Abstract
La transmission synaptique est un processus extrêmement rapide. potentiel d'action entraînée afflux de Ca2 + dans la terminaison présynaptique, à travers les canaux calciques voltage-dépendants (VGCCs) situés dans la membrane de la face de sortie, est le déclencheur de la fusion des vésicules et la libération de neurotransmetteurs. Cruciale pour la rapidité de la transmission synaptique est la synchronisation spatiale et temporelle entre l'arrivée du potentiel d'action, VGCCs et le mécanisme de libération de neurotransmetteur. La possibilité d'enregistrer directement des courants Ca2 + de la membrane de presse du visage de terminaux présynaptiques individuels est indispensable pour une compréhension précise de la relation entre présynaptique Ca2 + et la libération de neurotransmetteurs. L'accès à la membrane libération présynaptique visage pour l'enregistrement électrophysiologique n'est pas disponible dans la plupart des préparations et Ca 2 + présynaptique entrée a été caractérisé en utilisant des techniques d'imagerie et MeasureMe courant macroscopiquents - techniques qui n'ont pas une résolution temporelle suffisante pour visualiser Ca l'entrée. La caractérisation de VGCCs directement à terminaisons présynaptiques simples n'a pas été possible dans les synapses centrales et a jusqu'ici été atteint avec succès que dans la synapse de type calice du ganglion ciliaire poussin et dans les calices de rat. Nous avons abordé ce problème avec succès dans la synapse réticulo géant de la lamproie de la moelle épinière par le développement d'une préparation très dissociés de la moelle épinière qui donne axones réticulospinaux isolés avec des terminaux présynaptiques fonctionnelles dépourvues de structures post-synaptiques. Nous pouvons fluorescence étiqueter et identifier les terminaux présynaptiques individuels et les cibler pour l'enregistrement. Utilisation de cette préparation, nous avons caractérisé VGCCs directement à la face de sortie de terminaux présynaptiques individuels en utilisant l'immunohistochimie et d'électrophysiologie approches. Ca2 + courants ont été enregistrés directement à la libération visage membrane oterminaisons présynaptiques individuels f, le premier enregistrement à effectuer au niveau des synapses centrales.
Introduction
La transmission synaptique est un processus extrêmement rapide et précise. Action éventuelle invasion de la terminaison présynaptique conduit à l'ouverture de VGCCs situés dans la membrane de presse du visage, l'augmentation résultante présynaptique Ca2 + agissant comme déclencheur pour la fusion des vésicules et la libération de neurotransmetteurs 1. Toutes ces étapes se produisent dans des centaines de microsecondes 2, et donc nécessitent un couplage spatial serré de VGCCs à la fusion des vésicules machines 3. Présynaptiques flux de Ca2 + ont été caractérisées principalement par imagerie approches utilisant des colorants sensibles 4 de Ca. L'incorporation de Ca2 + tampons qui modulent Ca2 + dans les neurones présynaptiques a été utilisée pour caractériser la relation entre indirectement calcium présynaptique et la neurotransmission 3. En outre, la modulation de la concentration de Ca2 + libre présynaptique par uncaging Ca2 + 5 ou enregistrement macroscopic courants de Ca2 + ont été utilisés en conjonction avec les mesures de fusion et / ou la libération des vésicules; telles que les mesures de capacité 6 ou post-synaptiques réponses 2 pour répondre à la même question. Cependant, la caractérisation de Ca2 + courants directement à la face de sortie, la section spécialisée de la membrane présynaptique où dépolarisation de la membrane est traduit en Ca2 + courants de déclenchement fusion des vésicules synaptiques et la libération de neurotransmetteurs, fait partie intégrante de l'obtention d'une mesure précise de la Ca2 + exigence de fusion des vésicules synaptiques. En outre, la capacité à caractériser directement Ca2 + courants à terminaisons présynaptiques individuels, couplé permet avec des mesures simultanées précises de la fusion des vésicules et la libération d'une explication précise de la relation de synchronisation entre l'évolution dans le temps du potentiel d'action, présynaptique Ca2 courant, la fusion des vésicules et la libération. L'accès à la membrane de presse de visagen'est pas disponible dans la plupart des terminaisons présynaptiques en raison de fermer l'apposition par les dendrites post-synaptiques. Cette inaccessibilité a été un obstacle majeur dans la caractérisation des VGCCs car elle empêche des mesures directes de courant dans les terminaux présynaptiques individuels. La caractérisation directe de présynaptiques Ca2 + courants dans les terminaux présynaptiques individuels a donc pas été possible dans les synapses centrales et n'a été atteint que dans deux terminaux présynaptiques de type calyceal; calice de type synaptique des poussin ganglion ciliaire 7-10 et rat calices 11,12. Dans tous les autres terminaux présynaptiques dont la synapse réticulo géant dans la lamproie moelle épinière 13, le manque d'accès à la membrane libération présynaptique visage a nécessité l'utilisation d'approches indirectes telles que Ca de l'imagerie pour étudier présynaptiques flux de Ca2 +.
Figure 1 lamproie géante synapse réticulo. (A) Section de la lamproie de la moelle épinière pour indiquer l'orientation dorso-ventral. Axones réticulospinaux sont marqués avec astérisque vert. (B) la reconstruction 3-D de la synapse réticulo dans la lamproie moelle épinière montrant axone présynaptique réticulo faire de nombreux contacts en d'Passant (indiqués par des flèches vertes) sur le neurone post-synaptique 13. Terminaisons présynaptiques ont été marquées avec Alexa Fluor 488 hydrazide phalloïdine conjuguée (vert), alors que le neurone post-synaptique a été rempli avec Alexa Fluor 568 hydrazide (rouge).
