Abstract
Synaptic प्रसारण एक अत्यंत तीव्र प्रक्रिया है. कार्रवाई संभावित रिहाई अंकित झिल्ली में स्थित वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल (VGCCs) के माध्यम से, प्रीसानेप्टिक टर्मिनल में सीए 2 + की आमद संचालित, पुटिका फ्यूजन और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के लिए ट्रिगर है. Synaptic प्रसारण की तेज़ी के लिए महत्वपूर्ण कार्य क्षमता, VGCCs के आगमन और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज मशीनरी के बीच स्थानिक और लौकिक synchrony है. सीधे सीए व्यक्ति presynaptic टर्मिनलों की रिहाई अंकित झिल्ली से 2 + धाराओं रिकॉर्ड करने की क्षमता प्रीसानेप्टिक सीए 2 + और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के बीच संबंधों का एक सटीक समझ के लिए जरूरी है. Electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए प्रीसानेप्टिक रिहाई अंकित झिल्ली तक पहुंच सबसे तैयारियाँ और प्रीसानेप्टिक सीए में उपलब्ध नहीं है 2 + प्रविष्टि इमेजिंग तकनीक और स्थूल वर्तमान measureme का उपयोग बताया गया हैएनटीएस - सीए 2 + प्रविष्टि कल्पना करने के लिए पर्याप्त अस्थायी समाधान नहीं है कि तकनीक. सीधे एकल presynaptic टर्मिनलों पर VGCCs के लक्षण वर्णन केंद्रीय synapses में संभव नहीं किया गया है और इस प्रकार अब तक सफलतापूर्वक केवल लड़की सिलिअरी नाड़ीग्रन्थि की calyx प्रकार अन्तर्ग्रथन में और चूहे calyces में हासिल किया गया है. हम सफलतापूर्वक पोस्टअन्तर्ग्रथनी संरचनाओं से रहित कार्यात्मक presynaptic टर्मिनलों के साथ पृथक reticulospinal axons कि पैदावार रीढ़ की हड्डी के एक तीव्रता से अलग तैयारी के विकास के द्वारा एक प्रकार की मछली रीढ़ की हड्डी की विशाल reticulospinal अन्तर्ग्रथन में इस समस्या को संबोधित किया है. हम fluorescently लेबल और व्यक्तिगत presynaptic टर्मिनलों की पहचान और रिकार्डिंग के लिए उन्हें लक्षित कर सकते हैं. इस तैयारी का उपयोग करना, हम immunohistochemistry और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी दृष्टिकोण का उपयोग व्यक्तिगत presynaptic टर्मिनलों की रिहाई के चेहरे पर सीधे VGCCs विशेषता है. सीए 2 + धाराओं रिहाई अंकित झिल्ली ओ पर सीधे दर्ज किया गया हैच व्यक्ति प्रीसानेप्टिक टर्मिनल, ऐसी पहली रिकॉर्डिंग केंद्रीय synapses पर बाहर ले जाने के लिए.
Introduction
Synaptic प्रसारण एक अत्यंत तेजी से और सटीक प्रक्रिया है. प्रीसानेप्टिक टर्मिनल की कार्रवाई संभावित आक्रमण रिहाई अंकित झिल्ली, प्रीसानेप्टिक CA में जिसके परिणामस्वरूप वृद्धि 2 + पुटिका फ्यूजन और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज 1 के लिए ट्रिगर के रूप में अभिनय में स्थित VGCCs के उद्घाटन की ओर जाता है. इन सभी चरणों के microseconds 2 के सैकड़ों के भीतर होते हैं, और इसलिए पुटिका संलयन मशीनरी से 3 VGCCs की तंग स्थानिक युग्मन की आवश्यकता होती है. Presynaptic सीए 2 + अपशिष्टों मुख्य रूप से सीए 2 + संवेदनशील रंगों 4 का उपयोग दृष्टिकोण इमेजिंग के माध्यम से विशेषता किया गया है. प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन्स में सीए 2 + मिलाना कि शामिल सीए 2 + बफ़र्स परोक्ष रूप से presynaptic कैल्शियम और neurotransmission 3 के बीच संबंधों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसके अलावा, सीए 2 + 5 uncaging या macroscopi रिकॉर्डिंग से प्रीसानेप्टिक मुक्त सीए 2 + एकाग्रता modulatingसीए सी 2 + धाराओं पुटिका फ्यूजन और / या रिहाई के उपायों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया गया है; ऐसे समाई माप के रूप में 6 या पोस्टअन्तर्ग्रथनी प्रतिक्रियाओं में एक ही सवाल का पता करने के लिए 2. अन्तर्ग्रथनी पुटिका फ्यूजन और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज ट्रिगर 2 + धाराओं हालांकि, जारी चेहरे पर 2 + धाराओं सीधे सीए निस्र्पक, झिल्ली विध्रुवण सीए में अनुवाद किया है, जहां प्रीसानेप्टिक झिल्ली की विशेष खंड, सीए की एक सटीक उपाय प्राप्त करने का अभिन्न अंग है 2 + अन्तर्ग्रथनी पुटिका संलयन के लिए आवश्यकता. इसके अलावा, क्षमता सीधे कार्रवाई की क्षमता का समय पाठ्यक्रम के बीच समय के रिश्ते के एक सटीक व्याख्या पुटिका फ्यूजन और रिहाई की सटीक एक साथ माप के साथ की अनुमति देता है युग्मित, व्यक्तिगत presynaptic टर्मिनलों पर सीए 2 + धाराओं को चिह्नित करने के लिए, प्रीसानेप्टिक सीए 2 + वर्तमान, पुटिका फ्यूजन और रिहाई. रिहाई अंकित झिल्ली तक पहुंचपोस्टअन्तर्ग्रथनी डेन्ड्राइट द्वारा समानाधिकरण बंद करने के कारण presynaptic टर्मिनलों के बहुमत में उपलब्ध नहीं है. यह व्यक्ति presynaptic टर्मिनलों पर वर्तमान के प्रत्यक्ष माप रोकता के बाद यह पहुंच VGCCs के लक्षण वर्णन में एक प्रमुख बाधा रहा है. व्यक्तिगत presynaptic टर्मिनलों पर प्रीसानेप्टिक सीए 2 + धाराओं के प्रत्यक्ष लक्षण वर्णन इस प्रकार अब तक केंद्रीय synapses में संभव नहीं किया गया है और केवल दो calyceal प्रकार presynaptic टर्मिनलों में हासिल किया गया है; लड़की सिलिअरी नाड़ीग्रन्थि 7-10 और चूहे calyces 11,12 के calyx प्रकार अन्तर्ग्रथन. एक प्रकार की मछली रीढ़ की हड्डी 13 में विशाल reticulospinal अन्तर्ग्रथन सहित अन्य सभी प्रीसानेप्टिक टर्मिनल में, presynaptic रिहाई अंकित झिल्ली के लिए उपयोग की कमी के कारण इस तरह के प्रीसानेप्टिक सीए 2 + अपशिष्टों का अध्ययन करने के लिए सीए 2 + इमेजिंग के रूप में अप्रत्यक्ष दृष्टिकोण का उपयोग जरूरी हो गया है.
