Summary
無傷の組織オルガノイドを用いた初代培養細胞は、多細胞のin vivoでの微小環境を模倣するモデル系を提供する。我々は、酵素的組織破壊することなく、形態分化混合細胞培養系統や展示を永続無血清原発性乳房上皮組織培養モデルを開発した。乳オルガノイド>は6ヶ月間生存したまま。
Abstract
その場での乳管癌（DCIS）は、定義により、コラーゲン性基底膜を破ることなく、乳管の範囲内で腫瘍性上皮細胞の増殖である。 DCISは、浸潤性乳癌に非偏性前駆体であるが、浸潤癌への進行を可能にする分子機構および細胞集団は完全には知られていない。侵入可能な前駆細胞はDCIS細胞集団内に存在かどうかを決定するために、我々は、組織の酵素を中断することなく、手術時に無菌のヒト乳房組織を採取し、培養するための方法論を開発した。
乳管セグメントを含む滅菌乳房組織は、通常の病理検査次外科的に切除された乳房組織から採取される。 DCISを含む組織は、栄養豊富な、抗生物質を含む、無血清培地に入れ、組織培養研究室に輸送される。乳房組織はさらにdissecteです石灰化領域を分離するためのdの。複数の乳房組織片（オルガノイド）は、加湿CO 2インキュベーター中で取り外し可能な蓋と、培養したフラスコ内の無血清培地の最小容積に配置されます。 14日 - 上皮および線維芽細胞集団は10の後オルガノイドから出てくる。マンモスフィアは自然に形成し、上皮細胞単層の周り。特定の細胞集団は、隣接する細胞を破壊することなく、フラスコから直接採取することができる。我々の非酵素的な組織培養系は、確実に新鮮なヒトDCIS病変からの細胞遺伝学的に異常な、侵襲性の前駆細胞を明らかにする。
Introduction
乳管および肺胞（ 非浸潤性乳管癌）の範囲内で上皮細胞の増殖は、浸潤性乳管および小葉乳癌に対する絶対的前駆体として認識されている。それにもかかわらず、浸潤癌への進行を許可する分子機構および細胞個体群動態はよく理解されていない。前浸潤乳癌細胞、または任意の前浸潤腫瘍で使用される生存メカニズムを解明することは殺す、あるいは、前浸潤腫瘍1を防止するための治療戦略を明らかにすることができる。しかし、機能的にヒト前浸潤の病変を研究するための単純な低コストの方法が欠けてきた。形質転換細胞株のin vitroでの単層培養は、確立された実験室方法であるが、これらの不死化細胞株の表現型と遺伝子型は、一次ヒト腫瘍細胞の分子の状態2を再現することができない。さらに、偶数のRecA非腫瘍形成性MCF-10A細胞株、pitulates 3-D乳腺アーキテクチャは、十分に機能的表現型および個々の患者の事前浸潤性乳癌病変3,4の分子特性を表すことができない。
侵略のできる幹様腫瘍性細胞は（DCIS） 非浸潤性乳管癌の中に存在した場合に細胞集団を決定するために、我々は手術の時点（ 図1）5 位の無菌ヒト乳房組織を採取し、培養するための方法論を開発しました。我々のex vivoでの乳癌オルガノイド培養系は、単離し、新鮮なヒト乳管癌組織6-8からマンモスフェア形成細胞を増殖させるために、酵素的組織破壊、基底膜抽出物のマトリックス、または線維芽細胞の枯渇に依存しない。当社の新しいシステムは、セルストリーミング/移行5の原理に基づいている。識別可能な乳管、及び周囲の間質は、無血清栄養培地（ちょうど電子の最小体積中に浸漬されている培地に曝露され、ダクトの切断面と、ガス交換を最大化するが、フラスコ内の不特定の向き（ 図1E-F）にする）ダクト断片をカバーするnough。この培養系は、細胞は、自己由来間質および培養フラスコ上にダクトから出て、/の中に移動することができます。唯一の上皮成長因子（EGF）、インスリン、および抗生物質を補充した栄養培地は、オルガノイドから発せられる混合細胞集団の増殖を支持する。組織培養フラスコは、無菌加湿環境を維持しながら、オルガノイドおよび/または細胞がフラスコ全体又は隣接オルガノイドを中断せずに採取することができ、取り外し可能、再シール可能な蓋を有する。
