ヤツメウナギ網様体軸索の急性解離は、個別の機能シナプス前終末のリリース顔膜から録音を有効にする方法

Abstract

シナプス伝達は非常に迅速なプロセスである。シナプス前末端へのCa ^{2 +}の流入を駆動する活動電位は、リリースの顔膜に位置する電位依存性カルシウムチャネル（VGCCs）を介して、小胞融合及び神経伝達物質の放出のためのトリガーである。シナプス伝達の迅速性に不可欠な活動電位、VGCCsの到着と、神経伝達物質放出機構との間の空間的および時間的な同期性がある。直接個別のシナプス前終末の放出面膜からのCa ^{2 +}電流を記録する機能は、シナプス前のCa ^{2 +}および神経伝達物質放出の間の関係を正確に理解するために不可欠である。電気生理学的記録のためのシナプス前のリリースの顔膜へのアクセスは、ほとんどの準備とシナプス前カルシウムでは使用できません²⁺エントリはイメージング技術と巨視的現在measuremeを使用して特徴付けられているNTS - CA ^{2 +}エントリーを視覚化するのに十分な時間分解能を持っていない技術。直接単シナプス前終末でのVGCCsの特徴付けは中枢シナプスでは不可能であったため、これまで成功した唯一のニワトリ毛様体神経節の萼型シナプスにおいて、ラットの腎杯に達成されている。私たちは、成功したシナプス後構造を欠いた機能的なシナプス前終末の孤立網様体軸索をもたらす脊髄の急性解離準備を開発することにより、ヤツメウナギの脊髄の巨大な網様体シナプスでこの問題に対処してきた。私たちは、蛍光標識し、個別のシナプス前終末を識別し、記録のためにそれらをターゲットにすることができます。この調製物を用いて、免疫組織化学および電気生理学的手法を用いて個別のシナプス前終末の放出面に直接VGCCsを特徴としている。のCa ^{2 +}電流は、リリースの顔膜Oに直接記録されていますfは個別のシナプス前終末、中枢シナプスで実施された最初のこのような記録。

Introduction

シナプス伝達は非常に迅速で正確なプロセスである。シナプス前終末の活動電位侵入は、シナプス前カルシウム結果として生じる増加、レリーズ顔膜に位置VGCCsの開口部につながる^{2 +}小胞融合および神経伝達物質の放出¹のトリガとして機能する。これらのステップのすべてがマイクロ秒^2、数百内で発生するため、小胞融合機構³にVGCCsの緊密な空間結合を必要とします。シナプス前のCa ^{2 +}フラックスは、主にカルシウム^{2 +}感受性色素^4を用いてアプローチ撮影により特徴付けられている。シナプス前ニューロン中のCa ^{2 +を}調節組み込むのCa ^{2 +}緩衝液は、間接的に、シナプス前カルシウムおよび神経伝達³との間の関係を特徴付けるために使用されている。また、カルシウム^{2 + 5}アンケージングまたはmacroscopiを記録することにより、シナプス前遊離Ca ^{2 +}濃度を調節することのCa ^{2 +} cの電流は小胞融合および/ ​​または放出の尺度と組み合わせて使用されている;そのような静電容量測定⁶または後シナプス応答と同じ問題に対処するために^2。しかし、カルシウムを直接解放面で^{2 +}電流、膜の脱分極は、シナプス小胞融合及び神経伝達物質の放出をトリガするのCa ^{2 +}電流に変換されるシナプス前膜の特殊なセクションを特徴付ける、カルシウムの正確な測定値を得るために不可欠な²⁺シナプス小胞の融合のための要件。また、直接小胞融合および放出の正確な同時測定と相まって個体シナプス前終末でのCa ^{2 +}電流を特徴付ける能力は、活動電位、シナプス前のCa ^{2 +}電流の時間的経過の間のタイミング関係の正確な解明を可能にし、小胞融合および放出。リリース面膜へのアクセスシナプス後樹状突起により並置を閉じるによるシナプス前末端の大部分では使用できません。それは個人のシナプス前終末での電流を直接測定を防ぐため、このアクセ​​ス不能にVGCCsの特性評価における主要な障害となっている。個別のシナプス前終末におけるシナプス前のCa ^{2 +}電流の直接の特徴付けは、これまで中枢シナプスでは不可能であった2つだけ腎杯型シナプス前終末に達成された。ニワトリ毛様体神経節^7-10およびラット腎杯^11,12の萼型シナプス。ヤツメウナギの脊髄¹³内の巨大な網様体シナプスを含む他のすべてのシナプス前終末では、シナプス前のリリースの顔膜へのアクセスの欠如は、シナプス前のCa ^{2 +}フラックスを研究するために、例えばCa ^{2 +}イメージングなどの間接的なアプローチの使用を必要としている。

図1：ヤツメウナギ巨人網様体シナプス。（a）はヤツメウナギの脊髄の断面は背腹方向を示す。網様体軸索は緑のアスタリスクでマークされます。シナプス後ニューロン¹³の上に（緑色の矢印で示される）シナプス前網様体軸索パッサン接点EN数多くのことを示すヤツメウナギの脊髄における網様体シナプスの（b）の 3次元復元。シナプス後ニューロンがアレクサフルオロ568ヒドラジド（赤）で満たされているが、シナプス前終末には、アレクサフルオロ488ヒドラジド結合ファロイジン（緑色）で標識されている。