Lamproie géants axones réticulospinaux, situés dans la région ventrale de la moelle épinière parallèle à la rostrale-caudale axe Figure 1a, forme multiple en contacts synaptiques sur les neurones Passant de lacorne ventrale de la moelle 14 Figure 1b 13. Cellules entières macroscopique Ca2 + courants ont été enregistrés à partir des axones réticulospinaux dans la moelle épinière intacte 13,15. Cependant, les tentatives précédentes aveugles à la mesure directe de Ca2 + courants dans les axones réticulospinaux à la lamproie moelle épinière intacte en utilisant la technique de patch-clamp cellule attachée se sont révélées inefficaces 13 en raison du manque d'accès à la membrane libération présynaptique de visage grâce à des processus post-synaptiques opposées Figure 1b. La membrane de la face de presse a été préalablement rendu accessible en enlevant le neurone post-synaptique 11, la perturbation mécanique de la synapse 12 avant l'enregistrement ou le traitement enzymatique associée à la dissociation mécanique 16. Compte tenu de l'organisation complexe de la moelle épinière, il s'avérerait extrêmement difficile d'identifier le neurone post-synaptique et retirer mécaniquement ou perturber ee synapse. Par conséquent, nous avons décidé d'utiliser un traitement enzymatique 17 suivie par dissociation mécanique.
En utilisant cette approche, nous avons développé une préparation très dissociés de la lamproie de la moelle épinière qui donne viables axones réticulospinaux isolés avec des terminaux présynaptiques fonctionnelles dépourvues de tout processus post-synaptiques, fournissant ainsi un accès illimité aux terminaisons présynaptiques individuels. En collaboration avec un microscope standard inversé et l'imagerie de fluorescence, il nous permet d'identifier et de cibler les terminaux présynaptiques par fluorescence identifié individuels, avec une pipette de patch contenant une solution d'enregistrement qui isole Ca2 + courants figure 4C et la figure 4d, pour l'enregistrement en utilisant Cell- attaché technique voltage-clamp. Ca2 + courants ont été enregistrés directement sur la membrane de presse du visage présynaptique des terminaisons présynaptiques individu Figure 4f. Il s'agit d'une significant percée dans le domaine de la transmission synaptique, car il est le premier enregistrement à effectuer au niveau des synapses centrales.
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Protocol
1 Préparation de la poly-D-lysine de bromhydrate
- Préparer 1 mg / ml de bromhydrate de poly-D-lysine dans 0,1 M de tampon borate (pH 8,5).
- Aliquote et conserver à -20 ° C.
Revêtement 2 Poly-lysine de Lamelles
Remarque: effectuer toutes les étapes de nettoyage et de revêtement dans une chambre à flux laminaire.
- La place des lamelles dans une boîte de Pétri contenant acide chlorhydrique 1 N (HCl) pendant 2 heures.
- Aspirer HCl et rincer à l'éthanol à 70% (EtOH) 2-3x.
- Laisser EtOH à 70% pendant 1 heure.
- Aspirer EtOH à 70% et rincer à 100% EtOH 2-3x.
- Laisser EtOH à 100% pendant 2 heures. Aspirer tout EtOH.
- Sécher avec du papier filtre et l'air sec pendant quelques secondes.
- Lieu O N en 1 mg ml de solution / / poly-lysine.
- Rincer lamelles de lendemain avec Millipore 4-5x de l'eau.
- Air poly-lysine sec revêtu lamelles sur des rouleaux de verre dans une boîte de Petri propre.
- Pour immunohistochemistry, utiliser 35 x 10 mm boîte de Petri couvercles. Préparer Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) bordée plats en versant PDMS (élastomère et de l'agent de durcissement 10: 1 en poids) dans le plat à une épaisseur de 0,3 cm et laisser reposer à 30 ° CO / N. Une fois que cela a pris, coupez les en 2 cm par 1 cm incrustés dans les PDMS. Nettoyer et enduire le médaillon de poly-lysine suivant les mêmes étapes comme mentionné ci-dessus pour lamelles.
- Magasin lamelles et des plats revêtus de poly-lysine couverts à l'intérieur de la chambre à flux laminaire jusqu'à utilisation (jusqu'à 2 semaines, mais d'atteindre de meilleurs résultats adhésives en préparant régulièrement tous les 3-4 jours).
- Préparer un bloc de PDMS, de la broche de la moelle épinière dans le trancheur de tissu vibrant. Mélange élastomère et un élastomère B de 1: 1 en poids. Verser dans un plat de 100 x 15 mm Petri et laisser reposer O / N à 30 ° C. Coupez un morceau rectangulaire des PMDS et il colle à la plaque de base de tranchage en utilisant de la colle époxy. Laisser sécher la colle fixant les PDMS en place et couper plusieurs sections minces à la surface pour obtenir un platsurface à la broche sur le tissu.
3. aiguë dissociation de la lamproie de la moelle épinière à un rendement isolé axones réticulo
- Anesthésier un ammoecoete ou adulte lamproie (Petromyzon marinus) avec tricaïne méthanesulfonate (MS-222; 100 mg / L). Ajouter anesthésique dans l'eau, dans un gobelet en plastique recouvert par un couvercle, contenant la lamproie à être sacrifié.