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Protocol
ヒト乳房組織は、国防総省、ジョージ·メイソン大学、イノバ健康システム治験審査委員会の承認されたプロトコルに続いて、書面によるインフォームドコンセントを、調査研究に登録した患者から採取した。
1.成長因子および抗生物質を栄養豊富な培地を準備
- インスリン、上皮成長因子（EGF）、硫酸ストレプトマイシンおよび硫酸ゲンタマイシンのストック溶液を調製する。
- を10mg / mlの最終濃度に滅菌濾過された水のインスリンを再構成する。吸引し、滅菌10ml中タイプ1試薬グレードの水10ミリリットル使い捨て注射器。注射器に0.22μmのポリエーテルスルホンフィルターを取り付けます。無菌の15mlの円錐チューブに滅菌濾過された水を分配する。
- インスリン100mgのバイアルに滅菌ろ過された水の10ミリリットルを追加します。ボルテックスミキサーで簡単に内容物を混合。氷上でのインスリンのバイアルを保管してください。インスリンストックソル450μlのを分配-20°Cでラベルし、滅菌マイクロチューブやストアにる。インスリンストック溶液を、バイアルの有効期限まで安定である。
- 上皮成長因子（EGF）の原液を調製：500μgのEGF（株式を1μg/μl）を500μlの滅菌水を追加します。ボルテックスミキサーで簡単に内容物を混合。氷の上のEGFバイアルに保管してください。
- EGFのワーキングストック溶液を準備します（作業ストックは0.1μgの/μLになります）900μlの栄養培地への原液のEGF溶液100μlを加える。ボルテックスミキサーで簡単に内容物を混合。 -80℃でラベルし、滅菌マイクロチューブやストアに、EGF作業ストック溶液50μlを分配する。
注：EGF原液（を1μg/μl）を-80℃で1年間安定です。ストック溶液（0.1μgの/μl）を協力して-80℃で2ヶ月間安定である。
- EGFのワーキングストック溶液を準備します（作業ストックは0.1μgの/μLになります）900μlの栄養培地への原液のEGF溶液100μlを加える。ボルテックスミキサーで簡単に内容物を混合。 -80℃でラベルし、滅菌マイクロチューブやストアに、EGF作業ストック溶液50μlを分配する。
- 化学天秤で硫酸ストレプトマイシン、40mgの重量を量る。硫酸ストレプトマイシンint型を置きますOA滅菌15ミリリットルコニカルチューブ。栄養培地4mlを追加します。ボルテックスミキサーで簡単に内容物を混合。溶液はわずかにピンク色でなければなりません。光から保護して、4℃で保存。ストレプトマイシン硫酸塩溶液は、7日間安定である。
- 化学天秤で硫酸ゲンタマイシン20mgを秤量する。滅菌15ミリリットルコニカルチューブに硫酸ゲンタマイシンを置きます。栄養培地2 mlを追加します。ボルテックスミキサーで簡単に内容物を混合。溶液は黄色でなければなりません。光から保護して、4℃で保存。硫酸ゲンタマイシン溶液は7日間安定である。
- ヒト組換えEGFを補充した栄養培地の二200ミリリットルのバッチの準備（10ng / mlの最終濃度で）、インスリン（10μg/ mlの最終濃度）、硫酸ストレプトマイシン（100μg/ mlの最終濃度）および硫酸ゲンタマイシン（20 / mlの最終濃度）。
- 0.2μmのポリエーテルスルホンフィルターフラスコ、ボトルを受信250mlで備えた真空フィルターフラスコに200ミリリットルの栄養培地を加える。 20＆を追加＃181; L作業ストックEGF、200μlのストック·インスリン、2ミリリットルの株式ストレプトマイシン硫酸、及び栄養培地200mlに400μlのストックゲンタマイシン硫酸。真空フィルターフラスコを取り付けます。メディアをフィルタリングします。フィルタを破棄し、「栄養豊富な媒体」としてフラスコにラベルを付ける。 14日まで4℃で保管してください。