吻側-尾側軸を図1aに脊髄並列の腹側領域に位置ヤツメウナギ巨大な網様体軸索、ニューロン上にパッサンシナプスの連絡先専用のフォームに複数の脊髄前角¹⁴ 図1bは ^13。巨視的全細胞のCa ^{2 +}電流は、無傷の脊髄^13,15に網様体軸索から記録されています。しかし、Caを直接測定で前回のブラインドの試みは、細胞結合型パッチクランプ法を用いて、無傷のヤツメウナギの脊髄における網様体軸索内^{2 +}電流が原因の対向シナプス後のプロセスによるシナプス前のリリースの顔膜へのアクセスの欠如に¹³失敗したことが証明されている図1b。レリーズ顔膜は以前に、シナプスの機械的摂動前に^12を記録するか、機械的解離¹⁶と連結酵素処理にシナプス後ニューロン¹¹を除去することによってアクセス可能とされています。脊髄の複雑な組織を考慮すると、シナプス後ニューロンを識別し、機械的にそれを撤回または番目を撹乱することは極めて困難で証明する電子シナプス。したがって、私たちは機械的解離に続いて酵素処理^17を使用することにしました。

このアプローチを使用して、私たちはそれによって個人のシナプス前終末への無制限のアクセスを提供し、あらゆるシナプス後のプロセスを欠いた機能的なシナプス前終末で実行可能な孤立網様体の軸索が得ヤツメウナギの脊髄の急性解離準備を開発しました。標準の倒立顕微鏡と蛍光画像と一緒に、それが細胞-を使用して記録するためのCa ^{2 +}電流は図4c及び図4dに分離する記録液を含んだパッチピペットを用いて、同定および個別の蛍光同定シナプス前終末を標的にすることを可能添付の電圧クランプ法。のCa ^{2 +}電流は、個別のシナプス前終末図4fのシナプス前のリリース面膜に直接記録されている。これはsignificaですそれは中枢シナプスで実施された最初のこのような記録であるので、シナプス伝達の分野では画期的なヌクレオチド。

Protocol

ポリ-D-リジン臭化水素酸塩の調製

1. 0.1Mホウ酸緩衝液（pH8.5）で1 mg / mlのポリ-D-リジン臭化水素酸塩を準備します。
2. -20℃で分注し店。

カバーガラスの2。ポリリシンコーティング

注：層流チャンバー内のすべてのクリーニングおよびコーティングステップを実施する。

1. 2時間、1N塩酸（HCl）を含むペトリ皿にカバースリップを置きます。
2. 吸引し、すべてのHClおよび70％エタノール（エタノール）2〜3倍で洗い流して。
3. 1時間70％エタノールにしておきます。
4. 吸引するすべての70％エタノール、100％エタノール2〜3倍でリンスすること。
5. 2時間の100％EtOH中のままにしておきます。すべてのエタノールを吸引。
6. 数秒間濾紙空気乾燥で乾燥したブロット。
7. 1 mg / mlのポリ - リジン溶液中の場所O / N。
8. ミリポア水4-5x翌日カバーグラスをすすぐ。
9. エアドライポリリジンは、クリーンシャーレにガラスローラーのカバースリップをコーティングした。
10. immunohistochemistr用yは、35×10ミリメートルペトリ皿の蓋を使用します。 0.3センチメートルの厚さに皿に30°CO / Nに設定することができます：SYLGARDを準備（polydimethylsilioxane、PDMS）は、PDMS（1重量エラストマーを、エージェント10を硬化させること）に注ぐことによって料理を並んでいた。これが設定された後、PDMSにはめ込み1センチメートルによって2cmにカット。カバースリップのために上記と同様の手順に従ってポリリジンで清掃やコートのインセット。
11. 使用するまで層流室内に覆われた店舗ポリリジンコーティングしたカバーガラスや食器（2週間までが、3〜4日ごとに定期的に調製することにより、最良の接着剤の結果を得る）。
12. 振動組織スライサーで脊髄ピンに、PDMSブロックを準備します。 1重量：エラストマーAとエラストマーB 1を混ぜる。 100×15mmのペトリ皿に注ぎ、30℃でO / Nを設定することを可能にする。 PMDSの長方形の部分をカットし、エポキシ接着剤を使用して、スライスベース板に接着する。接着剤が所定の位置に、PDMSを固定設定することができ、フラットを取得するために表面から複数の薄い部分をスライス上の組織をピンするために表面。