- Décapiter lamproie dans le froid (4 ° C) de la solution de Ringer de la composition suivante (en mM): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 CaCl2, 1,8 MgCl 2, 4 HEPES, 4 dextrose (pH 7,6, l'osmolarité de 270 mOsm) et retirer le corps muscles de la paroi afin d'exposer la surface dorsale de la moelle épinière.
- Retirer méninges primitiva de la face dorsale de la moelle épinière à l'aide de pinces fines. Ne retirez pas ventrale méninges primitiva à ce stade.
- Couper la moelle épinière dans 1 cm de long morceaux.
- Epingler un morceau de la moelle épinière à l'aide de fines broches insectes, face dorsale vers le haut, sur un PDMS bordée trancher pla de basete (voir 2.12) dans une chambre de trancheuse de tissu vibrant contenant la solution de Ringer glacée.
- Retirer une partie centrale de la colonne dorsale de la moelle épinière par découpage le long de l'axe rostro-caudal de la lame, laissant les sections intactes de la colonne dorsale de la rostrale et caudale extrémités pour servir de poignées pendant le processus de dissociation figure 2a et la figure 2b. Utilisez le plus lent réglage de la vitesse qui permet le découpage et un réglage de la profondeur qui élimine seulement la colonne dorsale de quitter le sous-jacent colonne axone réticulo Figure 2b en bon état.
- Incuber tranches pièces de la moelle épinière à la température ambiante pendant 45 min dans un cocktail de 1 mg / protéase ml (type XIV de Streptomyces griseus) et 1 mg / ml de collagénase préparé (type IA de Clostridium histolyticum) dans la solution de Ringer (adapté de El Manira & Bussières 1997 17).
- Pièces de la moelle épinière Pin enzyme traitée à l'aide de broches fines dans un PDMS alignés boîte de Petri containing froid (4 ° C) la solution de Ringer.
- Retirer ventrale méninges primitiva avec des pinces fines.
- Couper les secteurs latéraux de la moelle épinière avec une lame de scalpel au milieu de la partie dorsale en tranches quittant la colonne centrale des axones intacts réticulo dans la moelle épinière figure 2d.
- Déposer une goutte d'huile d'immersion sur la lentille.
- Placer la lamelle de poly-lysine recouvert (figure 3a, la pièce supérieure, rectangle rouge) dans la fente de la chambre d'enregistrement Figure 3 et appliquer de la graisse à vide à tous les bords (espace entre les rectangles rouge et bleu sur la figure 3a, pour faciliter un joint d'étanchéité. Vis le haut en place. Placer la chambre dans l'encart sur la plate-forme d'enregistrement.
- Ajouter la solution de Ringer dans la chambre d'enregistrement en utilisant une pipette Pasteur.
- Raccorder le tuyau d'écoulement de sortie de la bouteille sous pression contenant une solution antigel à la tubulure d'entrée du dispositif de refroidissement thermoélectrique. Connectez le output tube du dispositif de refroidissement thermoélectrique à l'extrémité d'entrée de la chemise de refroidissement externe et l'extrémité de sortie du réservoir de la figure 3b.
- Placer un morceau de la moelle épinière à la fois dans la chambre d'enregistrement et séparer en douceur le maintien de la moelle épinière le long de la lamelle couvre-objet à tout moment à l'aide de pinces recouvertes de téflon sont isolés jusqu'à ce que les axones figure 2e et 2f figure.
- Amener la température de la solution d'enregistrement à 10 ° C par passage de la pression (de l'azote gazeux est repoussé dans le flacon) solution antigel (par déplacement), par l'intermédiaire du dispositif de refroidissement thermoélectrique, à travers la chemise de refroidissement externe de la chambre d'enregistrement figure 3b.
- Autoriser les axones de récupérer pendant 1 heure après la dissociation à 10 ° C.
Figure 3 Schéma de la chambre pour des expériences d'électrophysiologie de l'enregistrement. Dimensions fournies sont en pouces. Rectangle rouge montre la basepiece schéma (a) indique le positionnement de la lamelle dans la rainure de la lamelle dans la basepiece. La région entre le rectangle rouge et bleu, représenté sur le schéma de basepiece (a) est l'endroit où la graisse à vide élevé est appliqué. (B) représente la chambre d'enregistrement assemblée.
4. étiquetage et d'identification des terminaux présynaptiques avec FM 1-43
- Étiqueter terminaisons présynaptiques, en incorporant FM 1-43 en vesicles pendant synaptique exo-endocytose en haute dépolarisation K +. Perfuser préparation avec 5 uM FM 1-43 (dans 5 ml de solution de Ringer contenant mM KCl 30).
- Perfuser préparation avec 1 mg / ml Advasep-7 (dans 5 ml de solution de Ringer) pour éliminer le colorant FM excès) 18.
- Perfuser préparation avec la solution de Ringer pendant 15 min au lavage de colorant Remant et la Advasep.
- Image avec 100 X lentille à immersion d'huile (NA 1,25) sur un microscope inversé à fluorescence, en conjonction avec une caméra CCD numérique et l'acquisition d'images microgestionnaire de logiciel, en utilisant des protocoles d'imagerie de fluorescence standard.
- Identifier les terminaisons présynaptiques marquées par fluorescence à cibler pour l'enregistrement de la figure 4c et figure 4d.
5. immunohistochimie de isolés axones réticulo
- Remplissez plat encadré (section Protocole 2.10.) Avec bivalent-ion (Ca2 + et Mg 2 +) libreLa solution de Ringer.