Dorso-उदर उन्मुखीकरण का संकेत है एक प्रकार की मछली रीढ़ की हड्डी के चित्रा 1 एक प्रकार की मछली विशाल reticulospinal अन्तर्ग्रथन. (एक) पार अनुभाग. Reticulospinal axons हरी Asterix के साथ चिह्नित हैं. पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन 13 पर (हरी तीर द्वारा चिह्नित) प्रीसानेप्टिक reticulospinal अक्षतंतु Passant संपर्कों एन कई बनाने दिखा एक प्रकार की मछली रीढ़ की हड्डी में reticulospinal अन्तर्ग्रथन (ख) 3 डी पुनर्निर्माण. पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन एलेक्सा Fluor 568 hydrazide (लाल) के साथ भर दिया गया है, जबकि presynaptic टर्मिनलों, एलेक्सा Fluor 488 hydrazide संयुग्मित phalloidin (हरा) के साथ चिह्नित किया गया है.
के न्यूरॉन्स पर Passant synaptic संपर्कों एन रीढ़ व्याख्यान चबूतरे वाला दुम अक्ष चित्रा 1 ए को कॉर्ड समानांतर, प्रपत्र कई के उदर क्षेत्र में स्थित एक प्रकार की मछली विशाल reticulospinal axons,रीढ़ की हड्डी में उदर सींग 14 चित्रा 1 बी 13. Macroscopic पूरे सेल सीए 2 + धाराओं बरकरार रीढ़ की हड्डी 13,15 में reticulospinal axons से दर्ज किया गया है. हालांकि, सीए के प्रत्यक्ष माप पर पिछले अंधा प्रयास सेल संलग्न पैच दबाना तकनीक का उपयोग बरकरार एक प्रकार की मछली रीढ़ की हड्डी में reticulospinal axons में 2 + धाराओं की वजह से विरोध पोस्टअन्तर्ग्रथनी प्रक्रियाओं के कारण प्रीसानेप्टिक रिहाई अंकित झिल्ली के लिए उपयोग की कमी के कारण 13 असफल सिद्ध कर दिया है चित्रा 1 बी. रिहाई अंकित झिल्ली पहले, अन्तर्ग्रथन की यांत्रिक गड़बड़ी से पहले 12 रिकॉर्डिंग या यांत्रिक हदबंदी 16 के साथ मिलकर enzymatic उपचार के लिए पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन 11 को हटाने के द्वारा सुलभ बना दिया गया है. रीढ़ की हड्डी की जटिल संगठन को देखते हुए यह पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन की पहचान और यंत्रवत् इसे वापस लेना या वें उपद्रव के लिए बेहद मुश्किल साबित होगाई अन्तर्ग्रथन. इसलिए, हम यांत्रिक हदबंदी द्वारा पीछा एंजाइमी उपचार 17 का उपयोग करने का फैसला किया.
इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम जिससे व्यक्ति presynaptic टर्मिनलों पर असीमित अधिकार प्रदान करने, किसी भी पोस्टअन्तर्ग्रथनी प्रक्रियाओं से रहित कार्यात्मक presynaptic टर्मिनलों के साथ व्यवहार्य पृथक reticulospinal axons कि पैदावार एक प्रकार की मछली रीढ़ की हड्डी के एक तीव्रता से अलग तैयारी का विकास किया है. एक मानक उलटा माइक्रोस्कोप और प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ संयोजन के रूप में, यह सेल का उपयोग रिकॉर्डिंग के लिए, सीए 2 + धाराओं चित्रा 4C और चित्रा 4D आइसोलेट्स कि एक रिकॉर्डिंग समाधान युक्त एक पैच विंदुक के साथ, की पहचान करने और व्यक्तिगत fluorescently पहचान presynaptic टर्मिनलों को लक्षित करने के लिए सक्षम बनाता है संलग्न वोल्टेज दबाना तकनीक. सीए 2 + धाराओं व्यक्ति presynaptic टर्मिनलों चित्रा 4F की प्रीसानेप्टिक रिहाई अंकित झिल्ली पर सीधे दर्ज किया गया है. यह एक significa हैयह केंद्रीय synapses पर बाहर ले जाने के लिए इस तरह की पहली रिकॉर्डिंग के बाद से NT synaptic प्रसारण के क्षेत्र में सफलता.
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Protocol
पाली डी lysine hydrobromide की 1. तैयारी
- 0.1 एम borate बफर (8.5 पीएच) में 1 मिलीग्राम / एमएल पाली डी lysine hydrobromide तैयार करें.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और दुकान.
Coverslips के 2 पाली lysine कोटिंग
नोट: एक लामिना का प्रवाह चैम्बर में सभी सफाई और कोटिंग कदम बाहर ले.
- 2 घंटे के लिए 1 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) युक्त एक पेट्री डिश में रखें coverslips.
- महाप्राण सभी एचसीएल और 70% इथेनॉल (EtOH) 2-3x से कुल्ला.
- 1 घंटे के लिए 70% EtOH में छोड़ दें.
- महाप्राण सभी 70% EtOH और 100% EtOH 2-3x से कुल्ला.
- 2 घंटे के लिए 100% EtOH में छोड़ दें. सभी EtOH aspirate.
- कुछ सेकंड के लिए फिल्टर पेपर और शुष्क हवा के साथ सूखे दाग.
- जगह ओ / एन 1 मिलीग्राम में / एमएल पाली lysine समाधान.
- कुल्ला Millipore पानी 4-5x साथ अगले दिन coverslips.
- शुष्क हवा पाली lysine एक साफ पेट्री डिश में कांच रोलर्स पर coverslips लेपित.
- Immunohistochemistr लिएवाई, 35 x 10 मिमी पेट्री डिश पलकों का उपयोग करें. 0.3 सेमी की मोटाई के लिए डिश में और 30 ° कंपनी / एन पर निर्धारित करने की अनुमति: Sylgard तैयार (polydimethylsilioxane, PDMS) PDMS (वजन द्वारा 1 इलास्टोमेर और एजेंट 10 इलाज) गिरने से व्यंजन खड़े हैं. इस रखा है एक बार, PDMS में इनसेट 1 सेमी से एक 2 सेमी में कटौती. Coverslips के लिए उपरोक्त के रूप में एक ही कदम निम्नलिखित पाली lysine के साथ स्वच्छ और कोट इनसेट.
- स्टोर पाली lysine लेपित coverslips और बर्तन उपयोग करें जब तक (2 सप्ताह का समय है, लेकिन हर 3-4 दिनों के लिए समय समय पर तैयार करके सबसे अच्छा चिपकने वाला परिणाम प्राप्त) लामिना का प्रवाह चैम्बर के अंदर कवर किया.
- हिल ऊतक slicer में रीढ़ की हड्डी पिन करने के लिए, एक PDMS ब्लॉक तैयार करें. मिक्स Elastomer एक और elastomer बी 1: 1 वजन से. एक 100 x 15 मिमी पेट्री डिश में डालो और 30 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन सेट करने के लिए अनुमति देते हैं. PMDs का एक आयताकार टुकड़ा काट और epoxy गोंद का उपयोग टुकड़ा करने की क्रिया बेस प्लेट के लिए यह गोंद. गोंद जगह में PDMS फिक्सिंग निर्धारित करने की अनुमति और एक फ्लैट प्राप्त करने के लिए सतह से कई पतली वर्गों टुकड़ासतह पर ऊतक पिन करने के लिए.
एक प्रकार की मछली स्पाइनल कॉर्ड के 3 एक्यूट हदबंदी पृथक Reticulospinal Axons उपज
- (100 मिलीग्राम / एल एम एस-222) tricaine methanesulphonate साथ एक ammoecoete या वयस्क एक प्रकार की मछली (Petromyzon marinus) anesthetize. एक प्रकार की मछली युक्त, एक ढक्कन के द्वारा कवर एक प्लास्टिक के कप में पानी में संवेदनाहारी जोड़ें बलिदान होना.