ヤツメウナギ脊髄の3。急性解離は孤立網様体軸索を得た

1. トリカインメタンスルホネート（; 100 mg / LのMS-222）とammoecoeteまたは成体ヤツメウナギ（Petromyzonマリナス ） を麻酔。犠牲にするヤツメウナギを含む、蓋で覆われたプラスチック製のカップに、水の中に麻酔薬を追加します。
2. のCaCl _2、1.8 130のNaCl、2.1のKCl、2.6のMgCl _{2、4、HEPES、4}ブドウ糖液（pH7.6、浸透圧270 mOsmで）と本体を削除します（単位：mm）以下の組成の低温（4℃）リンゲル液でヤツメウナギを斬首壁の筋肉は、脊髄の背側表面を露出させる。
3. 細かい鉗子を用いて脊髄の後面から髄膜のプリミティバを削除します。この段階では腹側髄膜のプリミティバを削除しないでください。
4. 1cmの長さの断片に脊髄を切断します。
5. PDMSはベースナンプラーをスライス並んで、背側を上に向け、細かい虫ピンを使用して、脊髄片をピン氷のように冷たいリンゲル溶液を含む振動組織スライサー室のTE（2.12を参照）。
6. 解離プロセス図2aと図2b中にハンドルとして機能するように終わり頭側と尾側に無傷の背柱部を残して、ブレードで吻側-尾側軸に沿ってスライスして、脊髄の後柱の中央部分を削除します。スライスとその下の網様体、軸索損傷のない列図2bを残すのみ脊柱を除去し、深さの設定を可能にする最も遅い速度設定を使用してください。
7. エルManira＆Bussièresから適応（リンゲル液に1 mg / mlのプロテ​​アーゼ（ストレプトマイセス·グリセウスからタイプXIV）および（クロストリジウムヒストリからタイプI-A）調製した1 mg / mlのコラゲナーゼのカクテルで45分間RTでスライスし、脊髄片をインキュベート、1997 17）。
8. PDMS微細ピンを使用してピン酵素処理脊髄片をシャーレコンタライニングining冷（4℃）リンゲル液。
9. 細かい鉗子で腹髄膜のプリミティバを削除します。
10. 脊髄図2dに無傷の網様体の軸索の中央列を残してスライスした背側部分の中間に外科用メスの刃で脊髄の横管をカット。
11. レンズにイマージョンオイルの滴を置きます。
12. 記録チャンバー図3のスロットにポリリジンコーティングしたカバーガラス（ 図3a、トップピース、赤い四角形）を配置し、シールを容易にするために、すべてのエッジ（ 図3aの赤と青の矩形間の空間に真空グリースを適用します。ネジ所定の位置にトップは、記録リグ上の挿入図にチャンバーを配置します。
13. パスツールピペットを用いて記録チャンバにリンゲル液を加える。
14. 熱電冷却デバイスの入力チューブに不凍液を含む耐圧ビンの流出チューブを接続します。 OUTPを接続します外側冷却ジャケットの入力端とリザーバ図3bの出力端に熱電冷却素子のut個のチュービング。
15. 記録チャンバーで一度に脊髄の一枚を置き、静かに軸索が分離されるまで、 図2eおよび図2fはテフロンコーティングされた鉗子を用いてすべての回でカバーガラスに沿って、それを維持し、脊髄を分離する。
16. 記録チャンバー図3bの外側の冷却ジャケットを介して、熱電冷却装置を介して、（置換により）不凍液加圧（ボトル内に押し込まれる窒素ガス）を通過させることにより10°Cまで記録液温度をもたらす。
17. 軸索は10℃で1時間後に解離回復できるようにします。

（a）の除去。矢印は、組織のスライスの方向を示している。アルファベットのV（赤フォント色）による腹側角ながら背側ホーンは、アルファベットのD（赤フォントの色）でマークされています。（b）の後柱は網様体軸索（緑の線が露出脊髄の中央部分では削除）。スライス工程後に無傷のまま腹側角は、アルファベットV（赤のフォント色）によってマークされている。（c）のプロテアーゼおよびコラゲナーゼで45分間処理はカクテル（1mg / ml）を酵素。横管（d）の切断脊髄;位置、方向、横方向の切り込みの程度を示す。（e）の脊髄の機械的解離。矢印は、鉗子および解離時の剥離力の方向の位置を示す。（f）に Representati解離した網様体軸索準備の例をVEの。緑の矢印は、任意のシナプス後のプロセスなしに急性解離し網様体の軸索の領域をマークします。

電気生理学実験用のチャンバーを記録する図3の回路図。提供さ寸法はインチです。 （a）は basepiece図に示されている赤い長方形がbasepieceにおけるカバースリップの溝にカバースリップの位置を示している。高真空グリースを適用した場合の（a）basepiece図に示す赤と青の長方形の間の領域であり、（b）は、組み立てられた記録チャンバーを示している。

FM 1-43と4。標識およびシナプス前終末の同定

1. VへのFM 1-43を組み込むことによって、シナプス前終末にラベルを付ける高K +脱分極時にシナプスエキソサイトーシスの間にesicles。 （30 mMのKClを含む5ミリリットルリンゲル溶液中）、5μMのFM 1-43と準備を灌流。
2. 1 mg / mlのAdvasep-7（5ミリリットルリンゲル溶液中で）過剰FM色素を除去する^）18を有する調製物を灌流。
3. どんなremant染料とAdvasepをウォッシュアウトするための15分間のリンゲル液で準備を灌流。
4. デジタルCCDカメラおよび画像取得ソフトウェア细と組み合わせて倒立蛍光顕微鏡上で100×の油浸レンズ（NA 1.25）を有する画像、標準的な蛍光イメージングプロトコルを使用して。
5. 図4c及び図4dを記録するために標的とするように、蛍光標識されたシナプス前終末を特定します。