- Fabriquer pipettes de patch dans une micropipette extracteur P-87. Placer une petite quantité de suture de la colle à une extrémité de l'insert de poly-lysine à l'aide d'une pipette de patch (1,5 mm de verre de diamètre externe) et d'aspiration (en utilisant un tube de silicone 0,89 mm de diamètre intérieur avec une pointe de la micropipette fixé à l'extrémité d'aspiration).
- Effectuer dissociations en utilisant la même procédure que mentionné dans la section du protocole 3 de la figure 2. Placez une extrémité de la moelle épinière sur la colle de suture et appuyez doucement avec une pince pour la faire adhérer fortement à la surface. Placer une goutte de colle suture à l'autre extrémité de l'insert et étirer doucement jusqu'à ce que la moelle épinière et les axones sont dissociés adhérer l'extrémité libre de la moelle épinière en le faisant glisser doucement sur la colle de suture. Fixer en place par un pressurage doux vers le bas avec la pince.
- Bourse bivalent libérer la solution de Ringer avec la solution de Ringer régulière par perfusion.
- Autoriser les axones de récupérer pendant 20 min après dissociation à 10 ° C.
- Fixer les axones dissociés dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) {préparé dans le tampon phosphate salin (PBS, (mM) NaCl 137, KCl 2,7, Na 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 1,8, pH 7,4)} pendant 20 min. Filtre PFA solution avant l'utilisation par passage à travers un filtre seringue de 0,2 uM.
- Laver le PFA en perfusant 0,1 M de glycine (dans du PBS) pendant 10 min.
- Incuber à 0,1% de Triton-X (dans du PBS) pendant 10 min.
- Laver en perfusant du PBS pendant 20 min.
- Bloc avec 5% de lait écrémé (dans du PBS) pendant 6 heures à 4 ° C.
- Ajouter à anticorps primaire à CCAGV d'intérêt (dilution 1: 200 dans du PBS) et incuber pendant 20 heures à 4 ° C.
- Laver en perfusant du PBS pendant 20 min.
- Bloc avec 5% de lait écrémé (dans du PBS) pendant 10 min à 4 ° C.
- Ajouter à un anticorps secondaire (1: 400 de dilution en PBS) et incuber dans l'obscurité pendant 2 heures à 4 ° C.
- Laver par perfusion avec du PBS pendant 20 min.
- Bloquer avec 1% de sérum bovin Albumin (dans du PBS) pendant 20 min.
- Ajouter à Alexa Fluor 488 phalloïdine (5 unités / ul concentration de travail; mère préparée dans du méthanol 200 unités / ml).
- Laver par perfusion avec du PBS pendant 20 min.
- Image à l'aide 100X eau lentille à immersion sur microscope confocal.
6. électrophysiologique d'enregistrement
- Fabriquer pipettes de patch en verre aluminosilicate (résistance à la pipette 2-5 MQ) dans un extracteur micropipette P-87. Conception pipette en patch de telle sorte que la pointe de pipette comprend diamètre de terminaison présynaptique entier.
- PDMS patch manteau pipettes par trempage de la pipette de patch sous 50-60 psi de pression dans PDMS 23 (joindre un tube en silicone, 0,89 mm de diamètre intérieur, relié à une bouteille de gaz d'azote, à l'extrémité arrière de la pipette de patch) et séchez-les avec une chaleur pistolet. Alternativement, manteau manuellement la pipette avec PDMS, l'application de revêtement à proximité de la pointe que possible, sous un microscope composé.
- Feu pipettes de patch vernis à l'aide d'un microforge (un filament de platine sur mesure monté sur la scène d'un microscope composé).
- Identifier les axones isolés montrant terminaisons présynaptiques marqués par microscopie de fluorescence.
- Remplir solution d'enregistrement (conçu pour isoler des courants de Ca2 +, 10 mM de CaCl 2 ou BaCl 2 90 mM en tant que porteur de charge, tampon HEPES pH 7,6, osmolarité de 270 mOsm) dans la pipette de patch à l'aide d'une seringue.
- Insérez la pipette en patch dans le porte-pipette et position au-dessus de bain en utilisant un manipulateur MP225 motorisé. Abaissez doucement la pipette de patch dans le bain et la position contre la face d'un terminal présynaptique fluorescence identifié.
- Avancer la pipette de patch lentement jusqu'à ce que le contact est établi avec la membrane. A ce stade, de réaliser un joint d'étanchéité par gigaohm douce bouche d'aspiration à travers un tube relié au support de pipette.
- Pour atteindre les niveaux de bruit de fond extrêmement bas requises pour l'enregistrement monocanal Ca2 + courants, utiliser un Axopatch 200B avec un headstage refroidi pour les enregistrements. Les données d'échantillon à 20-50 kHz et le filtre à l'aide d'un filtre de Bessel 5 kHz. Effectuer l'acquisition de données en utilisant un Axograph X.
- Utilisez un protocole étape standard, par incréments de 10 mV comme stimulus. Intégrer une pré-impulsion dans le protocole précédant le protocole de l'étape, pour assurer activation maximale des canaux de Ca. Intégrer une mV étape 10 de fuite dans le protocole de l'étape de post-analyse soustraction des courants de fuite.