2.組織の取得と興行収入
- 手術室では、乳房組織を調達した後、無菌技術を維持している。滅菌トレイに乳房組織を置き、滅菌プラスチックラップでトレイをカバーしています。
- あなたの機関の必要に応じて放射線科/病理に覆われたトレイに組織を輸送する。トレイを開けないでください。輸送時間は、機関内で変わる。組織は、最大45分後に切除RTでこのカバーされたトレイに生存し続けることができます。しかし、栄養豊富な培地への組織の迅速な処理は、その後のオルガノイド培養のための最適な条件を提供しています。
- グロス組織切開は乳房組織内DCISの領域を識別するために：組織の無菌性を維持するために、組織切開中に滅菌手袋、ブレード、メス、組織マーキング染料、酢を使用してください。
- 70％エタノールまたは1％の漂白剤と作業エリアを清掃してください。滅菌手袋を開き、作業台の上に手袋のラッパーを置く。グローブラッパー表向きの無菌インテリアを配置します。滅菌手袋を着用してください。
- 70％エタノールで検体容器の表面を清掃してください。組織検体容器からプラスチックラップを外し、手袋ラッパーに試料を置きます。
- 組織マーキング染料に2綿綿棒を浸し。組織表面全体に綿棒を転がすことによって組織の表面に染料を適用します。
注：各病理部門は、標準化された染料の色/組織の向きプロトコルを持っています。組織は、患者内の位置に関連して組織を配向する色素で標識されている。染料がブロットされているか組織上に描いた。組織の上に染料をかけないでください。染料を注ぐことは、染料は、このように切除縁の向きを混乱組織割れ目に/ドリップを実行する可能性があります。組織配向は、外科医の解剖学的特徴を有する病理学者）組織標本を記述し、そしてb）は、腫瘍に関連して切除縁の位置を決定を提供する。 - 滅菌ガーゼパッド上で蒸留ホワイトビネガー（5％酢酸）に注ぐ。酢に浸したガーゼで染め組織ブロット。ガーゼを捨てる。酢は、色素を組織マーキングを固定するために使用される。
- 約5mmの厚さの垂直スライスに乳房組織をカット。組織（ 図2）を介してすべての道を切断しないでください。観察/石灰化の領域のための組織を触診。その特徴的なしっかりした、（これはカルシウム骨片に）ザラザラを感じる赤みがかった、ゴム状の境界線に囲まれた淡い出現によってDCIS病変を識別します。
注：いくつかのケースでは、コメド（にきびのような）の領域とすることができる大口径DCIS病変から壊死物質を表す、白い点として見え。 - 乳房組織を取り巻く少量含む、DCIS /石灰化乳房組織の領域を切り出した。ステップ1で調製した栄養豊富な培地20-30 mlを含む滅菌した50ミリリットルチューブに乳房組織を置きます。
- 優しくチューブを数回反転させることにより組織やメディアを混ぜる。培地を捨て、新鮮な培地を追加します。断熱容器への組織及び培地を含むチューブを置き、組織培養ラボへ組織を輸送する。
- 70％エタノールまたは1％の漂白剤と作業エリアを清掃してください。滅菌手袋を開き、作業台の上に手袋のラッパーを置く。グローブラッパー表向きの無菌インテリアを配置します。滅菌手袋を着用してください。
3.組織培養
- 生物学的安全キャビネットの中で作業し、無菌のペトリ皿に組織および栄養培地を少量注ぐ。滅菌メスを使用すると、離れてカットし、線維組織を捨てる。ピース（オルガノイド）約3mm 2（ 図1C-D）に乳房組織をカット。各臓器ように組織を切断しようとするOID周囲の間質を有する少なくとも一つの識別可能なダクトセグメントが含まれています。
- 組織培養フラスコの蓋を開きます。滅菌ピンセットまたは鉗子を用いて、フラスコ内にオルガノイドを置く。ふたを閉じます。ペトリ皿を捨てる。
- 組織培養フラスコに11ミリリットルの無血清栄養豊富な培地（ステップ1で調製）を加える。フラスコを閉じ、オルガノイド及び媒体が均等にフラスコ表面全体に分散されるように（ 図1E-F）をフラスコを旋回。