孤立網様体軸索の5。免疫組織化学

1. 二価イオン（カルシウム^{2 +}およびMg ^{2 +）}を無料でディッシュインセット（プロトコルセクション2.10。）フィルリンゲル液。
2. P-87マイクロピペットプラーでパッチピペットを作製。 （シリコーンチューブを0.89ミリメートル吸引端に取り付けられたマイクロピペットチップと内径を用いて）パッチピペット（外径1.5mmのガラス）と吸引を使用して、ポリリジンインセットの一方の端部に縫合糸少量の接着剤を配置する。
3. プロトコルセクションで3 図2のように同じ手順を使用して解離を行ってください。やさしく表面に強く接着させる鉗子で縫合糸糊とプレスで脊髄の一方の端を置きます。インセットのもう一方の端に縫合糸接着剤の別のドロップを置き、静かに軸索が解離されるまで、脊髄を伸ばし、縫合のりの上に静かにドラッグすることで自由な脊髄端を接着する。穏やかに鉗子で押し下げて所定の位置に固定してください。
4. 為替価は、灌流による定期的なリンゲル液でリンゲル液を解放する。
5. 軸索は20分後にdissoc回復することを許可する10℃でiation。
6. 4％パラホルムアルデヒド（PFA）中で解離軸索を修正20分間{リン酸緩衝生理食塩水（PBS、（mM）の塩化ナトリウム137、塩化カリウム2.7のNa ₂ HPO ₄ 10 KH ₂ PO ₄ 1.8、pH7.4）中で調製した}。 0.2μMのシリンジフィルターを通過することによって使用前にPFA溶液を濾過する。
7. 10分間（PBS中）0.1Mグリシンを灌流することにより、PFAを洗浄する。
8. 10分間（PBS中）0.1％トリトン-Xでインキュベートする。
9. 20分間、PBSを灌流することによって洗浄する。
10. 4℃で6時間（PBS中）を5％無脂肪乳でブロックする。
11. 興味のあるVGCCに一次抗体で[追加（PBS中1：200希釈）と4℃で20時間インキュベートする。
12. 20分間、PBSを灌流することによって洗浄する。
13. 4℃で10分間（PBS中）の5％無脂肪乳でブロックする。
14. 二次抗体で[追加（PBS中1：400希釈）と4℃で2時間、暗所でインキュベートする。
15. 20分間PBSで灌流により洗浄する。
16. 1％ウシ血清Albuでブロック20分間分（PBS中）。
17. アレクサフルオロ488ファロイジン（5単位/μlの作業濃度を、メタノール200単位/ mlの準備の株式）を追加します。
18. 20分間PBSで灌流により洗浄する。
19. 共焦点顕微鏡で100倍の水浸レンズを用いた画像。

6。電気生理学的記録

1. P-87マイクロピペットプラーでアルミノシリケートガラスパッチピペット（ピペット抵抗2-5MΩ）を作製。ピペットチップ全体シナプス前終末径を包含するように、設計上のパッチピペット。
2. PDMS ²³に50〜60 psiの圧力下でパッチピペットを浸漬することによってPDMS被覆パッチピペット（パッチピペットのバックエンドへの窒素ガスシリンダに接続された内径を、シリコンチューブを取り付け0.89ミリメートル）および熱を使用して乾燥させる銃。代わりに、手動で複合顕微鏡の下で可能な限り先端に近いコーティングを適用したPDMSでコーティングピペット、。
3. MICRを使って火ポリッシュパッチピペットoforge（複合顕微鏡のステージに取り付けた特注のプラチナフィラメント）。
4. 蛍光顕微鏡でラベルされたシナプス前終末を示す孤立軸索を識別します。
5. 記録液を充填します。注射器を使用したパッチピペットに（CA ^{2 +}電流を分離するために設計された電荷キャリアとして10mMのCaCl ₂または90 mMののBaCl _2を 、HEPESは、pH 7.6、浸透圧270 mOsmでバッファリング）。
6. 電動マニピュレータMP225を使用して、お風呂の上にピペットホルダーとの位置にパッチピペットを挿入します。静かに、蛍光識別されたシナプス前末端の顔に対してバス、所定の位置にパッチピペットを下げる。
7. 接触が膜で行われるまで、ゆっくりとパッチピペットを進める。この時点で、ピペットホルダに取り付けられたチューブを介して穏やか口吸引によりギガオームのシールを達成する。
8. Aを使用する、単一チャンネルのCa ^{2 +}電流を記録するのに必要な極めて低いバックグラウンドノイズレベルを達成するために録音のために冷却ヘッドステージとxopatch 200B。 5kHzのベッセルフィルタを用いて、20〜50 kHzとフィルタのサンプルデータ。 Axograph Xを使用してデータ収集を行う
9. 刺激としては10mV刻みで、標準的な段階プロトコルを使用してください。のCa ^{2 +}チャネルの最大活性化を確実にするために、段階プロトコルの前に、プロトコルにプレパルスを組み込む。リーク電流の分析後の減算ステッププロトコルに10 mVのリークステップを組み込む。