- 130 NaCl, 2 CaCl, 1.8 MgCl 2, 4 HEPES, 4 डेक्सट्रोज (7.6 पीएच, osmolarity 270 mOsm) 2.1 KCl, 2.6 और निकालने के शरीर: ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) (मिमी में) निम्नलिखित रचना की घंटी समाधान में एक प्रकार की मछली सिर काटना दीवार की मांसपेशियों को रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सतह को बेनकाब करने के लिए.
- ठीक संदंश का उपयोग कर रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सतह से meninx primitiva निकालें. इस चरण में उदर meninx primitiva न निकालें.
- 1 सेमी लंबे टुकड़ों में रीढ़ की हड्डी कट.
- एक PDMS आधार पीएलए टुकड़ा करने की क्रिया लाइन में खड़ा पर, पृष्ठीय पक्ष का सामना करना पड़, ठीक कीट पिन का उपयोग कर एक रीढ़ की हड्डी टुकड़ा पिनठंडा घंटी समाधान युक्त एक हिल ऊतक slicer कक्ष में ते (2.12 देखें).
- व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम पर बरकरार पृष्ठीय स्तंभ वर्गों के पीछे हदबंदी की प्रक्रिया चित्रा 2A और चित्रा 2B दौरान हैंडल के रूप में सेवा करने के लिए समाप्त हो जाती है, जा ब्लेड से rostro दुम अक्ष के साथ टुकड़ा करने की क्रिया द्वारा रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय स्तंभ के मध्य भाग निकालें. टुकड़ा करने की क्रिया और अंतर्निहित reticulospinal अक्षतंतु स्तंभ undamaged चित्रा 2B छोड़ने केवल पृष्ठीय स्तंभ को हटा गहराई सेटिंग परमिट कि धीमी गति सेटिंग का उपयोग करें.
- 1 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीज (Streptomyces griseus से टाइप XIV) और घंटी समाधान में (क्लोस्ट्रीडियम histolyticum से टाइप आइए) तैयार 1 मिलीग्राम / एमएल collagenase के एक कॉकटेल में 45 मिनट के लिए आरटी पर कटा हुआ रीढ़ की हड्डी के टुकड़े सेते (एल Manira और Bussières से अनुकूलित 1997 17).
- एक PDMS में ठीक पिन का उपयोग कर पिन एंजाइम का इलाज रीढ़ की हड्डी के टुकड़े पेट्री डिश conta अटेining ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) घंटी समाधान.
- ठीक संदंश के साथ उदर meninx primitiva निकालें.
- रीढ़ की हड्डी चित्रा 2 डी में बरकरार reticulospinal axons की केंद्रीय स्तंभ छोड़ने कटा हुआ पृष्ठीय खंड के मध्य में एक स्केलपेल ब्लेड से रीढ़ की हड्डी के पार्श्व इलाकों काटें.
- लेंस पर विसर्जन के तेल की एक बूंद रखें.
- रिकॉर्डिंग कक्ष चित्रा 3 के स्लॉट में पाली lysine लेपित coverslip (चित्रा 3 ए, शीर्ष टुकड़ा, लाल आयत) प्लेस और एक सील की सुविधा के लिए, चित्रा 3 ए में लाल और नीले रंग की आयतों के बीच (सभी किनारों को अंतरिक्ष वैक्यूम तेल लागू होते हैं. भाड़ जगह में शीर्ष. रिकॉर्डिंग रिग पर इनसेट में चैम्बर रखें.
- एक पाश्चर पिपेट का उपयोग रिकॉर्डिंग कक्ष में घंटी समाधान जोड़ें.
- शीतलक डिवाइस इनपुट ट्यूबिंग को एंटीफ्ऱीज़र समाधान युक्त दबाव बोतल के बहिर्वाह टयूबिंग कनेक्ट करें. Outp कनेक्टबाहरी ठंडा जैकेट के इनपुट अंत और जलाशय चित्रा 3b करने के लिए उत्पादन समाप्त करने के लिए शीतलक डिवाइस के केन्द्र शासित प्रदेशों ट्यूबिंग.
- रिकॉर्डिंग कक्ष में एक समय में रीढ़ की हड्डी का एक टुकड़ा रखें और धीरे axons पृथक चित्रा 2 ई और चित्रा 2 एफ रहे हैं जब तक Teflon लेपित संदंश का उपयोग हर समय coverslip साथ इसे बनाए रखने के रीढ़ की हड्डी को अलग.
- रिकॉर्डिंग कक्ष चित्रा 3 बी के बाहरी ठंडा जैकेट के माध्यम से, शीतलक डिवाइस के माध्यम से, (विस्थापन से) एंटीफ्ऱीज़र समाधान दबाव (बोतल में धकेल दिया है नाइट्रोजन गैस) से गुजर रहा 10 डिग्री सेल्सियस के लिए रिकॉर्डिंग समाधान तापमान लाओ.
- Axons 10 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के पद हदबंदी के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दें.
प्रदान की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के लिए कक्ष रिकॉर्डिंग की चित्रा 3 योजनाबद्ध. आयाम इंच में हैं. Basepiece चित्र (क) में दिखाया लाल आयत basepiece में coverslip नाली में coverslip की स्थिति को इंगित करता है. उच्च वैक्यूम तेल लागू किया जाता है, जहां (क) basepiece चित्र में दिखाया लाल और नीले आयत के बीच क्षेत्र है. (ख) इकट्ठे रिकॉर्डिंग कक्ष से पता चलता है.
एफएम 1-43 साथ 4 लेबल और presynaptic टर्मिनलों की पहचान
- वी में एफएम 1-43 को शामिल करके, presynaptic टर्मिनलों लेबलउच्च + K विध्रुवण के दौरान synaptic EXO-endocytosis दौरान esicles. (30 मिमी KCl युक्त 5 एमएल घंटी समाधान में) 5 माइक्रोन एफएम 1-43 साथ तैयारी छिड़कना.
- 1 मिलीग्राम के साथ तैयारी छिड़कना / एमएल Advasep-7 (5 एमएल घंटी समाधान में) अतिरिक्त एफएम डाई) 18 को निकालने के लिए.
- 15 मिनट के लिए किसी भी remant डाई और Advasep वार्शआउट करने के लिए घंटी समाधान के साथ तैयारी छिड़कना.
- मानक प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग एक डिजिटल कैमरा सीसीडी और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर Micromanager के साथ संयोजन के रूप में एक औंधा प्रतिदीप्ति खुर्दबीन पर 100 एक्स तेल विसर्जन लेंस (एनए 1.25), साथ छवि.
- चित्रा 4C और चित्रा 4D रिकॉर्डिंग के लिए लक्षित करने के लिए fluorescently लेबल presynaptic टर्मिनलों को पहचानें.
पृथक Reticulospinal axons की 5 Immunohistochemistry
- द्विसंयोजक आयन (सीए 2 + और 2 मिलीग्राम +) नि: शुल्क के साथ पकवान इनसेट (प्रोटोकॉल खंड 2.10.) भरेंघंटी समाधान.
- एक पी 87 micropipette खींचने में पैच pipettes बनाना. (एक सिलिकॉन टयूबिंग 0.89 मिमी सक्शन अंत से जुड़ी एक micropipette टिप के साथ भीतरी व्यास का प्रयोग करके) एक पैच पिपेट (1.5 मिमी बाहरी व्यास ग्लास) और शोषण का उपयोग पाली lysine इनसेट के एक छोर पर सीवन गोंद की एक छोटी राशि रखें.