- 2日間加湿5.0％CO 2雰囲気中37℃でフラスコをインキュベートする。この期間中にフラスコを動かさないでください。
- 2日後のインキュベーションでは、潜在的な真菌/細菌汚染をチェックするためにインキュベーターからフラスコを取り外します。突然、鋭い動きを避けるため、あるいはフラスコの旋回。倒立顕微鏡ステージ上にフラスコを置きます。
- 細菌、酵母、および/または真菌のための媒体を守ってください。汚染が認められない場合、アドインキュベーターにフラスコを返すitional日。汚染が指摘されている場合は、適切な容器にフラスコ及び内容を破棄。
- 3日後のインキュベーションでは、新鮮な培地で馴化培地を交換してください。
- 20〜30分間37℃で滅菌したチューブ内の培地11ミリリットルを置きます。インキュベーターからの組織培養フラスコを外します。オルガノイドを乱すことなく、無菌の血清学的ピペットを用いてフラスコ内の培地を除去し、廃棄する。
- 新しい無菌の血清学的ピペットを用いて、予め温めておいた新鮮な培地11ミリリットルを追加します。非常に静かにフラスコ表面全体にメディアを配布し、フラスコを回転させます。
- 加湿し、5.0％CO 2雰囲気下で37℃でフラスコをインキュベートする。
設立オルガノイド/上皮細胞コロニー4.メンテナンス
- 2週間毎に新鮮な培地を用意し、組織培養フラスコ内で週に3回メディアを交換。
- 37で滅菌容器内の培地11ミリリットルを置き20〜30分間のC°。インキュベーターからフラスコを外します。無菌の血清学的ピペットを用いて、フラスコからの馴化培地を除去し、廃棄し、オルガノイドを乱さないように注意しながら。
- 新しい無菌の血清学的ピペットを用いて、予め温めておいた新鮮な培地11ミリリットルを追加します。非常に静かにフラスコ表面全体にメディアを配布し、フラスコを回転させます。加湿し、5.0％CO 2雰囲気下で37℃でフラスコをインキュベートする。
- 10の後 - 培養14日後、付着していない培養フラスコ中の組織のいずれかの部分を削除します。
- 収穫細胞および/または新しい培養フラスコに伝播するため、異種移植のために、または表現型および/または分子解析用のフラスコからのオルガノイドを定期的に。
- インキュベーターからの組織培養フラスコを外します。 70％エタノールでフラスコをスプレーします。 70％エタノールを噴霧された清潔なペーパータオルでフラスコに過剰のエタノールを拭き取る。
- オルガノイド伝播：<オール>
- フラスコの蓋を開き、生物学的安全キャビネット内蓋フェイスアップを置く。微視的な可視化の下では、収穫されるオルガノイド（複数可）を見つけます。ピックアップするオルガノイドを滅菌ピンセットまたは鉗子を使用してください。
- 新しい培養フラスコ内のオルガノイドを伝播するために、新しいフラスコ内オルガノイドを置く。 11ミリリットルの新鮮な、温かい培地を追加します。 3.6.3 -ステップ3.3で説明したように、加湿した5％CO 2雰囲気中、37℃でインキュベートする。組織培養フラスコ中で1週間に3回、細胞培養培地を交換する。
- 細胞を回収。
- 直接顕微鏡vixualizationの下で、優しくこすりおよび吸引細胞とマンモスフィアは、無菌の使い捨てピペットチップ1,000μlのピペットを用いて。細胞や周囲の培地を吸引除去する。滅菌マイクロチューブに細胞/培地を分注する。
- 5秒間12100×gでミニ遠心機で簡単に細胞をスピン。培地を除去し、廃棄する。 <オール>
- DNA分析のために、直ちに-80℃で長期保存して、培地（10μl）を、少量の、ドライアイス上で細胞ペレットを凍結する。
- プロテオーム解析のために、質量分析又はウェスタンブロッティング/逆相タンパク質マイクロアレイのための2×SDSトリス - グリシン緩衝液のための8 M尿素10μlの細胞を溶解する。あるいはまた、免疫組織化学的分析のための細胞塗抹標本を作るために細胞遠心で細胞をスピン。
