Halspulsåren infusioner farmakokinetisk og farmakodynamisk analyse af Taxaner i mus

Summary

Denne metode blev udviklet med det formål at levere en konstant medikamentopløsning via halspulsåren at vurdere farmakokinetik nye lægemidler i musemodeller.

Abstract

Når foreslår anvendelsen af ​​et lægemiddel, lægemiddelkombination, eller medikament ind i et nyt system skal man vurdere farmakokinetikken af ​​medikamentet i undersøgelsen model. Da anvendelsen af musemodeller er ofte et afgørende skridt i præklinisk lægemiddelforskning og -udvikling lægemiddel ^1-8, er det nødvendigt at designe et system til at indføre lægemidler ind mus i en uniform, reproducerbar måde. Ideelt set skal systemet gøre det muligt at indsamling af blodprøver med jævne mellemrum over et sæt tidsforløb. Evnen til at måle medikamentkoncentrationer af massespektrometri, har tilladt forskere til at følge ændringerne i plasma lægemiddelniveauer over tid i individuelle mus ^{1, 9, 10.} I denne undersøgelse blev paclitaxel indføres i transgene mus som en kontinuerlig arteriel infusion over tre timer, mens blodprøver samtidig blev taget af retro-orbital blødninger ved indstillede tidspunkter. Halspulsåre infusioner er et potentielt alternativ til halsvene infusioner, hvor faktorer såsombrysttumorer eller andre forhindringer gøre jugularis infusioner upraktisk. Med denne teknik paclitaxelkoncentrationer i plasma og væv opnået tilsvarende niveauer i forhold til jugular infusion. I denne øvelse vil vi vise, hvordan man med held selvkaterisation halspulsåren ved fremstilling af en optimeret kateter for den enkelte musemodel derefter viser hvordan at indsætte og fastgøre kateteret i musen halspulsåre tråd enden af ​​kateteret ud gennem bagsiden af musens hals, og krog musen til en pumpe til at levere en kontrolleret hastighed af lægemiddel tilstrømning. Flere lav volumen retro-orbital blødninger mulighed for analyse af plasmakoncentration over tid.

Introduction

Drug infusion gennem carotis kan udføres pålideligt og reproducerbart ved at optimere udstyr og teknik. Proceduren er ikke indviklet, men det kræver fin kontrol og opmærksomhed på detaljer. Superior pleje og smidighed er nødvendige for at isolere halspulsåren og indsætning af kateteret, som generelt kan erhverves gennem praksis. Kirurgi af en erfaren tekniker må ikke overstige en time. Efter vellykket operation bør mus synes normal og sund (selvom mus kan reagere på den faktiske infusionen) og lægemiddel (r) kan administreres på en kontrolleret, ensartet kontinuerlig dosering. Blodprøver skal tages fra et andet sted end halspulsåren stedet; retro-orbital blødninger været nemt at indsamle og tilfredsstillende for analyse af stofkoncentrationer.

Katetre af optimal størrelse og form er et uvurderligt aktiv i at udføre et vellykket infusion ^11. Vi fandt katetre tilgængelige commercially ofte at være for stor og / eller for fleksibel for at tillade nem adgang til musen halspulsåre. Det viste sig at foretrække frem for mode katetre fra polyethylen slange, der anvendes til at tilslutte musen til infusion sprøjten. Derfor er alle de slanger, stik og nåle var af konsistente dimensioner, som forenklede infusion forsamling. Med denne teknik er det ikke nødvendigt at skubbe spidsen af ​​katetret ind i arterien forbi det punkt, hvor det er stadig synlig, og blodstrømmen til carotidarterie ikke gendannet indtil efter kateteret er oprindeligt sikret. Dette reducerer farerne ved punktering af arterien eller have kateteret skubbes ud af det høje tryk i blodstrømmen. Kateteret design heri ikke omfatter et "bump" for at holde det på plads, så sikre kateteret godt med suturer og kirurgisk tape er en prioritet.