Representative Results

この解離プロトコル利回り健康的で機能的な孤立網様体シナプス後突起図2fの欠いた軸索が、それにもかかわらず、誘発シナプス小胞のエキソサイトーシスおよび図4cと図4d可能な官能シナプス前終末を保持している。網様体軸索の隔離領域の切片は、明らかに網様体軸索膜図2fにへの無制限のアクセスを可能にする任意の他の神経のプロセスを明確になるように光学顕微鏡下に同定することができる。軸索は、解離後の構造的完全性を保持している。単離された軸索は、細胞全体の構成でパッチを適用し、アレクサフルオロ488ヒドラジドを充填した。軸索のない色素漏出内に均一に分布色素は、軸索図4aから観察された。

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図孤立網様体軸索から4。代表的な録音。全細胞構成におけるパッチピペットでアレクサフルオロ488ヒドラジドで満たされた（a）の単離された網様体軸索。ピペット位置は白い矢印で示されている。 の（b）は、i。代表活動電位が分離された網様体軸索中で焼成。 II。無傷の脊髄網様体軸索中で焼成代表活動電位。黒い矢印は、刺激の時点を示している。（c）及び（d）FM 1-43とシナプス前終末の点状標識化を示す、セルに接続されたパッチの記録のためのパッチピペットを用いて個別のシナプス前末端の標的化単離された網様体脊髄軸索の2つの画像を。白い矢印は、パッチピペットをマークしながら、緑の矢印は、個別のシナプス前終末をマーク。（e）のデッドindiscrを示す網様体軸索を隔離軸索を通してFM 1-43のiminate取り込み。 4F。複数のCa ^{2 +}チャネルの開口を示すシナプス前のリリース顔膜からのCa ^{2 +}電流（10 mMのの[Ca ^{2 +]}パッチピペット内の記録液中の_外部 ）のセルに接続された記録を示す代表的な例。実線は、破線はチャネル開口部のためのガウスピークを示しながら0は、チャネルの閉じた状態を示すマーク。

急性解離した軸索は、電気的特性を保持する。静止膜電位（RMP）は、微小電極と解離した軸索を突き刺すことにより、または電流クランプモードで全細胞構成における軸索にパッチを適用することによって測定することができる。同様RMPSは-57.94±1.63 mVのた（n = 17軸索）の平均で、両方の方法で記録されている。また、軸索は活動電位を発射するために刺激され得る解離は、活動電位が匹敵するの形状と時間経過と、 図4b一つに無傷の脊髄網様体軸索中で焼成。

小胞融合およびリサイクルが解離した軸索に固執。リサイクル小胞のクラスターは、高カリウム（30のKCl）刺激¹⁹の間、スチリル色素FM 1-43で標識することができる。染料クリアランス際に、シナプス前終末の別個の点状標識は、無傷の脊髄¹³における網様体軸索と同様の分布を、 図4c及び図4dを観察することができる。不健康な軸索 ​​は軸索図4eを通じて無差別のFM色素エントリを示すので、FM 1-43染色は、健康と不健康な軸索 ​​との間に明確な区別を提供しています。明らかに個人のシナプス前終末を同定する能力は、私たちは図4c及び図4dを記録するためのパッチピペットでそれらをターゲットにすることができます。この能力を利用して、私たちは、リリース面mから直接のCa ^{2 +}電流を記録している単一シナプス前終末図4fの embrane。

急性孤立網様体軸索調製物はまた、単一のシナプス前終末の免疫組織化学のために無傷の脊髄に比べて明確な利点を提供しています。バックグラウンドの自己蛍光及びシナプス後構造やグリア上の染色の欠如の欠如が特定され、シナプス前終末（ 図5b、i）における抗体標識の明確な同定を可能にする。そのようなアレクサ-488結合ファロイジン（ 図5a、ii）及びシナプス前アクチンラベル^20（ 図5b、ii）のようなシナプス前マーカーと相まって、シナプス前終末への免疫組織化学的ラベリングの局在は明らかに（ⅲ、 図5a）を証明することができる。このアプローチは、tで示す異なるVGCCサブタイプの免疫組織化学的特徴付けを行うために、共焦点顕微鏡法と併せて使用されているシナプス前終末の図5aに相続人固有のローカライゼーション。

孤立網様体軸索の図5。免疫染色。 （a）個体シナプス前末端にR型（CaV2.3）カルシウムチャネルの免疫組織化学的特性評価。私。 （ - ウサギホスト）ポリクローナル一次抗体は、ドメインII及びR型カルシウムチャネルのIIIとの間の細胞内ループ中のエピトープを標識した。二次抗体は、アレクサフルオロ633ヒドラジド結合ヤギ抗ウサギIgGであった。 II。シナプス前アクチンのアレクサフルオロ488ファロイジン標識により識別されるシナプス前終末。 III。 R型抗体標識（赤色）とマージされたオーバーレイに示すのAlexa-488ファロイジン（緑色）との間の共局在。 の（b）は、i。抗R型カルシウムチャネル抗体のプレインキュベーションと対照抗原は、カルシウムチャネルの任意の特異的標識を生じない。 II。離散点状の標識を示す同じ軸索のためのシナプス前終末のアレクサフルオロ488ファロイジンラベリング。