- प्रोटोकॉल धारा 3 चित्रा 2 में वर्णित के रूप में. एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर dissociations बाहर ले जाने के लिए सतह के लिए दृढ़ता से यह पालन करने के लिए धीरे संदंश के साथ सीवन गोंद और प्रेस पर रीढ़ की हड्डी के एक छोर रखें. इनसेट के दूसरे छोर पर सीवन गोंद की एक बूंद प्लेस और धीरे axons अलग कर रहे हैं जब तक रीढ़ की हड्डी में खिंचाव और सिवनी गोंद पर धीरे से खींच कर मुक्त रीढ़ की हड्डी अंत पालन करें. कोमल संदंश के साथ नीचे दबाकर जगह में ठीक करें.
- विनिमय द्विसंयोजक छिड़काव द्वारा नियमित घंटी समाधान के साथ घंटी समाधान मुक्त.
- Axons 20 मिनट पद dissoc के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दें10 डिग्री सेल्सियस पर iation.
- 20 मिनट के लिए {फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, (मिमी) NaCl 137, KCl 2.7, ना 2 4 HPO 10, के.एच. 2 4 पीओ 1.8, 7.4 पीएच) में तैयार} 4% paraformaldehyde (पीएफए) में अलग axons को ठीक करें. 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से गुजर द्वारा उपयोग करने से पहले पीएफए समाधान फ़िल्टर.
- 10 मिनट के लिए (पीबीएस में) 0.1 एम ग्लाइसिन perfusing द्वारा पीएफए बाहर धो लें.
- 10 मिनट के लिए 0.1% (पीबीएस में) ट्राइटन एक्स में सेते हैं.
- 20 मिनट के लिए पीबीएस perfusing से धो लें.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए (पीबीएस में) 5% गैर वसा दूध के साथ ब्लॉक.
- ब्याज की VGCC को प्राथमिक एंटीबॉडी में जोड़ें (1: पीबीएस में 200 कमजोर पड़ने) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 घंटे के लिए सेते हैं.
- 20 मिनट के लिए पीबीएस perfusing से धो लें.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए (पीबीएस में) 5% गैर वसा दूध के साथ ब्लॉक.
- माध्यमिक एंटीबॉडी में जोड़ें (1: पीबीएस में 400 कमजोर पड़ने) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए अंधेरे में सेते हैं.
- 20 मिनट के लिए पीबीएस के साथ perfusing से धो लें.
- 1% गोजातीय सीरम Albu के साथ ब्लॉक20 मिनट के लिए (पीबीएस में) मिनट.
- एलेक्सा Fluor 488 phalloidin में जोड़ें (कार्य एकाग्रता μl / 5 इकाइयों, मेथनॉल 200 इकाइयों / मिलीलीटर में तैयार शेयर).
- 20 मिनट के लिए पीबीएस के साथ perfusing से धो लें.
- Confocal खुर्दबीन पर 100X पानी विसर्जन लेंस का उपयोग कर छवि.
6 electrophysiological रिकॉर्डिंग
- एक पी 87 micropipette खींचने में aluminosilicate ग्लास पैच pipettes (पिपेट प्रतिरोध 2-5 MΩ) बनाना. पिपेट टिप पूरे प्रीसानेप्टिक टर्मिनल व्यास शामिल है कि इस तरह डिजाइन पैच पिपेट.
- PDMS 23 में 50-60 साई दबाव में पैच पिपेट सूई से PDMS कोट पैच pipettes (पैच विंदुक के पीछे के अंत के लिए एक नाइट्रोजन गैस सिलेंडर से जुड़े एक सिलिकॉन टयूबिंग, 0.89 मिमी भीतरी व्यास,, देते हैं) और एक गर्मी का उपयोग कर शुष्क बंदूक. वैकल्पिक रूप से, एक यौगिक खुर्दबीन के नीचे संभव के रूप में टिप के करीब कोटिंग, लागू करने PDMS साथ मैन्युअल कोट पिपेट,.
- एक माइकर का उपयोग कर आग पोलिश पैच pipettesoforge (एक यौगिक खुर्दबीन के मंच पर सज्जित एक कस्टम बनाया प्लैटिनम रेशा).
- प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा लेबल presynaptic टर्मिनलों का प्रदर्शन पृथक axons पहचानें.
- रिकॉर्डिंग समाधान भरें, एक सिरिंज का उपयोग पैच पिपेट में (सीए 2 + धाराओं को अलग करने के लिए डिज़ाइन प्रभारी वाहक के रूप में 10 मिमी 2 CaCl या 90 मिमी BaCl 2, HEPES 7.6 पीएच, osmolarity 270 mOsm बफर).
- एक मोटर चालित जोड़तोड़ MP225 उपयोग कर स्नान ऊपर पिपेट धारक और स्थिति में पैच पिपेट डालें. धीरे एक fluorescently पहचान प्रीसानेप्टिक टर्मिनल के चेहरे के खिलाफ स्नान और स्थिति में पैच पिपेट कम है.
- संपर्क झिल्ली के साथ किया जाता है जब तक धीरे धीरे पैच पिपेट अग्रिम. इस बिंदु पर, पिपेट धारक से जुड़ी एक ट्यूब के माध्यम से कोमल मुंह चूषण द्वारा एक gigaohm मुहर हासिल.
- एक एक का उपयोग, एक चैनल सीए 2 + धाराओं रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक बेहद कम पृष्ठभूमि शोर के स्तर को प्राप्त करने के लिएरिकॉर्डिंग के लिए एक ठंडा headstage साथ xopatch 200B. एक 5 किलोहर्ट्ज़ बेसल फिल्टर का उपयोग कर 20-50 kHz और फिल्टर पर नमूना डेटा. एक Axograph एक्स का उपयोग डाटा अधिग्रहण के लिए बाहर ले
- प्रोत्साहन के रूप में 10 एम वी के वेतन वृद्धि में एक मानक कदम प्रोटोकॉल, का प्रयोग करें. सीए 2 + चैनलों के अधिक से अधिक सक्रियण सुनिश्चित करने के लिए, कदम प्रोटोकॉल पूर्ववर्ती, प्रोटोकॉल में एक पूर्व पल्स शामिल. रिसाव धाराओं के बाद के विश्लेषण घटाव के लिए कदम प्रोटोकॉल में एक 10 एम वी रिसाव कदम शामिल.
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Representative Results
इस हदबंदी प्रोटोकॉल पैदावार स्वस्थ और कार्यात्मक अलग reticulospinal पोस्टअन्तर्ग्रथनी अनुमानों चित्रा 2 एफ से रहित axons, लेकिन जो फिर भी पैदा synaptic पुटिका EXO और endocytosis चित्रा 4C और चित्रा 4D में सक्षम कार्यात्मक presynaptic टर्मिनलों बरकरार रहती है. Reticulospinal axons की अलग क्षेत्रों की धारा स्पष्ट रूप से reticulospinal अक्षतंतु झिल्ली चित्रा 2 एफ को अप्रतिबंधित उपयोग की अनुमति किसी भी अन्य neuronal प्रक्रियाओं के स्पष्ट होने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत पहचाना जा सकता है. axons हदबंदी के बाद संरचनात्मक अखंडता बनाए रखने के लिए. पृथक axons पूरे सेल विन्यास में समझौता और एलेक्सा Fluor 488 hydrazide से भर गया. अक्षतंतु और कोई डाई रिसाव के भीतर समान रूप से वितरित डाई अक्षतंतु चित्रा -4 ए से मनाया गया.
