga till en känd koncentration av paklitaxel till lämpliga C57BL / 6 matris för att erhålla ett slutligt intervall av standarder (från 1 till 20000 ng / ml för plasmaprover, från 0,1 till 5000 ng / ml för vävnadsprover). Utdrag normer i två exemplar med samma metod som för studieproverna ovan. Mät paklitaxel topp i prover av HPLC / MS / MS använder elektrosprayjonisering.
3. Beräkna koncentrationen med användning av förhållandet av paklitaxel område till intern standard. Använd kalibreringsstandarder för att skapa en standardkurva, och interpolerade studieprover genom passning på kurvan. Normalisera koncentration av studieprover från startvikt på provet före homogenisering.

Representative Results

Paclitaxel fördelning följer förutsägbara mönster under en 3 h dosering på en 15 min höghastighets infusion, följt av en 165 minuter låg hastighet infusion.

Figur 1 visar en jämförelse av halsvenen-infusionsplasma paklitaxelkoncentrationer och halspulsådern-infusioner. De paklitaxelkoncentrationer tappar snabbt i den första 15 min efter en initial hög volym infusion, och sedan plana ut under de närmaste 150 min. Som jämförelse paclitaxel-nivåer i en dålig infusion börjar relativt låg, och sväva upp och ner genom hela analysen. Detta var troligen orsakas av en blockering i ledningen tidigt i infusion. Rekord av analysen visar musen hade lite att ingen yttre reaktion mot infusionen, bekräftar idén om en sämre administration av läkemedel. Figur 2 visar relativa nivåer av paclitaxel i lever och hjärnvävnad, liksom blodplasma, i slutet av den 3 h infusion.

jove_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 1:. Plasma paklitaxel nivåer under halspulsådern och hals infusioner Kurvor representerar plasma paklitaxelkoncentrationer i enskilda möss. Varje mus erhöll en bifasisk infusion, som består av en initial hög hastighet, 15 min infusion av 0,42 mg / kg / minut, omedelbart följt av en låg hastighet, 165 min infusion av 0.021mg / kg / min. Arean under kurvan (AUC) för carotid infusion var cirka 59 mikrogram / ml ∙ min kontra en AUC för jugular infusion av cirka 37 ng / ml ∙ min. Halveringstiden av paklitaxel beräknas utifrån kurvorna genereras för hals infusion var 10 minuter och för jugular infusion var 11 min. Carotid infusion visar ungefär likvärdiga nivåer av läkemedelskoncentration jämfört med jugular infusion. Kontinuerliga låga koncentrationer eller koncentrationer som cykla upp och ner, ofta represent en dålig infusion.

Figur 2:. Paclitaxel koncentration genom vävnad Omedelbart efter 3 timmar paklitaxel infusion och insamling av det sista blodprovet, var musen avlivas, och lever och hjärna vävnadsprov togs. Paclitaxel koncentrationsnivåer i plasma och vävnader förvärvades av mass-spec-analys. Dessa data representerar prover som samlats från Carotid Infusion-mus i figur 1.

Figur 3: Kirurgisk grejor. (A) Kateter Produktion: Dra de egna katetrar håller ner materialkostnader, samtidigt som reSearcher att skräddarsy storleken och formen på kateter till mus ålder och storlek (B) Förbered före kirurgi. Tre (3) silkessuturer, ca 8 cm vardera; Steril pluggen; Saline spruta och bly; Kateter, knuten till heparinspruta.

Figur 4: Framställning av halsartären och kateter införing. (A) Skär igenom huden, flytta undan körtlar och använda pincett för att grovt separat fett att exponera muskler. (B) Använd pincett för att försiktigt separata muskler att exponera höger sida av luftstrupen. Halspulsådern blir synlig som störst, tjockväggiga fartyg, som löper parallellt med luftstrupen. (C) Break fascia runt artär. (D) Separat vagusnerven från halspulsådern. (E) Fortsätt att ta bort fascia tills carotid är helt isolerade längs hålrum. (F) Suture permanent knut i främre änden och slip knut i bakre änden. (G) Tredje sutur är gängad i halspulsådern och mycket löst knutna. (H) Artery är hack precis ovanför främre sutur. ( I) Infoga kateter i nick i artären. Greppa främre sutur med pincett för att dra artär ner över kateter. (J) Secure kateter i halspulsådern med alla tre suturer.

Figur 5:.. Suture placering Schematisk representation av operationsområdet före och efter kateterinstallation A motsvarar med fotografi fig 4G, med tillägg av en nick i artären, såsom i figur 4H. Figur 4J.

Figur 6:. Schematisk bild av infusion set-up Sprutan fylls med läkemedel, och utjämnade med en trubbig nål. Polyeten linjen fäster spruta till halspulsådern kateter. Pump komprimerar långsamt spruta, för att leverera jämn dosering direkt i blodomloppet.

Discussion

Karotidartären infusion är en betydande teknik i denna studie av farmakokinetiken paklitaxel. Karotidartären infusion är en metod för att snabbt fördela läkemedlet genom hela cirkulationssystemet ^14. Den 3 h infusion är en närmare härma klinisk administrering av läkemedel såsom taxaner än bolusinjektioner. Operationen tillförlitligt kan utföras av en enda person, är kirurgi tiden relativt kort, och svarsfrekvens är> 75%. Efter prover samlas in måste de analyseras med lämpliga metoder. Vi använde masspektrometri för att bestämma paklitaxel-koncentrationen i plasma och vävnadsprover. För att ytterligare validera denna teknik, skickade vi blod- och vävnadsprover till en oberoende labb för analys. Dessa data avsattes som individuella plasma paklitaxel koncentrationskurvor för varje djur som testats (Figur 1), och fördelningen av paclitaxel jämfördes i olika vävnader (figur 2). I varje fall är det imtigt att överväga den bästa metoden för att analysera distributionen och / eller metabolism läkemedel, beroende på läkemedel och systemet av intresse. Andra alternativ för mätning av olika droger kan inkludera HPLC-UV eller immun ^2.