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Representative Results
その場での組織中の滅菌乳管癌を調達し、培養するためのワークフロー
乳房組織の無菌性は、典型的な病院の病理ワークフロー（ 図1）の小さな変化を介して、手術室からの細胞培養室に維持される。組織は、組織の無菌性を維持しつつ、放射線学的評価を可能にするプラスチックフィルムカバーを滅菌容器に搬送される。乳房の腫瘍摘出手術または乳房切除試料の総組織処理は、滅菌手袋、ブレード、組織マーキングの染料を用いて行われる。 その場での乳管癌の肉眼的形態学的外観は、赤みを帯びた黄色/ゴム状組織に囲まれてザラザラ/しっかりした質感と淡い、やや隆起領域に似ている。乳管過形成およびDCISの領域は、石灰化が「ザラザラ」としっかりと感じることがあります。乳房組織のこれらの領域は、多くの場合、日焼けや周囲の乳房組織よりもわずかに異なる色が表示されます。しかし、ADH C唯一の組織収集、染色組織切片の病理学的検討した後に区別すること。乳房組織は、ヒト組換えEGF（10 ng / ml）を、インスリン（10μg/ ml）を、硫酸ストレプトマイシン（100μg/ ml）および硫酸ゲンタマイシンを補充した無血清栄養培地中で組織および/または乳管オルガノイドを浸漬することにより、生存し続ける（20μg/ ml）を5。取り外し可能/再シール可能な蓋を有する細胞培養フラスコは、細胞/オルガノイド（ 図1E-F）の周期的な収穫を可能にする。このモデルは、成功した（n = 18）をその場で 20以上の異型乳管過形成と診断された患者（n = 2）、および乳管癌からのヒト乳房前浸潤の病変を伝播する。
in vitroおよびin vivoでの自発的なマンモスフェアの形成
マンモスフィア及び3-D構造は、異型乳管ハイパーと診断された人の異なる患者からの複数の独立したヒトDCISダクト組織断片から自然発生的に生じたその場での plasiaまたは乳管癌（ 図3＆4）5,9。乳房組織の酵素的破壊前、混合細胞型の培養をもたらした組織培養に実行されなかった。どちらの血清、基底膜抽出物、またゲル状マトリックスは自発マンモスフェアの形成（ 図4）のために必要であった。マンモスフィアが浸潤癌と同じ成長パターン（ 図5）5を有するNOD / SCIDマウスモデルにおいて乳癌異種移植片腫瘍を生成した。これらの結果は、ヒトの乳房内に存在する潜在的な事前侵襲で前駆細胞がダクトをDCISどうやら腺管ニッチによってチェックで開催されており、オルガノイド培養中に出現するなだめすることができることを実証している。これらの細胞は、浸潤性の表現型の5,9,10の明白な徴候に先立って存在する乳癌幹様細胞の新しいカテゴリを構成している。
上皮派生マンモスフィアとxenografの確認TS
マンモスフィア由来するマンモスフィアおよび異種移植片は、上皮起源を有するものとして、免疫蛍光によって確認した。上皮細胞接着分子（EpCAM）は、上皮細胞上で発現される11膜糖タンパク質である。人間のEpCAM（緑色）および核染色（DAPI、青）に反応するマウスモノクローナル抗体を用いた免疫蛍光は、培養中のマンモスフィアに（ 図6A）およびNOD / SCID異種移植片（ 図6B）の中心のEpCAM陽性細胞を示した。
無傷の基底膜境界の検証
マンモスフェアの形成は、この培養系における腫瘍性上皮細胞ケア組織病理学的診断の基準の下で独立した病理学的分析によって確認されるように、率直な浸潤または微小浸潤を欠いていたプレ浸潤性乳癌病変に由来した。同じ患者からの複数オルガノイド構造がためにマンモスフェアを生成した腫瘍形成性であることが判明した明コロニー。また、オルガノイド培養に用いた組織の組織病 理学的検査は、無傷の基底膜の境界（ 図7B）5とコンフルエント管内の病変を明らかにした。従って、この培養系で形成された自発マンモスフィアだけ前浸潤腫瘍性領域に由来し、微小浸潤5のまれな分野の製品ではないしていると結論することができる。