/ftp_upload/51925/51925fig4highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
चित्रा एक अलग reticulospinal अक्षतंतु से 4 प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग. पूरे सेल विन्यास में एक पैच पिपेट साथ एलेक्सा Fluor 488 hydrazide से भरा (एक) पृथक reticulospinal अक्षतंतु. पिपेट स्थिति एक सफेद तीर के साथ संकेत दिया है. (ख) मैं. एक अलग reticulospinal अक्षतंतु में निकाल प्रतिनिधि कार्रवाई संभावित. द्वितीय. बरकरार रीढ़ की हड्डी में एक reticulospinal अक्षतंतु में निकाल प्रतिनिधि कार्रवाई संभावित. काला तीर उत्तेजना के समय बिंदु इंगित करता है. (ग) और (घ) एफएम 1-43 साथ presynaptic टर्मिनलों के कबरा लेबलिंग दिखा और सेल संलग्न पैच रिकॉर्डिंग के लिए पैच विंदुक के साथ एक व्यक्ति प्रीसानेप्टिक टर्मिनल के लक्षित कर एक अलग reticulospinal अक्षतंतु के दो छवियों. सफेद तीर पैच पिपेट के निशान, जबकि ग्रीन तीर व्यक्ति presynaptic टर्मिनलों निशान. (ई) मृत reticulospinal अक्षतंतु indiscr दिखा पृथकअक्षतंतु भर एफएम 1-43 की iminate समावेश. 4F. सीए 2 + धाराओं के सेल संलग्न रिकॉर्डिंग दिखा प्रतिनिधि उदाहरण (10 मिमी [सीए 2 +] पैच पिपेट में रिकॉर्डिंग समाधान में बाहरी) कई सीए 2 + चैनलों के खुलने का प्रदर्शन प्रीसानेप्टिक रिहाई अंकित झिल्ली से. ठोस लाइन धराशायी लाइनों के चैनल के उद्घाटन के लिए गाऊसी चोटियों से संकेत मिलता है, जबकि 0, चैनल के बंद राज्य इंगित करता चिह्नित.
तीव्रता से अलग axons बिजली के गुणों को बनाए रखने. आराम झिल्ली क्षमता (आरएमपी) एक microelectrode साथ disassociated अक्षतंतु impaling द्वारा या वर्तमान दबाना मोड में पूरे सेल विन्यास में अक्षतंतु पट्टी से मापा जा सकता है. इसी प्रकार RMPs -57.94 ± 1.63 एम वी (n = 17 axons) का एक मतलब के साथ, दोनों तरीकों में दर्ज हैं. इसके अलावा, axons कार्रवाई क्षमता आग करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है अलग कार्रवाई संभावित तुलनीय होने का आकार और समय के पाठ्यक्रम के साथ, 4B चित्राबरकरार रीढ़ की हड्डी में एक reticulospinal अक्षतंतु में निकाल दिया एक करने के लिए.
पुटिका संलयन और पुनर्चक्रण अलग axons में जारी रहती है. पुनर्चक्रण पुटिका समूहों उच्च पोटेशियम (30 मिमी KCl) उत्तेजना 19 के दौरान styryl डाई एफएम 1-43 के साथ लेबल किया जा सकता है. डाई निकासी पर, presynaptic टर्मिनलों के अलग कबरा लेबलिंग बरकरार रीढ़ की हड्डी 13 में reticulospinal axons के समान वितरण के साथ, चित्रा 4C और चित्रा 4D मनाया जा सकता है. अस्वस्थ axons अक्षतंतु चित्रा 4E भर में अंधाधुंध एफएम डाई प्रविष्टि दिखाने के रूप में एफएम 1-43 धुंधला स्वस्थ और अस्वस्थ axons के बीच एक स्पष्ट अंतर प्रदान करता है. स्पष्ट रूप से व्यक्तिगत presynaptic टर्मिनलों की पहचान करने की क्षमता चित्रा 4C और चित्रा 4D रिकॉर्डिंग के लिए एक पैच पिपेट साथ उन्हें लक्षित करने के लिए हमें की अनुमति देता है. इस क्षमता का उपयोग, हम रिहाई चेहरा मीटर से सीधे सीए 2 + धाराओं दर्ज की गई हैएकल presynaptic टर्मिनलों चित्रा 4F की embrane.
तीव्रता से पृथक reticulospinal अक्षतंतु तैयारी भी एकल presynaptic टर्मिनलों के immunohistochemistry के लिए बरकरार रीढ़ की हड्डी की तुलना में विशिष्ट लाभ प्रदान करता है. किसी भी पृष्ठभूमि autofluorescence की कमी और पोस्टअन्तर्ग्रथनी संरचनाओं या glia पर धुंधला के अभाव स्पष्ट पहचान presynaptic टर्मिनलों पर एंटीबॉडी लेबलिंग की पहचान (चित्रा 5 ब, मैं) के लिए अनुमति देता है. ऐसे एलेक्सा-488 संयुग्मित phalloidin (चित्रा 5 ए, द्वितीय) और के रूप में एक presynaptic मार्कर के साथ युग्मित (चित्रा 5 ब, द्वितीय), प्रीसानेप्टिक actin 20, immunohistochemical स्पष्ट रूप से प्रदर्शन किया जा सकता presynaptic टर्मिनलों के लिए लेबलिंग का स्थानीयकरण लेबल जो (चित्रा 5 ए, तृतीय). इस दृष्टिकोण टी दिखा अलग VGCC उपप्रकार के immunohistochemical लक्षण वर्णन बाहर ले जाने के लिए confocal माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया गया हैpresynaptic टर्मिनलों चित्रा 5A को वारिस विशिष्ट स्थानीयकरण.
एक अलग reticulospinal अक्षतंतु की चित्रा 5 Immunostaining. (क) व्यक्तिगत presynaptic टर्मिनलों पर आर प्रकार (CaV2.3) कैल्शियम चैनल के immunohistochemical लक्षण वर्णन. मैं. (- खरगोश मेजबान) एक पॉलीक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी डोमेन द्वितीय और आर प्रकार कैल्शियम चैनल के तृतीय के बीच intracellular पाश में एक मिलान लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. माध्यमिक एंटीबॉडी एलेक्सा Fluor 633 hydrazide संयुग्मित विरोधी खरगोश बकरी आईजीजी था. द्वितीय. प्रीसानेप्टिक actin की एलेक्सा Fluor 488 phalloidin लेबलिंग से पहचान presynaptic टर्मिनलों. III. आर प्रकार एंटीबॉडी लेबलिंग (लाल) और एक मर्ज किए गए ओवरले में दिखाया एलेक्सा-488 phalloidin (हरा) के बीच colocalization. (ख) मैं. विरोधी आर प्रकार कैल्शियम चैनल एंटीबॉडी की Preincubation साथनियंत्रण प्रतिजन कैल्शियम चैनल के किसी विशिष्ट लेबलिंग उपज नहीं है. द्वितीय. असतत कबरा लेबलिंग दिखा वही अक्षतंतु के लिए presynaptic टर्मिनलों की एलेक्सा Fluor 488 phalloidin लेबलिंग.