Infusioner kan være at foretrække til de fælles iv bolusinjektioner, som bedre efterligner klinisk administration aflægemidler, såsom taxaner ^{3, 12, 13.} Den her beskrevne teknik blev oprindeligt udviklet for at tillade infusion i musemodeller, hvor adgang til jugularis eller vena femoralis blev udelukket ved brysttumor vækst og / eller overdreven vaskularisering af insertion område. Denne metode kan ofte være hensigtsmæssigt selv i tumor-fri mus: Selv om isolering og catheterizing carotis er lidt mere invasive, fandt vi det at foretrække frem for jugularis, fordi tilbøjelighed jugularis væg til RIP resulteret i flere fejlslagne indsættelser og fiaskoer at fuldføre 3 hr tidsforløbet.

Mens resultaterne er vist her er fra C57BL / 6J (in-house-opdrættet) mus, har vi brugt denne teknik med succes indgyde paclitaxel i flere stammer af mus, herunder FVB og mixed-stammerne, at følge farmakokinetik i musemodeller transgent manipulerede nedregulere cellulære transporter funktioner. Blod og vævsprøver indsamlet, viste de forventede niveauer af paclitaxel, i intervallet niveauerne efter jugularis infusioner ^1. Denne teknik kan forventes at arbejde lige så godt i andre musemodeller og med andre infusionsvæsker.

Protocol

Denne protokol er blevet godkendt af Fox Chase Cancer Center Institutional Animal Care og brug Udvalg og af laboratoriet Animal Facility, og fundet at være i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for human behandling af dyr.

1. Indledende Fremstilling

1. Fremstilling af kateteret: Forbered et kateter fra en kort længde af polyethylenrør, modificeret til at danne en fortyndet, afstumpet ende (figur 3A). Foretag flere katetre på forhånd og spare på ubestemt tid.
   1. Tænde en bunsenbrænder, og justere for at etablere en lav konstant flamme. Hold slangen tæt på flamme blødgøre polyethylen. Når slangen begynder at smelte, langsomt trække fra hinanden de to ender for at skabe en indsnævrede sektion af slangen, ca. 0,25 mm OD.
   2. Skær en affaset ende ca. 0,75 cm langs tynd sektion. Dette sikrer tilstrækkelig rør at blive fastgjort i arterie uden at skabe en for lang kateter.
      BEMÆRK: En lang tynd ende på the kateter har en tilbøjelighed til at tilstoppe. En alt for lange ende kan også holde tilstrækkelig væske til at ændre væsentligt på kateterets væskevolumen kapacitet.
   3. Sløve affasede ende ved at passere hurtigt gennem flammen - når ordentligt opvarmet, bliver en anelse afrundet og udvidet i slutningen. Spidsen kroge lidt tilbage, som hjælper med at forankre slangen under indsættelse ind i arterien.
   4. Skær slangen 6,0 cm fra det punkt, hvor det begynder at tynde. Dette gør en meget overskuelige kateter, der er lang nok til at tråde igennem til exit fra halsen og til at holde og arbejde med komfortabelt, men kort nok til at forhindre musen fra gnave på overskydende slanger eller kræver for meget ekstra infusion volumen at rydde indledende saltvand .
   5. Forbered en sprøjte med ca. 0,2 ml heparin løsning, toppet med en stump nål. Stik nålen ind i den brede ende af kateteret (figur 3B). Fyld kateter med heparin, være omhyggelig med at sikre, at der ikke er bobler islangen. Indstil heparin sprøjte og kateter til side på et sterilt område. Sterilisere katetre ved gamma-bestråling, ved at placere kateteret (r) i en petriskål, og eksponering for 20 Gy gamma-bestråling. Hvis du ikke har adgang til en gamma-stråling kilde, tjekke med din dyr facilitet til at undersøge andre former for sterilisering, såsom gas- eller kemisk-sterilisering. Må ikke autoklaveres, polyethylen ikke kan varme steriliseres.
2. Oprettelse af en saltopløsning bly (figur 3B).
   1. Forbered en anden sprøjte på ca. 0,5 ml sterilt saltvand, være omhyggelig med at sikre en boble-fri linje.
   2. Skær et andet stykke slange, ca. 15 cm, og glide på den stumpe kanyle. Vedhæft et stik port til den frie ende af slangen.
   3. Test at strømmen af ​​saltvand er uhindret ved glat fremføring af en lille mængde af saltvand gennem føringen. Brug denne saltvand føringen kateteret, at flowet gennemkateteret, og til at skylle den linje af blod. Indstil saltvand sprøjten til side på et sterilt område.
3. Før kirurgi, sterilisere udstyr ved autoklavering, eller alternativt ved gassterilisering eller glasperle sterilisering.
4. Forbered sterile kirurgiske område.
   1. Tør bænk og mikroskop overflader med desinfektionsmiddel såsom 70% ethanol eller chlordioxid. Dæk bænk og mikroskop base med en ren engangsemballage, absorberende pude.
   2. Forbered en kirurgisk bord ved at dække med to lag ren, absorberende papir, forsvarligt fastgjort med tape.
5. Læg alle kirurgiske forsyninger (som katalogiseret i Materials List), så de er let tilgængelige.
   1. Skær tre længder af steril sutur, 8 cm hver, og der er afsat med andre forsyninger. Placer en havn, hvor det vil være let tilgængelige (figur 3B).