放射線イメージングおよび総組織切開中に組織の無菌性を維持するための1.ワークフロー図。手術室では、（A）、乳房組織（図示乳腺腫瘤摘出試料）は、滅菌トレイに入れ、滅菌プラスチックラップで覆われている。組織は、プラスチックトレイに直接画像化することができる。識別する興行収入（B）組織 DCISの分野。シングルユースのみの組織向き色素は、滅菌綿綿棒を使用して組織表面に塗布されている。家庭用蒸留ホワイトビネガーは、組織上に直接注ぎ、滅菌綿ガーゼでブロットされた。（C＆D）乳房組織を抗生物質を補充した栄養豊富な培地中で組織培養研究室に輸送される。 DCISの領域を分離するための組織切開を、滅菌手袋及びブレード/メス/ハサミを使用して実行される。 DCIS組織を培養するための複数のオルガノイドに切断される。（E＆F）乳房オルガノイドのインビトロ培養する。ヒトのDCIS組織は、組織の前に酵素消化することなく、取り外し可能な蓋を有する組織培養フラスコ中に直接配置される。オルガノイド周りの空気 - 液体界面を維持しながら、上皮成長因子およびインスリンを補充した無血清培地の最小量は、細胞の増殖を支持する。6fig1highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
乳房DCIS組織のための総組織処理図2.イラスト。腫瘤摘出または乳房切除組織は、標本を介してすべての道を切断することなく垂直方向に組織をスライスして薄い切片に切断される。切断組織を食パンに似ているので、この切開法は、しばしば「パンのローフ法」と呼ばれる。 DCISを含む疑いのある領域（単数または複数）を切り出し、2にスライスされた - 診断病理およびオルガノイド培養のための3mmのスライス。
図3のA混合細胞型培養in vivoでの細胞集団の代表を維持します。 （A）は11週間（4X倍率）を介して乳房DCIS病変から生成された混合細胞培養の位相コントラスト画像。（B＆C）上向きに成長し、拡大してマンモスフィアのように定義足場非依存性増殖を用いたin vitroオルガノイド栽培正常に伝播DCIS派生上皮細胞、 、および分葉、ダクト状の3次元地層、EGF、インスリン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシン（倍率10倍）を補充した無血清培地中。（D）例が、培養中の11週（40X倍率）後に形成されたマンモスフェア。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
図4.自発無血清オルガノイド培養液中のマンモスフィアの形成。文化の33日（倍率10倍、20X挿入図）次の例でマンモスフェア形成。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5 NOD / SCIDマウス異種移植モデル異種移植片は、（マウスの乳房脂肪パッド左）DCIS（マウスの右乳房脂肪パッド）と診断された患者から、または侵襲性DCISと診断された患者由来の上皮細胞を注射することによって作製した。純粋なDCISおよび浸潤DCISの両方から派生異種移植片は、同様の成長パターンとレートを明らかにした。 トンの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください彼の姿。
図6マンモスフィアが上皮起源であることが確認された。DCISを含む乳管から発生したマンモスフィア、マウス異種移植片の上皮起源を確認するために使用したFITCにコンジュゲートされた抗EpCAMを用いた免疫蛍光（A）のEpCAM-FITC陽性細胞（擬似着色されたグリーン、488 nm）が唯一の乳房オルガノイドから発せられる混合細胞培養物のマンモスフィア（DAPI（擬似色のブルー、408 nm）で核染色）が見られた。（B）ホルマリン固定パラフィン包埋マウス異種移植片組織切片では、EpCAMの正細胞を、唯一の異種移植腫瘍切片の中央で検出された。 （20X倍率） このfiguの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください再。