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Discussion
हमारे हदबंदी प्रोटोकॉल पोस्टअन्तर्ग्रथनी अनुमानों चित्रा 2 एफ से रहित अलग reticulospinal axons उपज से महत्वपूर्ण है, लेकिन फिर भी कार्यात्मक presynaptic टर्मिनलों चित्रा 4C और चित्रा 4D बनाए रखने के जो. प्रीसानेप्टिक टर्मिनल का विरोध पोस्टअन्तर्ग्रथनी प्रक्रियाओं के अभाव में पहले, केंद्रीय synapses में संभव है और सफलतापूर्वक केवल दो calyceal प्रकार presynaptic टर्मिनलों में हासिल नहीं एकल presynaptic टर्मिनलों पर प्रीसानेप्टिक रिहाई अंकित झिल्ली को प्रत्यक्ष रिकॉर्डिंग का उपयोग परमिट; लड़की सिलिअरी नाड़ीग्रन्थि 7-10 और चूहे calyces 11,12 के calyx प्रकार अन्तर्ग्रथन. इलेक्ट्रॉन micrographic स्तर पर सरल, एकल सक्रिय जोनों 21 पेश करने के लिए दिखाया गया है जो व्यक्तिगत presynaptic टर्मिनलों, एफएम 1-43 साथ लेबलिंग रीसाइक्लिंग पुटिका समूहों द्वारा की पहचान की और रिकॉर्डिंग चित्रा 4C और चित्रा 4D के लिए लक्षित किया जा सकता है. सीए
कार्यात्मक presynaptic टर्मिनलों के साथ पृथक reticulospinal axons प्राप्त करने की कुंजी आलोचक की एक श्रृंखला में निहितअल अनुक्रमिक चरणों. रीढ़ की हड्डी चित्रा 1 ए का Dorso औसत दर्जे क्षेत्र में मुख्य रूप से स्थित विशाल axons की तीव्र हदबंदी बाधा ऊतक एक हिल ऊतक slicer चित्रा 2A में पहले हटा दिया था. यह आसान यंत्रवत् कम से कम संभव बल प्रयोग रीढ़ की हड्डी को अलग कर देना पड़ता है. पृष्ठीय स्तंभ का टुकड़ा करने की क्रिया ब्लेड से काटने की कार्रवाई में बाधा होगा किसी भी शेष पृष्ठीय meninx primitiva बाद पृष्ठीय meninx primitiva का पूरी तरह हटाने की आवश्यकता है. हम टुकड़ा करने की क्रिया के समय रीढ़ की हड्डी पर उदर meninx primitiva छोड़ने रीढ़ की हड्डी के आकार को बनाए रखने में मदद करता है और बेहतर टुकड़ा करने की क्रिया में मदद करता है कि लगता है. टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान रीढ़ की हड्डी में तनाव कायम रखना axons नुकसान होगा कि ब्लेड के नीचे ऊतक के किसी भी पार्श्व आंदोलन या impinging से बचाता है. 1 लंबी सेमी रीढ़ की हड्डी के टुकड़े ऊतक बढ़ाकर और डब्ल्यू तनाव को बनाए रखने के नीचे टिकी जा सकता है के रूप में टुकड़ा करने की क्रिया के लिए एक अच्छा लंबाई प्रदान करता हैhile टुकड़ा करने की क्रिया. नजर रखने के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक टुकड़ा की गहराई है; बहुत उथले एक टुकड़ा रीढ़ की हड्डी भी गहरी एक टुकड़ा हर्जाना जबकि reticulospinal axons की अच्छी जुदाई से बचाता है. एक अच्छा टुकड़ा गहराई पृष्ठीय स्तंभ दिख undamaged उदर reticulospinal स्तंभ छोड़ने हटा दिया जाता है, जहां से एक है. टुकड़ा की गहराई जानवरों के बीच रीढ़ की हड्डी मोटाई में भिन्नता है दी टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान लगाया जाना है. यह unsliced व्याख्यान चबूतरे के लिए अनुमति देता है और दुम हदबंदी की प्रक्रिया चित्रा 2 ई के दौरान ऊतक काबू करने के लिए हैंडल के रूप में सेवा करने के लिए समाप्त हो जाती है के रूप में पृष्ठीय स्तंभ को हटाने के लिए सबसे अच्छा रीढ़ की हड्डी टुकड़ा चित्रा 2B के मध्य भाग में किया जाता है.
पृष्ठीय स्तंभ को हटाने, collagenase के एक मिश्रण के साथ कटा हुआ रीढ़ की हड्डी के टुकड़े के इलाज (Collagenase प्रकार आइए क्लोस्ट्रीडियम histolyticum से) और प्रोटीज (Protease प्रकार XIV Streptomyces griseus से) एंजाइम (1 मीटर के बादछ / एमएल घंटी समाधान में) संयोजी ऊतक को पचाने में मदद करता है और एक gentler हदबंदी की सुविधा. आरटी पर एक 30-45 मिनट पाचन हदबंदी के लिए आदर्श है. एक प्रकार की मछली रीढ़ की हड्डी की पूरी एंजाइमी हदबंदी पहले collagenase (2 मिलीग्राम / एमएल, 30 मिनट) और प्रोटीज की अनुक्रमिक उपचार के साथ बाहर किया गया है (2 मिलीग्राम / एमएल, 45 मिनट) रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स 17 अलग करने के लिए. प्रोटीज और collagenase के एक कॉकटेल के साथ इलाज बनाम अनुक्रमिक उपचार reticulospinal axons अलग कर में बेहतर परिणाम उपज नहीं था. हम भी हदबंदी एंजाइमों के विभिन्न सांद्रता के साथ प्रयोग किया. एनजाइम सांद्रता अधिक से अधिक 2 मिलीग्राम / 45 मिनट से अधिक समय मिलीलीटर या पाचन बार अपनी स्थिरता और गरीब dissociations खोने रीढ़ की हड्डी में हुई. छोटे न्यूरॉन्स की पैदावार के लिए आवश्यक हैं जब उच्च एंजाइम सांद्रता और लंबे समय तक इलाज की अवधि के रीढ़ की हड्डी की पूरी हदबंदी में सहायता कर सकते हैं. Reticulospinal axons, इसके विपरीत, एक विस्तारित stru हैcture और 45 मिनट से अधिक उपचार उल्टा थे. बेहतर dissociations रीढ़ की हड्डी में कुछ तनाव एडेड बनाए रखना है.
अगले महत्वपूर्ण कदम reticulospinal axons शामिल क्षेत्र के लिए अंतिम हदबंदी बल को अलग करने के लिए कटा हुआ क्षेत्र के मध्य में एंजाइम का इलाज रीढ़ की हड्डी के टुकड़े के पार्श्व इलाकों में कटौती करने के लिए है. कटौती उन्हें undamaged चित्रा 2 डी छोड़ने reticulospinal axons की केंद्रीय ventro औसत दर्जे स्तंभ को उदर सींग ग्रे मामले के पार्श्व किनारे से विस्तार करना चाहिए. पार्श्व इलाकों काटना यांत्रिक हदबंदी के दौरान हो जाएगा रीढ़ की हड्डी की जुदाई मजबूर और ऊतक का एक चिकनी जुदाई की सुविधा है, जिस पर एक केन्द्र बिन्दु प्रदान करता है. रीढ़ की हड्डी में निरंतर तनाव काटने की प्रक्रिया के दौरान आवश्यक है और खींच और रीढ़ की हड्डी टुकड़ा की दुम और व्याख्यान चबूतरे वाला सिरों लगाए द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. इस स्केलपेल ब्लेड के तहत ऊतक विकृति से बचाता हैऔर axons के फलस्वरूप नुकसान.