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Representative Results
Ce protocole donne de dissociation sains et fonctionnels axones réticulospinaux isolés dépourvus de post-synaptique projections Figure 2f, mais qui conservent néanmoins des terminaisons présynaptiques fonctionnels capables de vésicule synaptique évoquée exo-endocytose et la figure 4c et figure 4d. Les articles des régions isolées des axones réticulospinaux peuvent être clairement identifiés en microscopie optique d'être clair, d'autres procédés neuronaux permettant un accès illimité à la réticulo membrane des axones Figure 2f. Les axones conservent leur intégrité structurelle après dissociation. Axones isolés ont été corrigés en configuration cellule entière et remplis avec Alexa Fluor 488 hydrazide. Le colorant distribué de façon uniforme à l'intérieur de l'axone et aucune fuite de colorant a été observé à partir de l'axone Figure 4a.
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Figure 4. enregistrements représentatifs de l'axone réticulo isolé. (A) réticulo axone isolé rempli avec Alexa Fluor 488 hydrazide avec une pipette de patch en configuration cellule entière. position de la pipette est indiqué par une flèche blanche. (b) i. Potentiel d'action représentant tiré dans un axone réticulo isolé. ii. Potentiel d'action représentant cuite dans un axone réticulo dans la moelle épinière intacte. Flèche noire indique le point de stimulation de temps. (C) et (d) Deux images d'un axone réticulo isolé montrant l'étiquetage ponctuée de terminaux présynaptiques avec FM 1-43 et le ciblage d'un terminal présynaptique individu avec le patch pipette pour l'enregistrement de patch cellule attachée. Les flèches vertes marquent terminaisons présynaptiques individuels tout en flèche blanche marque la pipette de patch. (E) Morte isolé axone réticulo montrant indiscrincorporation iminate de FM 1-43 tout au long de l'axone. 4f. Exemple représentatif montrant enregistrement cellule attachée de courants de Ca2 + (10 mM de [Ca2 +] externe à la solution d'enregistrement dans la pipette de patch) de la membrane libération présynaptique de la face montrant l'ouverture de plusieurs canaux Ca2 +. Ligne solide marqué 0 indique l'état fermé du canal, tandis que les lignes pointillées indiquent les pics de Gauss pour les ouvertures de canal.
Axones très dissociés conservent des propriétés électriques. Potentiel de repos de la membrane (RMP) peut être mesurée en l'empalant l'axone dissocié avec une micro-électrode ou par une correction de l'axone en configuration cellule entière en mode pince de courant. PGF similaires sont enregistrés dans les deux méthodes, avec une moyenne de -57,94 ± 1,63 mV (n = 17 axones). En outre, dissociées axones peuvent être incités à tirer des potentiels d'action figure 4b, avec le cours de forme et le temps du potentiel d'action est comparableà un feu dans un axone réticulo dans la moelle épinière intacte.
La fusion des vésicules et le recyclage persistent dans les axones dissociées. Grappes recyclage des vésicules peuvent être étiquetés avec le colorant styryle FM 1-43 en haute potassium (KCl mM 30) stimulation 19. Sur un dégagement de colorant, distinct étiquetage ponctuée de terminaux présynaptiques peut être observée Figure 4c et 4d figure, avec une distribution semblable à axones réticulospinaux dans la moelle épinière intacte 13. FM 1-43 coloration fournit une distinction claire entre les axones sains et malsains comme axones malsaines montrent aveugle entrée de colorant FM tout au long de l'axone figure 4e. La capacité d'identifier clairement les terminaux présynaptiques individuelles nous permet de les cibler avec une pipette de patch pour l'enregistrement de la figure 4c et figure 4d. L'utilisation de cette capacité, nous avons enregistré Ca2 + courants directement à partir de la libération visage membrane de simple terminaisons présynaptiques Figure 4f.
La préparation de l'axone réticulo aiguë isolé offre également des avantages distincts par rapport à la moelle épinière intacte pour l'immunohistochimie de terminaisons présynaptiques simples. L'absence de toute auto-fluorescence de fond et l'absence de coloration sur des structures ou des cellules gliales post-synaptiques permet d'identifier sans équivoque de l'étiquetage des anticorps dans les terminaux présynaptiques identifiés (figure 5b, i). Couplé avec un marqueur présynaptique comme Alexa-488 conjugué phalloïdine (figure 5a, ii) et (figure 5b, ii), qui marque l'actine présynaptique 20, localisation de marquage immunohistochimique de terminaisons présynaptiques peut être clairement démontré (figure 5a, iii). Cette approche a été utilisée en conjonction avec la microscopie confocale pour effectuer la caractérisation immunohistochimique des différents sous-types de CCAGV montrant théritier localisation spécifique à présynaptique bornes figure 5a.
Figure 5 Immunocoloration d'un axone réticulo isolé. (A) la caractérisation immunohistochimique de type R (CaV2.3) des canaux calciques présynaptiques sur les bornes individuelles. i. Un anticorps primaire polyclonal a été utilisé pour marquer un epitope dans la boucle intracellulaire entre les domaines II et III du canal calcique de type R (hôte - lapin). L'anticorps secondaire était Alexa Fluor 633 hydrazide chèvre conjugué anti-IgG de lapin. ii. Terminaisons présynaptiques identifiés par Alexa Fluor étiquetage 488 phalloïdine de l'actine présynaptique. iii. La colocalisation entre-type de marquage de l'anticorps R (rouge) et la phalloïdine Alexa-488 (vert) présentée dans une superposition fusionnée. (B) i. La préincubation de l'anticorps du canal calcique de type R par contreantigène de contrôle ne donne pas de marquage spécifique des canaux calciques. ii. Alexa Fluor étiquetage 488 phalloïdine de terminaux présynaptiques pour le même axone montrant discret étiquetage ponctuée.