Två primära faktorer som är avgörande för en framgångsrik hals kateterisering är väl gammaldags katetrar och överlägsen artär isolering. Fashioning katetrar enligt storleken av musmodellen är av största vikt. Om katetern diametern är för tjock, kommer att föras in i artären vara alltför svår, medan en alltför tunn kateter kommer att bli svårare att säkerställa och benägna att täppa före eller under infusionen. Vinkeln och skärpan av kateterspetsen måste också vara i ett måttligt intervall; ett tips som är för kraftig kan punktera artärväggen, medan ett tips som är för tråkig kommer att vara svårt att sätta in i artären. De mått som anges här erhölls med användning av tio veckor gamla C57BL / 6J möss, ca 20 g, som en modell mall. Mätningar måste skalasupp eller ner empiriskt för att passa individuella modeller.

Isolering av halspulsådern måste vara en känslig, avsiktlig process för att undvika onödig skada på vävnad och för att förhindra storskaliga blödning. Subkutant fett kan i allmänhet lätt separeras med lågt till medel skarpa pincett. Muskelvävnad över halspulsådern bör avskiljas med medium till fin spets tång längs diagonalen av muskelfibrer. Om en mer omfattande gapet är nödvändigt, måste teknikern vara mycket noga med att undvika att sprängas sönder små blodkärl. När halspulsådern är synlig, kommer det fortfarande att finnas en hel del fascia som måste tweezed bort från artären med fin spets pincett. Slutligen måste vagusnerven separeras från karotidartären utan skada på endera. När hals är ordentligt isolerat, bör det vara möjligt att placera tången under, med ett tomt utrymme på vardera sidan av den artären (se fig 4E).

När troubara skytte dålig infusioner, börja med att gå igenom instruktionerna på pumpen för att vara säker på att utredaren har rätt programmerad pumpen att leverera den förväntade dosen. Sedan, noga överväga att ändra volym som kommer att införa i försöksdjuret. Utspädningen av läkemedel ska beräknas så att doseringsvolymen är lämpligt: ​​volymen får inte vara för stor för djuret att tolerera, och helst inte i väsentlig grad påverka blodtrycket; men volymen måste vara tillräckligt stor för pumpen att leverera tillförlitligt, och kommer att skapa ett jämnt flöde för att undvika träskor vid korsningar. Om träskor blivit en vanlig företeelse, överväga att byta till en mindre gauge (större diameter) nål och slang. Vidare, om plasmaläkemedelshalten inte når förväntad nivå, bör forskaren kontrollera mössen efter slakt för att avgöra om katetern förblir välplacerad i artären och fritt flytande, och ändra form / storlek på kateter vid behov.

Den usefulness med denna metod kan begränsas av sådana faktorer som storlek och allmänna hälsa i ämnet, och den avsedda tidslängd av infusionen. Operationen och infusionen kan överbelasta en redan bekymrad ämne. Även i ett friskt djur, är endast lämpligt för kortsiktiga infusioner, vanligen flera timmar till flera dagar karotidartären kateter. Tänk på vad metoder för smärtlindring ska användas om möss visar tecken på obehag som svar på läkemedelsinfusion, till exempel upprepade applikationer av lokal anestesi att lindade webbplatser eller förebyggande system analgetika. Det kommer att bli nödvändigt att ha alla animaliska arbete har godkänts av den lokala djur tillsynsmyndighet eller IACUC, för att erhålla tillstånd att utföra den här proceduren. Om det är nödvändigt att ha en längre infusion eller så att musens överleva infusion under en längre tidsperiod, måste alternativa infusionsmetoder utforskas.

Efter att ha bemästrat halspulsådern perfusioner i studienav farmakokinetiken av paklitaxel, planerar vi att använda den här tekniken i framtiden för att undersöka effekterna av andra droger, och Abcc10 modulatorer i C57BL / 6J och FVB möss, och andra musmodeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene tubing 0.024” OD X 0.011” ID	Braintree Scientific, Inc.	PE10
3 Blunted needles (30 gauge)	Braintree Scientific, Inc.	NB-30
Stainless steel port plug (28 gauge)	Braintree Scientific, Inc.	PP-28	Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal.
2 Stainless steel connector plugs (30 gauge)	Braintree Scientific, Inc.	C-30
Three 1 cc syringes	Becton, Dickinson and Co.	309659
Sterile 0.9% Saline solution	Hospira	0409-7984-37
Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution	Braintree Scientific, Inc.	HGS
Silk suture	Braintree Scientific, Inc.	SUT-S 113
Vanna Scissors (micro-scissors)	World Precision Instruments	14122	This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well.
Hartman Mesquito Hemostatic Forceps	World Precision Instruments	501705
Betadine Swabsticks	Perdue Products L.P.	BSWS1S
Bupivacaine	Hospira	0409-1160-01	May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia.
Paclitaxel	LC Laboratories	P-9600
Methanol	Sigma-Aldrich	32213
Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized	Fisher Scientific	22-362-566
Micro Capillary Tube Sealant	Fisher Scientific	02-678
C57BL/6J mice	Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred
API 4000 Q-Trap mass spetrometer	Applied Biosystems