हदबंदी में अंतिम चरण यांत्रिक तनाव को लागू करने और धीरे पकड़ करने के लिए ऊतक संदंश का उपयोग 2 ई rostro दुम अक्ष चित्रा साथ ऊतक खींच रहा है. यह कदम बाद में रिकॉर्डिंग के लिए अलग axons की आसंजन अनुमति देने के लिए पाली lysine लेपित coverslips से अधिक किया जाता है. लंबे समय बढ़ाया reticulospinal axons के लिए अधिक से अधिक आसंजन को प्राप्त करने के लिए, हम एक उच्च आणविक भार का इस्तेमाल किया है (> 300,000) पाली डी lysine hydrobromide, कोट, coverslips और पेट्री डिश insets लगाव अंक की अधिक से अधिक संख्या प्रदान करता है. रीढ़ की हड्डी में समाप्त होता है और तीव्रता से पृथक reticulospinal axons के लिए पाली lysine लेपित सतह पर्याप्त आसंजन प्रदान करता है. यह dissociations बाधा नियमित स्टेनलेस स्टील संदंश को मजबूती से चिपक जाती है क्योंकि Teflon लेपित संदंश पकड़ के लिए रीढ़ की हड्डी के लिए आवश्यक हैं. ऊतक धीरे धीरे बढ़ाया और धीरे सपा से बाहर axons खींच किया जाना चाहिएinal कॉर्ड. axons बसने के लिए प्राप्त करने के लिए सबसे अच्छा तरीका रीढ़ की हड्डी संदंश के साथ समाप्त होता है व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम रीढ़ की हड्डी पर नीचे दबाव बनाए रखने के द्वारा हदबंदी की प्रक्रिया के दौरान हर समय गिलास coverslip साथ समाप्त होता बनाए रखने के लिए है.
अक्षतंतु के कुछ हिस्से हदबंदी की सीमा के आधार पर रीढ़ की हड्डी अंत की न्यूनतम एक छोर पर अंदर रहता है के बाद से axons सबसे अच्छा आंशिक रूप से अलग रूप में वर्गीकृत किया जाता है. Isolations यंत्रवत् रीढ़ की हड्डी के एक छोर से पूरी तरह से अलग axons तक रीढ़ की हड्डी के दोनों सिरों को अलग से बाहर किया जा सकता है. इस मामले में, अक्षतंतु के एक हिस्से को शेष भाग रीढ़ की हड्डी इंटीरियर के बाहर अलग है, जबकि यह उभर जहाँ से रीढ़ की हड्डी अंत के अंदर रहता है. axons की टर्मिनल खुला अंत अक्षतंतु के स्वास्थ्य के आधार पर एक झिल्ली resealing प्रक्रिया द्वारा जवानों. Isolations भी axons रीढ़ की हड्डी, ख से बाहर उभरने कि इस तरह बाहर किया जा सकता है2 ई चित्रा दुम और पृथक reticulospinal axons के माध्यम से जुड़े रहने रीढ़ की हड्डी की चोंच पर समाप्त होता है ut. इस बिंदु पर, धीरे दबाव रिहा तनाव के तहत axons आराम करने के लिए और पाश बाहर पोस्टअन्तर्ग्रथनी अनुमानों से रहित axons की अलग क्षेत्रों से बेदखल की अनुमति देता है. दोनों हदबंदी तकनीक कार्यात्मक axons उपज. एक प्रकार की मछली के लिए शारीरिक तापमान 10 डिग्री सेल्सियस है और इसलिए तैयारी axons तीव्र हदबंदी से उबरने के लिए अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए 10 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करने के लिए अनुमति दी है. Electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए, हदबंदी एक कस्टम चैम्बर चित्रा में डाला पाली lysine लेपित coverslip पर बाहर किया गया था 3. एक प्रकार की मछली रीढ़ की हड्डी डोरियों आम तौर से गुजर से 10 डिग्री सेल्सियस तक precooled घंटी समाधान, perfusing द्वारा 10 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया है एक शीतलक डिवाइस. असाधारण कम पृष्ठभूमि शोर एक चैनल सीए को हल करने के लिए आवश्यक है उच्च + K (30 मिमी KCl) एफएम डाई में शामिल किया है (धारा 4.1), ताकि axons बिगाड़ना लिए किया जाता हैअन्तर्ग्रथनी EXO-endocytosis दौरान vesicles. यह अक्षतंतु स्थिति में थोड़ी सी बहाव अक्षतंतु से दूर जाना इलेक्ट्रोड का कारण बनता है के रूप में लंबे समय के लिए पृथक axons में एक microelectrode की प्रविष्टि को बनाए रखने के लिए मुश्किल है. यह मुश्किल एक microelectrode का उपयोग लंबी अवधि के लिए axons को प्रोत्साहित करने के लिए बनाता है. बड़े अक्षतंतु व्यास (20-50 माइक्रोन) यह मुश्किल एक टंगस्टन उत्तेजना इलेक्ट्रोड का उपयोग को प्रोत्साहित करने के लिए बनाता है. इसलिए उच्च कश्मीर + axons बिगाड़ना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. reticulospinal axons में presynaptic टर्मिनलों 1-2 माइक्रोन की एक व्यास है. सीए 2 + धाराओं presynaptic टर्मिनलों पर रिलीज अंकित झिल्ली के लिए स्थानीयकृत रहे हैं और यह सही प्रीसानेप्टिक टर्मिनल लक्षित करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है. इसलिए, ये रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता माइक्रोन वेतन वृद्धि में पैच पिपेट स्थिति के आंदोलन में हेरफेर करने में सक्षम किया जा रहा है. सीए प्रीसानेप्टिक रिहाई अंकित झिल्ली में 2 + धाराओं demonstrat किया गया हैcalyceal synapses में एड 0.5 पीए से भी कम, आयाम में बेहद छोटा हो. सीए के एक चैनल रिकॉर्डिंग 2 + धाराओं इसलिए बेहद कम पृष्ठभूमि शोर स्तर की आवश्यकता होती है. कम थर्मल शोर एक Axopatch 200B एम्पलीफायर और एक ठंडा headstage के साथ हासिल की थी. इसके अलावा, शोर से दूषित सूत्रों व्यवस्थित पहचान और सफाया करने की आवश्यकता है. पैच pipettes कांच बेहद कम दोष और उच्च प्रतिरोधकता के बाद से कम शोर करने के लिए सुनिश्चित aluminosilicate ग्लास से, गढ़े गए थे. pipettes विंदुक टिप व्यास, जिससे पूरी तरह से प्रीसानेप्टिक टर्मिनल शामिल प्रीसानेप्टिक टर्मिनल के व्यास से बड़ा था कि इस तरह बनाए गए थे, जिनमें से आयाम स्पष्ट रूप से एफएम 1-43 लेबलिंग द्वारा मनाया जा सकता है. इस पूरे रिहाई अंकित झिल्ली से रिकॉर्डिंग सुनिश्चित की. कैपेसिटिव शोर संभव के रूप में टिप के करीब PDMS साथ पिपेट कोटिंग से कम हो गया था. प्रीसानेप्टिक टर्मिनल झिल्ली पर gigaohm जवानों लंबे प्रति के लिए स्थिर नहीं हैंiods और रिकॉर्डिंग आम तौर पर 2 मिनट की एक अधिकतम पिछले. यह कम सफलता दर सफल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए प्रयास की एक बड़ी संख्या जरूरी बाद से प्राप्त करने के लिए रिकॉर्डिंग अत्यंत कठिन बना देता है. रिकॉर्डिंग समाधान ऐसे वोल्टेज gated ना + और + K चैनल और सीए के रूप में presynaptic टर्मिनल झिल्ली में अन्य सभी ज्ञात धाराओं + चैनल 2 + -activated कश्मीर अवरुद्ध कर रहे हैं इतना है कि सीए 2 + धाराओं की रिकॉर्डिंग की अनुमति, डिजाइन किया जाना है. इस तैयारी के साथ पाली lysine चिपकने वाली सतह का उपयोग करने के लिए कुछ सीमाएं हैं. एक किसी भी कंपन तैयारी बाधित क्योंकि तैयारी युक्त कक्ष के भौतिक स्थान को स्थानांतरित करने में असमर्थता है. चिपकने वाली सतह की एक और सीमा 4% paraformaldehyde में incubated जब व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम रीढ़ की हड्डी अंत टुकड़े आसंजन खो के रूप में, immunohistochemistry प्रयोगों के दौरान खुला था. हम वैकल्पिक चिपकने वाला सीओए की कोशिश की हैइस तरह के सेल तक के रूप में सी चीज़ें और इसी तरह के मुद्दों का सामना करना पड़ा. इन समस्याओं को हल करने के लिए, हम रीढ़ की हड्डी संभालती प्रत्यय तरल सीवन गोंद का इस्तेमाल किया. सीवन गोंद के उपयोग के संबंध में बारीकियों चेन और फेयथेरस्टोन 22 से एक पिछले जौव लेख में चर्चा की गई है. गोंद द्विसंयोजक आयनों के बिना