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Discussion
Notre protocole de dissociation est importante en cédant axones réticulospinaux isolés dépourvus de post-synaptique projections Figure 2f, mais qui conservent néanmoins fonctionnelle présynaptique bornes Figure 4c et figure 4d. L'absence de processus post-synaptiques qui s'opposent à la terminaison présynaptique permet l'accès de l'enregistrement direct sur la membrane libération présynaptique visage dans les terminaux présynaptiques simples, auparavant pas possible dans les synapses centrales et réalisé avec succès en seulement deux terminaisons présynaptiques de type calyceal; calice de type synaptique des poussin ganglion ciliaire 7-10 et rat calices 11,12. Terminaisons présynaptiques individuels, qui ont été présentés au niveau de la micrographie électronique à présenter de simples zones, seules actives 21, peuvent être identifiés par recyclage de l'étiquetage des grappes de vésicules avec FM 1-43 et ciblés pour l'enregistrement et la figure 4c figure 4d. Californie
La clé pour obtenir des axones réticulospinaux isolés avec des terminaux présynaptiques fonctionnels réside dans une série de porte-paroleal étapes séquentielles. Tissu empêcher la dissociation aiguë des axones géants situés principalement dans la région dorso-médial de la moelle épinière Figure 1a a dû être retiré en premier dans un vibrant trancheuse de tissus Figure 2a. Cela rend plus facile à dissocier mécaniquement la moelle épinière à l'aide de la force moins possible. Le découpage de la colonne dorsale exige l'élimination complète de la primitiva dorsale méninges puisque tout reste dorsale méninges primitiva ferait obstacle à l'action de coupe de la lame. Nous constatons que la méninge laissant primitiva ventral de la moelle épinière au moment de la découpe permet de maintenir la forme de la moelle épinière et contribue à une meilleure coupe. Le maintien de tension dans la moelle épinière pendant le processus de tranchage empêche tout mouvement latéral ou incidente du tissu sous la lame qui endommagerait les axones. 1 cm de long morceaux de la moelle épinière offre une bonne longueur pour couper le tissu peut être étiré et épinglé en maintenant la tension wtranchage ien. Un autre facteur essentiel de surveiller est la profondeur de la tranche; trop peu profonde une tranche empêche une bonne séparation de la moelle épinière pendant trop profonds dommages une tranche les axones réticulospinaux. Une bonne profondeur de coupe est celui où la colonne dorsale est enlevé, laissant visiblement la colonne réticulo ventrale en bon état. La profondeur de la tranche doit être calibré pendant le processus de découpage étant donné qu'il existe des variations dans l'épaisseur de la moelle épinière de l'animal. Le retrait de la colonne dorsale est conduite de préférence dans la partie médiane de la moelle épinière pièce de la figure 2b, car elle permet non tranchée et la rostrale caudale se termine à servir de poignées pour saisir le tissu au cours du processus de dissociation de la figure 2e.
Après retrait de la colonne dorsale, le traitement des morceaux de tranches de moelle épinière avec un mélange de collagénase (collagénase type IA à partir de Clostridium histolyticum) et la protease (type XIV de la protéase de Streptomyces griseus), des enzymes (1 mg / ml dans une solution de Ringer) aide à digérer le tissu conjonctif et facilite une dissociation douce. Une digestion de 30 à 45 min à température ambiante est idéal pour la dissociation. Dissociation enzymatique complète de la moelle épinière lamproie a déjà été effectuée avec de la collagénase des traitements séquentiels (2 mg / ml, 30 min) et la protease (2 mg / ml, 45 min) afin d'isoler les neurones spinaux 17. Traitements séquentiels par rapport à un traitement avec un cocktail de protéase et de la collagénase n'ont pas donné de meilleurs résultats à dissocier axones réticulospinaux. Nous avons également expérimenté avec différentes concentrations des enzymes de dissociation. Les concentrations d'enzyme supérieure à 2 mg / ml ou digestion fois plus longtemps que 45 minutes ont donné lieu à la perte de la moelle épinière et sa consistance dissociations pauvres. Les concentrations d'enzyme plus élevées et des périodes de traitement prolongées peuvent contribuer à la dissociation complète de la moelle épinière, des rendements de plus petites lorsque les neurones sont nécessaires. Axones réticulospinaux, en revanche, ont une stru étendumage et les traitements de plus de 45 min ont été contre-productif. En conservant une certaine tension dans la moelle épinière assistée meilleurs dissociations.
L'étape suivante consiste à découper les faisceaux latéraux des pièces de la moelle épinière traitée avec des enzymes au milieu de la région des tranches pour isoler la force de dissociation finale de la région englobant réticulo axones. Les coupes devraient s'étendre du bord latéral de la corne ventrale de matière grise dans la colonne de ventro-médian central des axones réticulospinaux les laissant intacte la figure 2d. Couper les voies latérales fournit un point focal à ce qui a forcé la séparation de la moelle épinière se produira lors de la dissociation mécanique et facilite une séparation en douceur du tissu. Tension soutenue dans la moelle épinière est nécessaire pendant le processus de coupe et peut être obtenu en étirant et en plaquant les extrémités caudale et rostrale de la pièce de la moelle épinière. Cela évite la déformation des tissus sous la lame de scalpelet les dommages consécutifs à des axones.