Discussion

当社の解離プロトコルは、シナプス後突起図2fの欠い孤立網様体の軸索を生じすることによって重要であるが、それでも機能的なシナプス前終末の図4c及び図4dに保持している。シナプス前終末に反対するシナプス後のプロセスが存在しないことは、以前に、中枢シナプスの可能性に成功のみ2腎杯型シナプス前終末に達していない単一のシ​​ナプス前終末におけるシナプス前のリリースの顔膜への直接記録へのアクセスを許可する。ニワトリ毛様体神経節^7-10およびラット腎杯^11,12の萼型シナプス。電子顕微鏡レベルでの単純な単一の活性領域^21を提示することが示されている個別のシナプス前終末には、FM 1-43で標識リサイクル小胞のクラスターによって識別され、記録図4c及び図4dの対象とすることができる。カルシウム図4fの放出面膜に記録することができる。これは中央のシナプスにおける最初のこのような記録であるとして、直接個別のシナプス前終末の解放面膜からのCa ^{2 +}電流の記録は重要です。準備の生理的関連性は、軸索が無傷の脊髄網様体軸索の端末と同様の特性を持つシナプス前終末からの録音を可能にし、解離した後に機能を保持しているという事実によって強調される。また、網様体軸索におけるシナプス前のCa ^{2 +}トランジェントは急性的に解離された軸索から得られた結果を検証するための基準となるカルシウムイメージング¹³を通してインタクトヤツメウナギの脊髄に特徴付けられている。

機能的なシナプス前終末で孤立網様体軸索を得るための鍵は、評論家の一連にありら順次ステップ。脊髄図1aの背内側領域内に主に位置する巨大な軸索 ​​の急性解離を妨げる組織は、振動組織スライサー図2aに最初に除去されなければならなかった。これは、簡単に機械的に最小限の力を用いて脊髄を解離することができる。残りの背側髄膜のプリミティバがブレードの切断作用を妨げるので、脊柱のスライスは、背側髄膜のプリミティバの完全な除去が必要です。私たちは、スライス時の脊髄上の腹側髄膜のプリミティバを残すことは脊髄の形状を維持するのに役立ちますし、より良いスライスを支援することがわかります。スライス工程中に脊髄の張力を維持することは軸索を損傷する刃の下の組織のいずれかの横方向の動きや衝突を防ぐことができます。長さ1cm、脊髄片組織のようスライスするための良い長さが伸びおよびw張力を維持釘付けにすることができます提供していhileスライス。監視するためのもう一つの重要な要因は、スライスの深さである。浅すぎスライスは網様体軸索スライスダメージ深すぎるながら脊髄の良好な分離を防ぐことができます。良いスライス深さは、脊柱が損傷していない腹側網様体の列を残して目に見えて取り出されたものである。スライスの深さは、動物間の脊髄の厚さにばらつきがある与えられたスライス工程中に測られなければならない。項目ごとに分割せ吻側および尾側解離プロセス図2eの間に組織を把持するためのハンドルとして機能するように終了することが可能にするように脊柱の除去が最善の脊髄片図2bの中央部分で行われる。

脊柱、コラゲナーゼの混合物を用いてスライスし、脊髄片の治療（クロストリジウムヒストリからコラゲナーゼタイプI-A）を除去した後、およびプロテアーゼ（ストレプトマイセス·グリセウスからのプロテアーゼタイプXIV）酵素（1メートルμg/ mlのリンゲル溶液中）の結合組織を消化を助け、穏やかな解離を容易にします。 RTで30〜45分間消化が解離するのに最適です。ヤツメウナギ脊髄の完全な酵素的解離は、以前脊髄ニューロン^17を分離するためにシーケンシャルコラゲナーゼ処理（2 mg / mlで、30分）およびプロテアーゼ（2 mg / mlで、45分）で行われた。プロテアーゼとコラゲナーゼのカクテルを用いた治療に対するシーケンシャル治療は網様体軸索を解離でより良い結果が得られませんでした。また、解離酵素の異なる濃度で実験を行った。 45分より長い2 mg / mlのまたは消化倍よりも高い酵素濃度は、その一貫性と貧弱な解離を失って脊髄をもたらした。小さいニューロンの収量が必要な場合に、より高い酵素濃度および長期の治療期間は、脊髄の完全な解離を支援可能性があります。網様体脊髄軸索は、対照的に、拡張STRUを持つ影と45分よりも大きい治療は逆効果だった。より良い解離を支援し、脊髄の一部の緊張を保持。

次の重要なステップは、網様体軸索を包含する領域に、最終的な解離力を分離するためにスライスした領域の中間点で酵素処理脊髄片の横管をカットすることです。カットは、彼らに損傷を受けていない図2dを残す網様体軸索の中央腹、内側の列に前角灰白質の側縁から拡張する必要があります。横管をカットする機械的解離の際に発生する脊髄の分離を強制し、組織のスムーズな分離を容易にするに焦点を提供しています。脊髄の持続的張力は、切断プロセスの間に必要とされる延伸および脊髄片の尾側及び吻側端部を固定することによって達成することができる。これは手術用メスの刃の下に組織変形を防止と軸索の結果として起こる損傷。