図7.コラーゲンIV免疫組織化学は、管の周囲の無傷の基底膜を明らかにしている。通常の乳管（A）は 、コラーゲンIV（ジアミノベンジジン=茶色の染色）が濃縮された無傷の基底膜に囲まれている。オルガノイド培養後、乳房組織はまた、マンモスフィアがDCISの地域からではなく、浸潤癌（コラーゲンIV免疫組織化学、パネル4X倍率、パネルB 10X）に由来していることを確認し、無傷の基底膜が含まれています。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてくださいこの図。
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Discussion
本明細書中に記載の培養系は、基本およびトランスレーショナルリサーチ研究のために生きている前浸潤腫瘍性乳房細胞を生成するための新しいモデルを構成する。過去には、前悪性乳癌の進行は、典型的には、3つの異なる方法を用いて研究されてきた。第一の方法は、顕微解剖凍結または固定ヒト検体の組織病 理学的および遺伝的分析12-14です。第二の方法は、ヒトプレ浸潤性乳癌病変15と同様であると考えられている過形成歯槽結節（HAN病変）を含有するマウスモデルを利用する。第3のモデルは、形態3,4のように高度に差別化されたDCISを有するように、MCF7サブライン（MCF10A）などの確立乳癌細胞株を使用しています。これらの三つのモデルは、乳癌の進行の分子の手がかりを提供してきたが、これらの方法はいずれも、悪性度または個々の患者の病巣（単数または複数）の分子表現型を評価することが可能でない。 HistopathOLOGIC分析は前浸潤病変における細胞の機能的表現型についての情報を提供していません。乳癌進行のマウスモデルは、正確にその場 16-18人間の異型乳管過形成、その場での小葉癌、および乳管癌の組織形態や多様性を反映していない場合があります。さらに、間質微小環境およびマウス前駆病変の周囲の細胞外マトリックスの沈着は、ヒトの対応16とは著しく異なっている。自発的ネズミ前駆病変は、浸潤及び転移への進行の非常に低いレベルを示すことができる。第三の方法は、培養された細胞株は、免疫抑制ホスト3,4に移植した場合にのみ機能的表現型の情報を提供することができる。また長い継代した細胞株の遺伝的異常は、人間2における自発乳癌の進行を表していない場合があります。最後に、十分に確立されている各患者の腫瘍浸潤と転移13,14,17に成長、分化状態、および進行速度を駆動遺伝的およびエピジェネティックな異常のユニークな組合せを有する。人間の前浸潤病変は細胞組成や組織形態での多焦点と異質である。さらに、生物学的悪性度は、個々の患者の前浸潤性病変のため不明である。
我々の主要な組織培養方法は、ヒト前浸潤性乳癌の以前のモデルの欠点を克服し、次の利点を提供する：1）オルガノイド培養系は、自然に生成されるマンモスフィアを成長させ、生成する天然の組織の微小環境内の腫瘍性細胞集団の増殖を支持するマウス異種移植モデルにおいて浸潤性腫瘍。細胞は、個々の患者の遺伝子型と表現型を示し、それによって個人化療法、または個々の予後の情報を提供する。 2）オルガノイド培養系のMAINTネイティブの細胞亜集団AINSおよび非悪性上皮細胞、ストローマ細胞および一次乳房組織に元々存在する免疫細胞を培養するための手段を提供し、オルガノイド内の文化に搬入。培養系におけるメディアの低容量は、人工3次元足場を必要とせず自発的なマンモスフェアの形成と差別ダクトや構造などの肺胞を奨励酸素交換をサポートしています。 3）初代細胞培養は、酵素的解離または外因性の遺伝的改変によって生成された改変および選択から自由である。さらに、栄養培地を調製するための低コストで単純である。 4）分子および遺伝的分析は、培養物全体を中断せずに異なる時点で培養物から特定の細胞集団および/またはオルガノイドに対して行うことができる。 5）オルガノイド培養系は、天然の細胞集団の増殖、分化、形態及び細胞 - 細胞間相互作用を可能にすることができ培養培地中への治療薬の導入の前と後に試験すること。