2. Kirurgi

1. Fremstilling af dyr
   1. Anesthetize mus ved udsættelse for 2-3% isofluran i anæstesi kammer tilsluttet præcision vaporizer. Trække musen fra kammeret, og barbere hår fra musens nakke / øvre torso, og under højre øre (stedet for kateter exit). Administrer veterinær vaseline oftalmologiske salve til øjnene for at forhindre tørhed, mens under anæstesi. Sikre dyret ikke vække under kirurgiske præparater ved at tillade mus tilstrækkelig tid i inhalationskammer før prep (mindst to min), eller ved indgivelse af isofluran til mus ved hjælp af en næse kegle under prep. Retur musen til anæstesi kammer.
   2. Når musen er tilstrækkeligt inert, flytte til sterile kirurgiske område, skal du placere anæstesi næse kegle over musens næse og mund, og aflede strømmen af ​​isofluran til næse kegle. Bekræft ordentlig bedøvelse ved at knibe pote med en pincet; når musen viser ingen reaktion fortsætte til næste trin.
   3. Anbring musen på ryggen, med hovedet vender modinvestigator. Fastgør ørerne, Forpoterne og hind-poter til kirurgisk bord med tape eller en anden fastholdelsesanordning at holde musen stabil. Rengør indsnit med povidon-iod og 70% ethanol.
2. Isolering af halspulsåren
   1. Lav en 1 cm langsgående snit lidt til højre for midterlinjen af ​​halsen. Pincet til at adskille fedt og muskel at blotlægge trachea (figur 4A). Find halspulsåren løber parallelt med trachea (figur 4B).
   2. Anvende omhyggeligt pincet til separat fascia overliggende arterien (figur 4C). Let trække vagus nerve bortset fra carotis og indsætte pincet ind i rummet mellem. Forsigtigt åbne pincet til at skabe et hul i fascia, og træk forsigtigt væk nerven fra arterien, fra gaflen i arterien nær strubehovedet (forreste ende), op (posterior) så vidt muligt (mindst 3 mm) ( figur 4D).
   3. Rydde enhver reresterende fascia indtil arterien er godt isoleret (figur 4E). En dråbe saltvand til operationen område undertiden at holde væv fugtig, og dermed mindre skør og mindre tilbøjelig til at rive tilfældigt.
3. Suturanlæggelse og forberedelse arterie for kateteret (figur 4, 5).
   1. Brug pincet til at trække en silkesutur tråden under arterien. Binde en sikker knude til at lukke arterien så langt mod den forreste som muligt (Figur 4F).
   2. Tegn en anden tråd under arterien. Binde en knude tilbagetrækkelig til midlertidigt at lukke arterien så langt mod den bageste som muligt (Figur 4F).
   3. Tegn en tredje tråd under arterien. Binde en meget løs knude mellem de to første suturer, der skal bruges til hurtigt at fastgøre kateteret efter placering (figur 4G).
   4. Hold ender af alle suturer ud af vejen ved at fugte dem lidt af 70% ethanol med.
4. Med suturen, tag fat i nederste knude til at trække arterien lidt stramt. Nick ovennævnte arterie, men meget tæt på den forreste sutur (Figur 4H). Vær forsigtig med ikke at skære for dybt, men tjek i slidsen for at sørge for, at åbningen er uhindret.
5. Fjern heparin fyldt kateter fra sprøjtenål, forsøger at undgå at skabe store lommer af luft i hver ende. Manipulere kateteret at placere facet på en behagelig vinkel, generelt nedadgående, og lidt til højre (for højrehåndede).
6. Mens du holder på suturen for at holde arterien resterende lidt stram, forsigtigt indsætte kateter i slidsen (Figur 4I). Brug pincet til at holde den forreste suturen og trække arterien ned over kateter (presser alt med kateteret kan forårsage den affasede ende at punktere arterien). Slip forsigtigt kateteret og forreste sutur.

