Non enzimatica, siero-libero Tissue Culture delle lesioni mammarie pre-invasive per la generazione spontanea di mammospheres
Summary
Coltura cellulare primaria utilizzando organoidi tessuto intatto fornisce un sistema modello che simula il microambiente multi-cellulare in vivo. Abbiamo sviluppato un primo modello di coltura di tessuti epitelio mammario senza siero che perpetua linee di colture cellulari miste e mostre differenziati morfologia, senza interruzione del tessuto enzimatico. Organoidi seno rimangono vitali per> 6 mesi.
Abstract
Breast carcinoma duttale in situ (DCIS), per definizione, è la proliferazione delle cellule epiteliali neoplastiche entro i confini del condotto del seno, senza violare la membrana basale collagene. Mentre carcinoma duttale in situ è un precursore non obbligato a tumori al seno invasivi, i meccanismi molecolari e le popolazioni di cellule che permettono la progressione a carcinoma invasivo non sono completamente noti. Per determinare se le cellule progenitrici capaci di invasione esistevano all'interno della popolazione di cellule carcinoma duttale in situ, abbiamo sviluppato una metodologia per la raccolta e la coltura di tessuto mammario umano sterile al momento della chirurgia, senza interruzione enzimatica del tessuto.
Tessuto del seno sterile contenente segmenti duttali è raccolto da tessuto mammario asportato chirurgicamente dopo esame patologico di routine. Tessuto contenente DCIS è posto in ricca di nutrienti, antibiotici contenenti, mezzo privo di siero, e trasportato al laboratorio di coltura di tessuti. Il tessuto del seno è più dissected per isolare le zone calcificate. Molteplici pezzi di tessuto mammario (organoidi) sono posti in un volume minimo di mezzo privo di siero in un pallone con un coperchio amovibile e coltivate in un incubatore umidificato CO 2. Popolazioni di cellule epiteliali e fibroblasti emergono dal organoide dopo 10 – 14 giorni. Mammospheres spontaneo formarsi intorno e sul monostrato di cellule epiteliali. Specifiche popolazioni cellulari possono essere raccolte direttamente dal pallone senza interrompere le cellule vicine. Il nostro sistema di coltura di tessuti non-enzimatica rivela affidabile citogeneticamente anormali, invasive cellule progenitrici di nuove lesioni DCIS umani.
Introduction
Proliferazione delle cellule epiteliali entro i confini di dotti mammari e alveoli (carcinoma duttale in situ) è riconosciuto come un precursore obbligato a duttale invasivo e carcinoma mammario lobulare. Tuttavia, i meccanismi molecolari e dinamica delle popolazioni di cellule che consentono la progressione a carcinoma invasivo sono poco conosciuti. Chiarire i meccanismi di sopravvivenza utilizzate da cellule di carcinoma mammario pre-invasive, o qualsiasi tumore pre-invasivo, può rivelare strategie terapeutiche per l'uccisione, o addirittura prevenire, neoplasie pre-invasive 1. Tuttavia, i metodi a basso costo per semplici funzionalmente studiano lesioni pre-invasive umani sono mancati. Sebbene monostrato coltura in vitro di linee cellulari trasformate è un metodo di laboratorio stabilita, il fenotipo e il genotipo di queste linee cellulari immortalizzate riesce ricapitolare lo stato molecolare delle cellule tumorali umane primarie 2. Inoltre, anche la linea cellulare MCF-10A non oncogeno, che Recapitulates 3-D architettura della ghiandola mammaria, non riesce a rappresentare adeguatamente il fenotipo funzionale e le caratteristiche molecolari di pre-invasiva della lesione al seno di un singolo paziente 3,4.
Per determinare se le cellule staminali neoplastiche, come in grado di invasione esistevano all'interno del carcinoma duttale in situ (DCIS) popolazione di cellule, abbiamo sviluppato una metodologia per la raccolta e la coltura di tessuto mammario umano sterili al momento dell'intervento chirurgico (Figura 1) 5. Il nostro ex vivo seno sistema di coltura organoide non si basa sulla rottura enzimatica dei tessuti, estratto di membrana basale della matrice, o fibroblasti esaurimento, per isolare e propagare le cellule che formano mammosphere dal fresco duttale mammario umano carcinoma tessuto 6-8. Il nuovo sistema si basa sul principio della cella di flusso / migrazione 5. I dotti mammari discernibili e stroma circostante vengono immersi in un volume minimo di mezzo privo di siero nutriente (solo postanough per coprire i frammenti cassone) per massimizzare lo scambio di gas, con la superficie di taglio del condotto esposta al mezzo di coltura, ma in nessun orientamento specifico nel pallone (Figura 1E-F). Questo sistema di coltura consente alle cellule di migrare dal condotto e nella / sulla stroma e la cultura matraccio autologo. Il mezzo nutriente, integrato solo con Epidermal Growth Factor (EGF), l'insulina, e gli antibiotici, sostiene la crescita di popolazioni cellulari miste provenienti dalla organoide. Il pallone di coltura tissutale ha un coperchio richiudibile rimovibile che permette ai organoidi e / o cellule per essere raccolti senza interrompere l'intero boccetta adiacente organoidi, pur mantenendo un ambiente umidificato sterile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema di coltura qui descritto costituisce un nuovo modello per la generazione che vivono le cellule del seno neoplastiche pre-invasive per gli studi di ricerca di base e traslazionale. In passato, la progressione del cancro al seno pre-maligne è tipicamente stata studiata utilizzando tre metodi differenti. Il primo metodo è istopatologica e analisi genetica di microdissezionate congelati o fissi campioni umani 12-14. Il secondo metodo utilizza modelli murini che contengono noduli alveolari iperplastic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da (1), il Dipartimento della Difesa Breast Cancer Research Program (US Army Medical Research Acquisition Attività) premio # W81XVVH-10-1-0781 a LAL e VE, e (2) la concessione Susan G. Komen Foundation IR122224446 a Lal e VE. Supporto Patologia e di espansione del tessuto è stato gentilmente fornito da Inova Fairfax Dipartimento di Patologia, il dottor Hassan Nayer, il dottor Gita A. Menezes, e il dottor Charles Bechert. Il consenso del paziente e gli appalti del campione è stata sapientemente guidati da Inova Fairfax Hospital coordinatori di ricerca clinica Agrifoglio Gallimore, Heather Huryk, e Emil Kamar.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22µm PES membrane |
| 25ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10x10cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 oC, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
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