La dernière étape de la dissociation applique une tension mécanique et lentement le long de l'étirement du tissu de la rostro-caudal figure 2e axe en utilisant une pince pour saisir le tissu. Cette étape est réalisée sur des lamelles revêtues de poly-lysine pour permettre l'adhésion des axones séparés pour l'enregistrement ultérieur. Afin de parvenir à une plus grande adhérence pour les longs axones réticulo prolongées, nous avons utilisé une masse moléculaire élevée (> 300 000), la poly-D-lysine bromhydrate, ce qui offre une plus grande nombre de points de fixation, pour enrober les lamelles et les insertions de boîte de Pétri. La surface revêtue de poly-lysine offre une adhérence suffisante pour la moelle épinière se termine et les axones réticulospinaux isolés de manière aiguë. Téflon forceps enrobés sont requis pour saisir la moelle épinière car il colle fermement à pinces en acier inoxydable réguliers entravant dissociations. Le tissu doit être étiré lentement et en tirant doucement les axones de la spcordon inal. La meilleure façon d'obtenir les axones de s'installer est de maintenir la moelle épinière se termine le long de la lamelle de verre à tout moment pendant le processus de dissociation en maintenant la pression à la baisse sur la moelle épinière rostrale et caudale se termine avec la pince.
Les axones sont les mieux classées comme étant partiellement isolé depuis une partie de l'axone reste à l'intérieur à au moins une extrémité de l'extrémité de la moelle épinière selon l'importance de la dissociation. Isolement peuvent être réalisés en séparant mécaniquement les deux extrémités de la moelle épinière jusqu'à ce que les axones complètement séparés d'une extrémité de la moelle épinière. Dans ce cas, une partie de l'axone reste à l'intérieur de l'extrémité de la moelle épinière à partir de laquelle il ressort alors que la partie restante est isolé de l'intérieur de la moelle épinière. L'extrémité ouverte de la borne axones étanchéité par un procédé de refermeture de la membrane en fonction de la santé de l'axone. Isolement peuvent aussi être réalisées de telle sorte que les axones émergent de la moelle épinière, but la caudale et rostrale extrémités de la moelle épinière rester connecté par l'intermédiaire des axones réticulo isolées figure 2e. À ce stade, libérant doucement la pression permet aux axones sous tension pour se détendre et boucle à céder des régions isolées d'axones dépourvus de projections post-synaptiques. Les deux techniques de dissociation donnent axones fonctionnels. La température physiologique pour la lamproie est de 10 ° C et où la préparation est autorisé à récupérer à 10 ° C pendant 1 heure pour permettre aux axones à se remettre de la dissociation aiguë. Pour les enregistrements électrophysiologiques, la dissociation a été effectuée sur une lamelle couvre-objet revêtues de poly-lysine introduit dans une chambre de coutume Figure 3. Lamproie la moelle épinière ont été généralement maintenues à 10 ± 2 ° C par perfusion de la solution de Ringer, préalablement refroidi à 10 ° C par passage à travers un dispositif de refroidissement thermoélectrique. Exceptionnellement faible bruit de fond est nécessaire pour résoudre un seul canal Ca Haut-K + (30 mM KCl) est utilisé pour dépolariser les axones (section 4.1), de sorte que le colorant est incorporé dans FMvésicules synaptiques au cours de l'exo-endocytose. Il est difficile de conserver l'insertion d'une micro-électrode dans les axones isolés pendant de longues périodes comme la moindre dérive de la position de l'axone entraîne l'électrode à s'éloigner de l'axone. Il est donc difficile de stimuler les axones pendant une période prolongée en utilisant une microélectrode. Le grand diamètre de l'axone (20-50 um), il est difficile de stimuler l'aide d'une électrode de stimulation de tungstène. Ainsi haute K + a été utilisé pour dépolariser les axones. Les terminaisons présynaptiques des axones réticulo ont un diamètre de 1-2 um. Ca2 + courants sont localisés à la membrane de presse face à terminaisons présynaptiques et il est donc crucial de cibler avec précision la terminaison présynaptique. Par conséquent, une condition essentielle pour la réalisation de ces enregistrements est d'être capable de manipuler le mouvement de la position de correction de pipette par incréments en microns. Ca2 + courants à membranes visage de libération présynaptique ont été justified dans les synapses calyceal est extrêmement faible amplitude, moins de 0,5 pA. Enregistrements de canal unique de Ca2 + courants exigent donc des niveaux de bruit extrêmement bas de fond. Faible niveau de bruit thermique a été réalisé avec un amplificateur Axopatch 200B et un headstage refroidi. En outre, les sources de contamination de bruit doivent être systématiquement identifiés et éliminés. pipettes de patch ont été fabriqués, à partir de verre aluminosilicate de veiller à ce faible niveau de bruit depuis le verre a très peu d'impuretés et une résistivité élevée. Les pipettes ont été créés de telle sorte que le diamètre de la pointe de la pipette était plus grand que le diamètre de la terminaison présynaptique ce qui englobe complètement la terminaison présynaptique, dont les dimensions peuvent être clairement observées par FM 1-43 étiquetage. Cela a permis l'enregistrement de la totalité de la membrane de presse du visage. Le bruit capacitif a été réduite par le revêtement de la pipette avec PDMS comme à proximité de la pointe que possible. Les joints de gigaohm à membranes terminaux présynaptiques ne sont pas stables longtemps parIOD et enregistrements durent généralement un maximum de 2 minutes. Cela rend les enregistrements extrêmement difficile à obtenir car le faible taux de réussite nécessite un grand nombre de tentatives pour obtenir de bons enregistrements. Solutions d'enregistrement doivent être conçus de telle sorte que tous les autres courants connus dans la membrane présynaptique borne tels que voltage-dépendant de Na + et K + et Ca2 + canaux K + activés par des canaux sont bloqués, ce qui permet l'enregistrement des courants de Ca2 +. Il existe certaines limitations à l'utilisation de la surface de l'adhésif de poly-lysine avec cette préparation. L'un est l'incapacité de se