Sikring af kateteret og indledningen af ​​blodgennemstrømning (Tallene 4J, 5B).

1. Fastgør kateteret ved at stramme knude af den midterste sutur, tæt på indgangen af ​​kateteret ind i arterien. Lav en stram tredobbelt knude, men vær sikker på ikke at trække så stram som at hindre strømning gennem kateteret. Yderligere at sikre kateteret ved at binde det med den forreste sutur under indgangen til arterien.
2. Fastgør saltvand fører til kateteret ved hjælp af stikket, igen forsøger at undgå at der dannes luftbobler i slangen.
3. Gribe enderne af den bageste sutur og træk forsigtigt at frigøre knude. Manøvre suturen ned arterien, over enden af ​​kateteret (fjern ikke tråden). Blod skal flyde ind i katetret; hvis der ikke er blodgennemstrømning, vrikke forsigtigt kateter for at forsøge at fjerne indsnævringen.
4. Når flow forekommer uhindret bruge den sidste tråd (fra den bageste sutur) for at binde en ekstra knude, lidt over den midterste sutur.

Temporary forsegling af kateteret. Skyl kateteret i blod, derefter bruge en hæmostat at klemme ende af kateteret tæt på stikket. Fjern stikket og erstatte den med proppen til at lukke enden af ​​kateteret, og fjern arterieklemmen.

Repositionering kateter for at afslutte fra bagsiden af ​​halsen.

1. Med en pincet i hver hånd, bruge en tang til at holde på kateteret lige under den forreste sutur, og med den anden, skal du trykke et knæk ind i kateteret, så den nemt vil bøje til siden. Gentag for at oprette et andet knæk. Dette tillader den frie ende af kateteret til at blive trukket mod bagsiden af ​​musen hoved, uden at tvinge spidsen af ​​katetret til at vende sideværts mod væggen af ​​arterien.
2. Vend musen på dens (venstre) side, holde næsekeglen placeret over munden og næsen, og rengør indsnit med 70% ethanol og povidon-iod. Lave et lille snit (ca. 4 mm) under og bag det højre øre. Brug pincet til at holde den åbne flap i huden, mens du arbejder den stumpe hule probe under huden for at skabe en kanal gennem kinden, til hulrummet ved halsen. Det er tilrådeligt at bringe sonden omkring spytkirtel, i stedet for at forsøge at gå mellem kirtlen og huden. Brug pincet til forsigtigt at frigøre plads til sonden for at afslutte.
3. Tråd port stik / kateteret gennem sonde for at afslutte i halsen. Træk ikke for hårdt; være sikker på at kateteret ikke knusning eller snærende blodkar eller organer.

Lukning og nyttiggørelse. Administrer aktuel smertestillende (f.eks bupivacain) til skulder indsnit, og dække såret med vand-bevis, kirurgisk tape. Påfør et andet stykke tape for yderligere at sikre kateteret.

1. Administrer aktuel smertestillende til bryst indsnit, og tæt sår med silke eller hæfteklammer.
2. Fjern musen fra anæstesi, og tillade dyret kan komme i en ren, opvarmet rum (plads bur oven på en varmepudeeller under en varmelampe), i mindst 30 minutter.