समाधान में एक धीमी दर से सेट और हम उस संपत्ति का फायदा उठाया और सीए 2 + और 2 मिलीग्राम + बिना घंटी समाधान में dissociations बाहर किया. इस हदबंदी की प्रक्रिया के दौरान ऊतक के हेरफेर के लिए अतिरिक्त समय के साथ हमें प्रदान की है. हम हदबंदी (प्रोटोकॉल खंड 5.2) प्रदर्शन से पहले हदबंदी सतह पर विशिष्ट लक्षित क्षेत्र पर गोंद लागू करने के लिए पैच पिपेट से जुड़े एक ट्यूबिंग के माध्यम से पैच pipettes और मुंह चूषण का उपयोग कर चेन और फेयथेरस्टोन 22 के लिए एक समान दृष्टिकोण अपनाया. फर्क सिर्फ इतना है रीढ़ की सी है कि होने के साथ, जैसा कि पहले बताया dissociations प्रदर्शन किया गयाORD सिरों धीरे पहले से रखा गोंद (प्रोटोकॉल खंड 5.3) से अधिक संभाल अंत खींचकर हदबंदी की प्रक्रिया के दौरान चिपका रहे थे. छिड़काव और तैयारी से हदबंदी पूरा किया गया एक बार, द्विसंयोजक आयन मुक्त घंटी समाधान सीए 2 + और मिलीग्राम से युक्त घंटी समाधान के लिए विमर्श किया गया था 2 + आयनों से पहले एक शीतलक प्लेट पर 20-30 मिनट के लिए 10 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करने के लिए अनुमति दी गई थी immunohistochemistry के बाद के चरणों को आगे बढ़ने से. इस तकनीक की कुंजी निहितार्थ पूरी तरह से अनुसंधान के दशकों के बावजूद हल नहीं किया गया, जो न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के लिए सीए 2 + आवश्यकता का एक सटीक समझ है. प्रीसानेप्टिक में एक क्षणिक वृद्धि [2 Ca +] सभी synapses में रिहाई को ट्रिगर करने के लिए महत्वपूर्ण होने के रूप में स्थापित किया गया है. हालांकि, आम सहमति अभी भी सीए 2 + डोमेन gating relea के लिए योगदान है कि सीए 2 + चैनलों की संख्या पर कमी हैएसई. व्यक्तिगत presynaptic टर्मिनलों की रिहाई अंकित झिल्ली में सीए 2 + धाराओं और समाई माप का एक साथ माप इस सवाल का स्पष्ट जवाब प्राप्त होगी. इसके अलावा, यह synaptic देरी का एक सटीक उपाय, सक्रिय करने के प्रीसानेप्टिक सीए 2 + प्रविष्टि और पुटिका संलयन के बीच समय के रिश्ते की व्याख्या के लिए सक्षम होगा. व्यक्तिगत presynaptic टर्मिनलों पर रिलीज अंकित झिल्ली को अप्रतिबंधित अभिगम्यता न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज प्रक्रिया के विभिन्न घटकों का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की एक संख्या लागू करने की क्षमता प्रदान करता है. इस तरह के दृष्टिकोण के उदाहरण synaptic पुटिका संलयन अध्ययन करने के लिए क्वांटम डॉट्स का उपयोग कर एक पुटिका इमेजिंग शामिल हैं. पुटिका संलयन घटनाओं को भी सीधे पुटिका संलयन घटनाओं आबाद कि झिल्ली समाई परिवर्तन को मापने के द्वारा presynaptic टर्मिनलों पर लक्षण वर्णन किया जा सकता है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Syringe filter | EMD Millipore | SLGV004SL | |
| 22 x 60 mm Coverslips | Fisherbrand | 12545J | |
| Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
| Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
| Antifreeze | Prestone | ||
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7660 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Bright field light source | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Cover slip | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9559 | |
| Digital CCD Camera | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
| Dissection fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dissection microscope | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Dissection scissors fine | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Dissection scissors ultra fine | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| High vacuum grease | Dow-Corning | ||
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA-56-500 | |
| Immersion oil | Fisher-Scientific | M2000 | |
| Industrial grade nitrogen gas tank | Praxair | UN1066 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Liquid suture glue | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
| Non-fat dry milk | Cell Signaling Technology | 9999S | |
| P-87 Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Perfusion pump | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
| Petri dish 100 x 15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher-scientific | 875712 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300,000 |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Primary antibodies R-type calcium channel | Alomone Labs | ACC-006 | |
| Protease Type XIV from Streptomyces Griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500240 | |
| Schot Duran Pressure Bottle | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
| Silicone tubing for glue application | Cole-Palmer | 07625-26 | |
| Slicing base plate | Leica Biosystems | 14046327404 | |
| Slicing chamber | Leica Biosystems | 14046230132 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide | S8045 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | B3545 | |
| Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 160 | To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 184 | To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight |
| Teflon coated forceps | Fine Science Tools | 11626-11 | |
| Tricaine methanesulphonate | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vibratome blades | World Precision Instruments | BLADES | |
| Xenon lamp | Nikon |
References
- Katz, B., Miledi, R. The timing of calcium action during neuromuscular transmission. Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).
- Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain. Nature. 384 (6605), 170-172 (1996).
- Augustine, G. J., Adler, E. M., Charlton, M. P. The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals. Annals of the New York Academy of Sciences. 635, 365-381 (1991).
- Zucker, R. S. Calcium and transmitter release. Journal of Physiology Paris. 87 (1), 25-36 (1993).
- Delaney, K. R., Shahrezaei, V. Uncaging Calcium in Neurons. Cold Spring Harbor protocols. (12), (2013).
- Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. G. Methods for patch clamp capacitance recordings from the calyx. Journal of Visualized Experiments. (6), 244 (2007).
- Stanley, E. F. The calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion as a model of fast cholinergic transmission. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 70, S73-S77 (1992).
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