déplacer l'emplacement physique de la chambre contenant la préparation en raison des vibrations perturbé la préparation. Une autre limite de la surface de l'adhésif a été découvert au cours des expériences d'immunohistochimie, comme la moelle épinière, des pièces d'extrémité rostrale et caudale perdre l'adhérence lors d'une incubation dans du paraformaldéhyde 4%. Nous avons essayé autre adhésif coaTings tels que Cell-Tak et rencontré des problèmes similaires. Afin de résoudre ces problèmes, nous avons utilisé de la colle liquide suture pour fixer les poignées de la moelle épinière. Les détails concernant l'utilisation de la colle de suture ont été discutés dans un article précédent JoVE par Chen et Featherstone 22. Les ensembles de colle à un rythme plus lent dans les solutions sans ions bivalents et nous avons profité de ce bien et a effectué les dissociations dans la solution de Ringer sans Ca2 + et Mg 2 +. Nous avons ainsi obtenu un délai supplémentaire pour la manipulation du tissu au cours du processus de dissociation. Nous avons adopté une approche similaire à Chen et Featherstone 22 en utilisant des pipettes de patch et de la bouche d'aspiration par un tube relié à la pipette de patch à appliquer la colle sur la zone cible spécifique sur la surface de dissociation avant de procéder à la dissociation (section Protocole 5.2). Les dissociations ont été réalisées comme décrit précédemment, avec la seule différence étant que la moelle cord extrémités ont été apposées au cours du processus de dissociation en faisant glisser doucement l'extrémité du manche sur la colle préalablement placé (section Protocole 5.3). Une fois que la dissociation a été achevée, l'ion divalent libre une solution de Ringer a été échangée contre une solution de Ringer contenant du Ca 2 + et Mg 2 + ions par perfusion et la préparation a été autorisé à récupérer à 10 ° C pendant 20 à 30 min sur une plaque de refroidissement thermoélectrique avant procéder aux étapes ultérieures de l'immunohistochimie. La principale conclusion à tirer de cette technique est une compréhension précise de l'exigence 2 + Ca pour la libération de neurotransmetteurs, qui n'a pas été complètement résolu malgré des décennies de recherche. Une augmentation transitoire de pré-synaptique [Ca 2 +] a été établie comme étant crucial pour déclencher la libération de toutes les synapses. Toutefois, le consensus est toujours pas sur le nombre de canaux de Ca qui contribuent à la Ca2 + domaine déclenchement release. Mesure simultanée de Ca de les courants et les mesures de capacité à la membrane de presse du visage de terminaux présynaptiques individuels donnerait une réponse claire à cette question. En outre, elle permettrait l'élucidation de la relation temporelle entre l'entrée et la vésicule fusion de présynaptique Ca, ce qui permet une mesure précise de retard synaptique. L'accessibilité sans restriction à la membrane de presse face à terminaisons présynaptiques individuelles offre la possibilité d'appliquer un certain nombre de différentes approches expérimentales pour étudier les différentes composantes du processus de libération des neurotransmetteurs. Des exemples de ces approches comprennent l'imagerie de la vésicule unique en utilisant des points quantiques pour étudier fusion des vésicules synaptiques. Événements vésicule de fusion peuvent également être caractérisés directement à terminaisons présynaptiques en mesurant les variations de capacité de la membrane qui sous-tendent les événements vésicule de fusion.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Syringe filter | EMD Millipore | SLGV004SL | |
| 22 x 60 mm Coverslips | Fisherbrand | 12545J | |
| Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
| Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
| Antifreeze | Prestone | ||
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7660 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Bright field light source | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Cover slip | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9559 | |
| Digital CCD Camera | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
| Dissection fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dissection microscope | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Dissection scissors fine | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Dissection scissors ultra fine | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| High vacuum grease | Dow-Corning | ||
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA-56-500 | |
| Immersion oil | Fisher-Scientific | M2000 | |
| Industrial grade nitrogen gas tank | Praxair | UN1066 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Liquid suture glue | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
| Non-fat dry milk | Cell Signaling Technology | 9999S | |
| P-87 Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Perfusion pump | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
| Petri dish 100 x 15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher-scientific | 875712 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300,000 |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Primary antibodies R-type calcium channel | Alomone Labs | ACC-006 | |
| Protease Type XIV from Streptomyces Griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500240 | |
| Schot Duran Pressure Bottle | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
| Silicone tubing for glue application | Cole-Palmer | 07625-26 | |
| Slicing base plate | Leica Biosystems | 14046327404 | |
| Slicing chamber | Leica Biosystems | 14046230132 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide | S8045 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | B3545 | |
| Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 160 | To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 184 | To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight |
| Teflon coated forceps | Fine Science Tools | 11626-11 | |
| Tricaine methanesulphonate | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vibratome blades | World Precision Instruments | BLADES | |
| Xenon lamp | Nikon |
References
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