3. Infusion

1. Der forberedes delprøver på 5 mg / opløsning af paclitaxel / methanol ml.
   1. Mål 50 mg paclitaxel i et 15 ml centrifugerør. Der tilsættes 10 ml steril methanol. Cap rør. Rotere i hånden eller på en roterende ryster ved stuetemperatur, indtil pulveret er opløst.
   2. Portion 500 pi opløsning i 20 små, fryser sikre rør, og opbevares ved -20 ° C.
   3. Tø enkelt prøve ved stuetemperatur eller i 37 ° C vandbad, umiddelbart før infusion.
2. Forbered infusionspumpe (figur 6).
   1. Skær en lang længde af polyethylen rør på ca. 40 cm. Vedhæft en afstumpet nål til den ene ende, og et stik port til den anden.
   2. Udarbejde lægemiddel i en sprøjte med en kendt indre diameter (de fleste programmerbare pumper vil kræve diameteren af ​​sprøjtecylinderen for at beregne hastigheden af ​​the pumpe arm). Fastgør nålen til sprøjten og indlæse lægemidlet gennem nålen og slange.
   3. Placere sprøjten ind i pumpen i henhold til producentens anvisninger. Prime pumpen, således at lægemidlet strømmer jævnt ud af stikket, og den er klar til infusion.
3. Vedhæfte musen til at pumpe.
   1. Hold musen stabil og bruge arterieklemmen at klemme kateter, tæt på havnen stik. Fjern proppen og erstatte med konnektoren fastgjort til sprøjten og slangen.
      BEMÆRK: Blood kan begynde at flyde tilbage gennem slangen.
   2. Hurtigt administrere en hurtig pumpe til at fjerne volumenet af kateteret (beregnet empirisk ved at observere mængden af ​​6 cm af rør), derefter straks skifte til den ønskede infusionshastighed.
4. Fortsæt Paclitaxel infusion for tre timers kursus.
   1. Overvåg slanger lejlighedsvis at kontrollere for utætheder i kryds, da dette er ofte et tegn på en blokering i strømmen til musen.Se musen for forventede eller uventede reaktioner til infusion (sløvhed eller hyperaktivitet, tegn på ubehag).
   2. Afhængigt af længden og karakteren af ​​infusionen, kan musen ikke spise eller drikke, men sørg for at give adgang til mad og vand i henhold til institutionens faste politik. Vær opmærksom på muligheden for at dehydrere musen gennem indsamling af store mængder blod.
   3. Fortsæt med at holde buret varm med en varmepude eller en lampe, medmindre musen ser ud til at ønske at holde sig væk fra varmen. Hvis dyret ikke er aflivet inden for flere timer efter operationen, gennemførelse af plan for post-kirurgisk behandling af dyr, herunder sterile opstaldningsforhold og behandling af post-operative smerter.
   4. Hold et vågent øje på musen, især i de første par minutter, for at sikre, at det ikke trækker ud slangen gennem hyperaktivitet eller irritation fra slangen (som kan være et tegn på en dårlig indsættelse). Hvis musen ikke er over-aktiv, konstant monitoring kan ikke være nødvendigt, men tjek musen rutinemæssigt at være sikker på at dyret ikke bliver viklet ind i slangen. Harness og tøjr systemet er kommercielt tilgængelige, men deres anvendelse er uden for rammerne af denne protokol.
5. Indsamling af prøver.
   1. Saml blodprøver med regelmæssige mellemrum ved submandibulære eller retro-orbital blødninger (Hvis din protokol ikke gør brug af brystkirtler tumormodeller, overveje indsamling af blod via et jugular kateter indsat på samme tid som carotis kateter). Vær forsigtig med ikke at trække på infusionsslange. Hvis indsamling af retro-orbital blødninger, let bedøver musen med en inhalationsanæstetikum (f.eks methoxyfluran), så behøver man ikke få af kraven for at fastgøre musen.
   2. Spin blod i hæmokrit centrifuge for at separere blodceller fra plasma. Brug en fil eller diamant-spids pen til at score rør ved ansigt på faseadskillelse. Break rør og indsamle plasma kun i små, fryser-safe rør. Opbevares ved -80 ° C indtil analyse.
      BEMÆRK: Hvis en hæmokrit centrifuge ikke er tilgængelig, overføre blodprøve i mikro-centrifuge rør, og centrifugering i en mikrocentrifuge ved høj hastighed at adskille blodlegemer fra plasma. Indsamle plasma i et andet rør, og opbevares ved -80 ° C.
   3. Aflive musen ved CO ₂ kvælning. Saml væv (20 - 50 mg) fra organer af interesse og flash fryse i flydende nitrogen. Opbevares ved -80 ° C indtil analyse.