解離の最終ステップは、機械的な張力をかけ、ゆっくりと把持する組織を鉗子を用いて2E吻側-尾側軸を図に沿って組織を伸ばしている。このステップは、次の記録のために分離された軸索の接着を可能にするために、ポリリジンコーティングしたカバースリップ上で実行されている。長い拡張網様体軸索のためのより大きな接着性を達成するためには、高分子量を使用していた（平均> 300,000）、ポリ-D-リジン臭化水素酸塩、コーティングするために、カバーガラスシャーレインセットの付着点をより多く提供する。脊髄が終了し、急性孤立網様体軸索のためのポリリジンコーティングされた表面には、十分な接着性を提供します。それは解離を妨げる規則的なステンレス製の鉗子にしっかりと付着するため、テフロンコーティングされた鉗子はグリップに脊髄を必要としている。組織は、SPからの軸索を引いて、ゆっくり、ゆっくりとストレッチしなければならないノミナルコード。軸索は落ち着くために取得するための最良の方法は、脊髄をピンセットで終わる吻側および尾側の脊髄に下向きの圧力を維持することによって、解離プロセス中にすべての回でカバーガラスに沿って終わる維持することである。

軸索の一部が解離の程度に応じ脊髄端部の最小一端で内側ままであるので軸索は、最良の部分的に単離されたとして分類される。アイソレーションは、機械的に脊髄の一端から完全に分離するまで軸索脊髄の両端を分離することによって行うことができる。この場合には、軸索の一部が残りの部分は、脊髄内部から隔離されている間に出射する脊髄端の内側に残る。軸索の末端開口端は、軸索の健康に応じて、膜再封鎖プロセスによって密封する。アイソレーションはまた軸索は、脊髄、10bから出現れるように行うことができる単離された網様体脊髄軸索によって接続されたまま脊髄の尾側及び吻側端部をUT 2eは図 。この時点で、優しく圧力を解放すると、張力下で軸索がシナプス後の突起のない軸索の分離領域をもたらすからリラックスしてループすることができます。どちらの解離技法は、機能軸索をもたらす。ヤツメウナギのための生理的温度は10℃であり、したがって製剤は、軸索は、急性解離から回復することを可能にするために1時間10℃で回復させる。電気生理学的記録のために、解離がカスタムチャンバー図に挿入されたポリ-リシン被覆カバースリップ上で実施した3。ヤツメウナギ脊髄は、一般的に通過することにより10℃に予備冷却リンゲル液、灌流によって10±2℃に維持されている熱電冷却装置。例外的に低いバックグラウンドノイズは、シングルチャネルのCaを解決するために必要とされる

FM色素が中に組み込まれるように、高K ^+（30mMのKClを）、軸索（4.1節）を脱分極するために使用されているシナプスエキソサイトーシスの間に小胞。これは、軸索位置のわずかなずれが軸索から後退する電極を引き起こすように長期間のために単離した軸索微小電極の挿入を保持することが困難である。これは、困難な微小電極を使用して長時間軸索を刺激することができる。大軸索直径（20-50μm）は、それが困難なタングステン刺激電極を使用して刺激することができる。したがって高K ^+が軸索を脱分極するために使用された。網様体軸索におけるシナプス前終末には1〜2ミクロンの直径を有する。

のCa ^{2 +}電流は、シナプス前終末での放出面膜に局在している、それが正確にシナプス前終末をターゲットにすることが重要です。したがって、これらの記録を達成するための重要な要件は、ミクロン単位でパッチピペット位置の移動を操作することができるされている。シナプス前のリリース面膜でのCa ^{2 +}電流がdemonstratてきた腎杯シナプスにおけるedは0.5 Paより少なく、振幅が極端に小さくなるように。のCa ^{2 +}電流の単一チャネル記録、したがって非常に低いバックグラウンドノイズレベルを必要とする。低い熱雑音はAxopatch 200B増幅器および冷却ヘッドステージで達成された。さらに、ノイズの混入して源を系統的に識別し、排除する必要がある。パッチピペットは、ガラスは極めて低い不純物および高抵抗率を有するので、低ノイズを確保するためにアルミノシリケートガラスから製造した。ピペットは、ピペット先端の直径は、それによって完全にシナプス前終末を包含するシナプス前末端の直径よりも大きくなるように作成された、寸法が明確にFM 1-43標識により観察することができる。これは全体のリリース面膜から録画を確実にした。容量性ノイズを可能な限り先端に近くPDMSピペットをコーティングすることによって減少した。シナプス前末端の膜でのギガオームシールは、長い間あたりのために安定していないのIODとの録音は、一般的に2分の最大値を持続。低い成功率が成功した記録を得るための試みが多数必要となるので、これは得ることが録音が非常に困難にする。録音ソリューションは、電位依存性Na ⁺及びK ⁺チャネル、Ca等シナプス前末端の膜内の他のすべての既知の電流が⁺チャネル²⁺活性Kがブロックされているように、カルシウム^{2 +}電流の記録を可能に設計されなければならない。