4. Sample Analysis

BEMÆRK: Alle prøver til denne protokol blev analyseret gennem en ekstern laboratorium ved væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC - MS / MS), som beregnet paclitaxelkoncentrationer som følger:

1. Uddrag paclitaxel fra prøver. Vævsprøve homogeniseres i 0,1% eddikesyre, 50% methanol før ekstraktion. Uddrag paclitaxel ved væske / væske-ekstraktion ved anvendelse af methyl-tert-butylether (MTBE) beriget med en intern analog (docetaxel) standard. Fjerne MTBE og tørre prøver. Resuspender i 50% acetonitril, 0,1% eddikesyreopløsning.
2. Forbered kalibreringsstandarder. Tilsæt en kendt koncentration af paclitaxel til passende C57BL / 6 matrix for at opnå en endelig række standarder (fra 1 til 20.000 ng / ml for plasmaprøver fra 0,1 til 5.000 ng / ml for vævsprøver). Uddrag standarder i to eksemplarer ved anvendelse af den samme fremgangsmåde som for undersøgelsesprøverne ovenfor. Mål paclitaxel højdepunkt i prøver ved HPLC / MS / MS udnytte elektrosprayionisering.
3. Beregn koncentrationen ved hjælp af arealforhold på paclitaxel intern standard. Brug kalibreringsstandarder at skabe en standard kurve, og interpolerede undersøgelsesprøver ved fit på kurven. Normalisér koncentration af undersøgelsesprøver med startvægt på prøve før homogenisering.

Representative Results

Paclitaxel fordeling følger forudsigelige mønstre i løbet af en 3 timers doseringsregimen af ​​en 15 min infusion høj hastighed efterfulgt af en 165 minutters infusion lav hastighed.

Figur 1 viser en sammenligning af halsvene infusion plasma paclitaxelkoncentrationer og halspulsåre-infusioner. De paclitaxelkoncentrationer falde hurtigt i de første 15 minutter efter en indledende infusion høj lydstyrke, og derefter flade ud over de næste 150 min. Ved sammenligning paclitaxel niveauer i en dårlig infusion starte relativt lav, og svæve op og ned i hele assayet. Dette blev sandsynligvis forårsaget af en blokering i linjen tidligt i infusion. Registreringer af assayet viser musen havde lidt til ingen ekstern reaktion på infusion, der bekræfter idéen om en ringere administration af lægemiddel. Figur 2 viser de relative niveauer af paclitaxel i lever og hjernevæv samt blodplasma, ved udgangen af 3 hr infusion.

jove_content "FO: keep-together.within-page =" altid ">
Figur 1:. Plasma paclitaxel niveauer under carotis og jugularis infusioner Kurver repræsenterer plasma paclitaxelkoncentrationer i individuelle mus. Hver mus modtog en bifasisk infusion, bestående af et initialt høj hastighed, 15 min infusion af 0,42 mg / kg / min, umiddelbart efterfulgt af en lav hastighed, 165 min infusion af 0.021mg / kg / min. Arealet under kurven (AUC) for carotis infusion var ca. 59 ug / ml ∙ min versus AUC for jugular infusion af ca. 37 ug / ml ∙ min. Halveringstiden af ​​paclitaxel beregnes ud fra kurverne frembragt for carotis infusion var 10 min og for jugular infusion var 11 min. Carotis infusion viser nogenlunde samme niveau med lægemiddelkoncentration sammenlignet med jugularis infusion. Kontinuerlige lave koncentrationer eller koncentrationer, der cyklus op og ned, ofte represent en dårlig infusion.

Figur 2:. Paclitaxel koncentration af væv Umiddelbart efter 3 hr paclitaxel infusion og indsamling af den sidste blodprøve blev musen aflivet, og lever og hjerne vævsprøver blev indsamlet. Paclitaxel koncentrationsniveauer i plasma og væv blev erhvervet af masse-spec-analyse. Disse data repræsenterer prøver indsamlet fra carotis Infusion-Mouse i figur 1.