この製剤でポリリジン粘着面を使用することにはいくつかの制限があります。一つは、任意の振動が準備破壊ための準備を含むチャンバの物理的な位置を移動させることができないことである。接着面の別の制限は、4％パラホルムアルデヒド中でインキュベートした場合吻側および尾側の脊髄エンドピースが接着力を失うように、免疫組織化学実験中に発見された。私たちは、代替接着CoAを試してみましたそのような細胞に徳としてティンズと同様の問題が発生しました。これらの問題を解決するために、本発明者らは、脊髄のハンドルを固定するために縫合糸液体接着剤を使用した。縫合接着剤の使用に関する詳細はChenとフェザーストーン²²による以前のJoveの記事で議論されてきた。接着剤二価イオンなしの溶液中での遅い速度でセットとは、私たちは、そのプロパティを利用したおよびCa ^{2 +}およびMg ^{2 +}なしでリンゲル液中で解離を実施しました。これは解離過程の間に組織を操作するための追加の時間を提供してくれました。私たちは、解離（プロトコルセクション5.2）を実行する前に、解離表面上の特定のターゲット領域上に接着剤を適用するためにパッチピペットに接続されたチューブを通してパッチピペットと口の吸引を使用して、Chenとフェザーストーン²²と同様のアプローチを採用した。唯一の違いは、脊椎Cことであると、前述のように解離を行ったORDの端を静かに以前に置か糊（プロトコルセクション5.3）を介してハンドル端をドラッグして、解離プロセス中に貼付された。灌流および製剤による解離が完了したら、二価イオン、遊離リンゲル液は、Ca ^{2 +}およびMgを含有するリンゲル液に交換し^{2 +} ​​イオンは、前に熱電冷却プレート上で20〜30分間、10℃で回復させた免疫組織化学のその後の工程に進む。

この技術の重要な含意は完全に研究の数十年にもかかわらず、解決されていない神経伝達物質の放出のためのCa ^{2 +}の要件を正確に理解している。シナプス前の[Ca ^{2 +]}の一過性の増加は、すべてのシナプスでの放出をトリガするために不可欠であるとして確立されている。しかし、コンセンサスは依然としてのCa ^{2 +}のドメインゲーティングreleaに寄与するのCa ^{2 +}チャネルの数に不足しているSE。個別のシナプス前終末の解放面膜でのCa ^{2 +}電流および容量測定の同時測定がこの質問に明確な答えをもたらすであろう。さらに、シナプス遅延の正確な測定を可能にする、シナプス前のCa ^{2 +}エントリーおよびベシクル融合の間のタイミング関係の解明を可能にする。個別のシナプス前終末での放出面膜への無制限のアクセス可能性は、神経伝達物質放出過程のさまざまなコンポーネントを研究するために、異なる実験アプローチの数を適用する機能を提供します。このようなアプローチの例としては、シナプス小胞の融合を研究するために、量子ドットを用いた単一の小胞イメージングが含まれています。小胞融合事​​象は、直接小胞融合事​​象の根底に膜キャパシタンスの変化を測定することによって、シナプス前終末で特徴付けることができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm Syringe filter	EMD Millipore	SLGV004SL
22 x 60 mm Coverslips	Fisherbrand	12545J
Advasep-7	Cydex Pharmaceuticals	ADV7
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379
Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen/Life Technologies	A21070
Antifreeze	Prestone
Boric acid	Sigma-Aldrich	B7660
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Bright field light source	Dolan-Jenner	Fiberlite 180
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Cover slip	Fisher-Scientific	12-545-J
Dextrose	Sigma-Aldrich	D9559
Digital CCD Camera	Hamamatsu	C8484-03G01
Dissection fine forceps	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-20
Dissection microscope	Leica Biosystems	Leica MZ 12
Dissection scissors	Fine Science Tools	15025-10
Dissection scissors fine	Fine Science Tools	91500-09
Dissection scissors ultra fine	Fine Science Tools	15000-08
FM 1-43	Invitrogen/Life Technologies	T3163
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523
High vacuum grease	Dow-Corning
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA-56-500
Immersion oil	Fisher-Scientific	M2000
Industrial grade nitrogen gas tank	Praxair	UN1066
Insect pins	Fine Science Tools	26002-10
Liquid suture glue	Braun Veterinary Cair Division	8V0305	The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M2670
Methanol	Sigma-Aldrich	154903
Non-fat dry milk	Cell Signaling Technology	9999S
P-87 Micropipette puller	Sutter Instruments
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Perfusion pump	Cole-Palmer	Masterflex C/L
Petri dish 100 x 15 mm	Fisher-Scientific	875712
Petri dish 35 x 10 mm	Fisher-scientific	875712
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1024	MW > 300,000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Primary antibodies R-type calcium channel	Alomone Labs	ACC-006
Protease Type XIV from Streptomyces Griseus	Sigma-Aldrich	P5147
Scalpel blades	World Precision Instruments	500240
Schot Duran Pressure Bottle	Fisher-Scientific	09-841-006
Silicone tubing for glue application	Cole-Palmer	07625-26
Slicing base plate	Leica Biosystems	14046327404
Slicing chamber	Leica Biosystems	14046230132
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide		S8045
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	B3545
Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 160	To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 184	To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight
Teflon coated forceps	Fine Science Tools	11626-11
Tricaine methanesulphonate	Sigma-Aldrich	A5040
Vibratome blades	World Precision Instruments	BLADES
Xenon lamp	Nikon