Figur 3: Kirurgisk habengut. (A) Kateter Produktion: Trække ens egne katetre holder ned materielle omkostninger, samtidig med at researcher at skræddersy størrelsen og formen af kateteret til mus alder og størrelse (B) Forbered før kirurgi:. Tre (3) silkesuturer, ca. 8 cm hver; Steril port stik; Saline sprøjte og bly; Kateter bundet til heparin sprøjte.

Figur 4: Fremstilling af halspulsåren og kateteret. (A) Skær gennem huden, flytte bort kirtler og bruge pincet til groft særskilt fedt at eksponere muskel. (B) Brug pincet til forsigtigt separat muskel til at eksponere højre side af luftrøret. Halspulsåren bliver synlige som største, tykvæggede fartøjer, der løber parallelt med luftrøret. (C) Break fascia omkring arterie. (D) Separat vagus nerve fra halspulsåren. (E) Fortsæt med at fjerne fascia indtil carotid er helt isoleret langs hulrum. (F) Sutur permanent knude på forreste yderpunkt, og slip knude ved bageste ende. (G) Tredje sutur er gevind under carotis og meget løst bundet. (H) arterie hakker lige over forreste sutur. ( I) Indsæt kateter ind nick i arterie. Grab forreste sutur med en pincet til at trække arterie ned over kateteret. (J) Secure kateter i halspulsåren med alle tre suturer.

Figur 5:.. Suturanlæggelse Skematisk repræsentation af operationsstedet før og efter kateteret installation A svarer med foto Figur 4G, med tilføjelse af et nick i arterien, som i fig 4H. Figur 4J.

Figur 6:. Skematisk af infusionssæt-up sprøjte er fyldt med narkotika, og udjævnet med en stump nål. Polyethylen linje lægger sprøjte til carotis kateter. Pumpe langsomt komprimerer sprøjte til at levere en ensartet dosering direkte ind i blodbanen.

Discussion

Carotidarterie infusion er en væsentlig teknik i denne undersøgelse af paclitaxel farmakokinetik. Carotidarterie infusion er en metode til hurtigt at fordele lægemidlet i hele kredsløbet ^14. 3 timer infusion er en tættere efterligner klinisk administration af lægemidler, såsom taxaner end bolusinjektioner. Operationen kan pålideligt udføres af en enkelt person, kirurgi er forholdsvis kort, og succesrater> 75%. Efter prøverne er indsamlet, skal de analyseres af de relevante metoder. Vi anvendte massespektrometri til at bestemme koncentrationen paclitaxel i plasma og vævsprøver. For yderligere at validere denne teknik, vi sendte blod- og vævsprøver til et uafhængigt laboratorium til analyse. Disse data blev afbildet som individuelle plasma-paclitaxel koncentrationskurver for hver testet dyr (Figur 1), og fordelingen af paclitaxel blev sammenlignet i forskellige væv (figur 2). I hvert tilfælde er det imtigt at overveje den bedste metode til at analysere fordelingen og / eller metabolisme lægemiddel, afhængigt af lægemidlet og systemet af interesse. Andre muligheder for måling af forskellige lægemidler kan omfatte HPLC-UV eller immunoassays ^2.

To primære faktorer er afgørende for en vellykket carotis kateterisation er godt gammeldags katetre og overlegen arterie isolation. Fashioning katetre efter størrelsen af ​​musemodellen er altafgørende. Hvis kateteret diameter er for tykt, vil indsættelse i arterien være overdrevent vanskelig, mens et for tyndt kateter vil være sværere at sikre og kan tilstoppe før eller under infusion. Vinklen og skarphed af kateterspidsen skal også være i en moderat niveau; et tip, der er for skarp, kan punktere arterievæggen, mens et tip, der er for kedeligt vil være vanskeligt at indsætte ind i arterien. Målingerne her givne blev udledt ved hjælp af ti uger gamle C57BL / 6J mus, ca. 20 g, som en model skabelon. Målingerne skal skaleresop eller ned empirisk til at passe individuelle modeller.

Isolering af halspulsåren skal være en delikat, bevidst proces at undgå unødvendige skader på væv og til at undgå omfattende blødning. Subkutan fedt kan generelt let adskilles med lav til medium skarpe pincet. Muskelvæv over carotis skal adskilles med medium til fin tippes pincet langs bias af muskelfibrene. Hvis en mere omfattende hul er nødvendig, skal teknikeren være yderst omhyggelig med at undgå brud små blodkar. Når carotis er synlig, vil der stadig være en rimelig mængde fascia, der skal tweezed væk fra arterien med fine tippet pincet. Endelig skal vagus nerve adskilles fra halspulsåren uden beskadigelse enten. Når carotis er korrekt isoleret, bør det være muligt at indsætte tangen nedenunder, med en tom plads på begge sider af arterien (se figur 4E).

Når trouble skydning fattige infusioner, skal du starte med at gennemgå vejledningen på pumpen for at være sikker på, at investigator korrekt har programmeret pumpen til at levere den forventede dosering. Så nøje overveje at ændre den mængde, der vil indføre i forsøgsdyret. Fortynding af lægemiddel skal beregnes således, at doseringsvolumen er hensigtsmæssig: volumen må ikke være for stor til, at dyret kan tolerere, og ideelt set ikke vil påvirke blodtrykket væsentligt; endnu lydstyrken skal være stor nok til, at pumpen kan levere pålideligt, og det vil skabe en lind strøm for at undgå træsko i knudepunkter. Hvis træsko bliver en regelmæssig begivenhed, overveje at skifte til en mindre gauge (større diameter) nål og slange. Yderligere, hvis indhold plasma lægemidlet ikke når de forventede niveauer, bør forskeren tjekke musene post mortem at afgøre, om kateteret forbliver godt placeret i arterien og fritflydende, og ændre form / størrelse af kateter som nødvendigt.

Den usefulness af denne metode kan begrænses af sådanne faktorer som størrelse og generelle sundhedstilstand af emnet, og den tilsigtede tidsrum af infusionen. Kirurgi og infusion kan overtax en allerede bedrøvet emne. Selv i et sundt dyr, halspulsåren kateter er kun passende for korte infusioner, generelt flere timer til flere dage. Overvej, hvad metoder til smertelindring, vil blive anvendt, hvis mus viser tegn på ubehag som reaktion på infusionen, såsom gentagne anvendelser af topisk anæstesi til sårsteder eller fortegningsret systemiske analgetika. Det vil være nødvendigt at have alle animalske arbejde godkendt af de lokale dyr regulerende organisation eller IACUC, for at opnå de nødvendige tilladelser til at udføre denne procedure. Hvis det er nødvendigt at have en længere infusion, eller at have musen overleve infusion i en længere periode, skal undersøges alternative infusionssæt metoder.

Efter at have mestret carotis arterie perfusioner i undersøgelsenaf farmakokinetik paclitaxel, vi planlægger at bruge denne teknik i fremtiden for at undersøge virkningen af ​​andre lægemidler og Abcc10 modulatorer i C57BL / 6J og FVB mus og andre musemodeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene tubing 0.024” OD X 0.011” ID	Braintree Scientific, Inc.	PE10
3 Blunted needles (30 gauge)	Braintree Scientific, Inc.	NB-30
Stainless steel port plug (28 gauge)	Braintree Scientific, Inc.	PP-28	Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal.
2 Stainless steel connector plugs (30 gauge)	Braintree Scientific, Inc.	C-30
Three 1 cc syringes	Becton, Dickinson and Co.	309659
Sterile 0.9% Saline solution	Hospira	0409-7984-37
Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution	Braintree Scientific, Inc.	HGS
Silk suture	Braintree Scientific, Inc.	SUT-S 113
Vanna Scissors (micro-scissors)	World Precision Instruments	14122	This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well.
Hartman Mesquito Hemostatic Forceps	World Precision Instruments	501705
Betadine Swabsticks	Perdue Products L.P.	BSWS1S
Bupivacaine	Hospira	0409-1160-01	May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia.
Paclitaxel	LC Laboratories	P-9600
Methanol	Sigma-Aldrich	32213
Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized	Fisher Scientific	22-362-566
Micro Capillary Tube Sealant	Fisher Scientific	02-678
C57BL/6J mice	Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred
API 4000 Q-Trap mass spetrometer	Applied Biosystems