一次組織培養はいくつかの利点を有するが、それには限界がないわけではない。オルガノイド文化はいずれの細胞型の異常増殖することなく、混合細胞培養物の増殖をサポートしています。しかしながら、細胞型の特定の比率を制御することができず、 インビボで見出さ正確な細胞の比率を再現しないことがあります。成功したオルガノイド培養は、多くの地域病院の病理検査室で日常的な手順ではありませんどちらも、無菌の組織収集および処理を必要とします。臨床研究者間の良好なコミュニケーション、外科スタッフ、および病理スタッフが患者のケアの連続体の中のサンプル無菌性を維持するために必須である。
オルガノイド文化のさらなる制限は、細胞表現型および遺伝子発現16,19上の基層ハリの効果である。培養中の幹細胞の分化血清含有培地の添加によって誘導され得るか、または培養物中で長期間に起因し得る。幹細胞様の表現型は、この非酵素的な、無血清オルガノイド培養系5の数ヶ月後に維持された。しかし、ある時点で、細胞は形態学的に見ることができる区別することができる - 細胞は小さく、より高密度になり、マンモスフィアを形成することができない。 、時間をかけて細胞表現型の変化と潜在的な問題を回避するようなトランスフェクションのような分子の実験、またはアッセイをノックダウンするために、若い文化ではなく、古い文化（6ヶ月を超える）を用いて実施されるべきである。
成功オルガノイド培養するキーは、培養フラスコ中の培地の適切な容量を使用して、オルガノイド時間は組織培養フラスコに付着させている。フラスコ限界酸素拡散過剰媒質、マンモスフェア形成を阻害する。最初の3 - オルガノイドはTISにアタッチするための組織培養の7日間は重要である培養フラスコを訴える。オルガノイドは、14日目で取り付けていない場合、一般的に、それはおそらくあらゆる実行可能なDCIS乳管のセグメントが含まれていませんし、付着になることはありません。 14日目により、付着していないオルガノイドを培養物から除去しなければならない。生存可能な乳房の欠如DCISダクト10％ホルマリンでオルガノイドを固定組織染色および顕微鏡評価のためにパラフィンブロックに組織を処理することにより培養した後に検証することができる。
私たちは、非酵素的な、無血清培養系の発見は、侵襲能力を有する遺伝的に異常な新生物性前駆細胞が前浸潤ヒト乳房病変5,9,20内に存在するという仮説を支持する。この知見は、Sgroi ら 、ヒト乳房前浸潤性病変とDamonte らの遺伝子解析を行った。乳腺上皮内腫瘍の成長を研究し（MINO）乳癌進行12,14のマウスモデルの前の仕事と一致している、21。取ら峠他人の結論とTHER、個々の患者前浸潤性病変の我々の培養モデルは、患者の浸潤性乳癌の侵襲性の表現型は、主に前浸潤の段階で事前に決定することができるという概念をサポートしています。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
この作品は、LALに防衛乳癌研究プログラム（米国陸軍医学研究買収活動）受賞＃W81XVVH-10-1-0781の（1）部門によって部分的にサポートされており、VE、及び（2）スーザンG.コーメン財団助成したLALにIR122224446とVE。病理サポートと組織グロスは親切にイノーバフェアファックス病理学科、博士ハッサンネイヤー、博士Geetha A.メネゼス、博士チャールズBechertにより提供された。患者の同意とサンプル調達が巧妙イノバフェアファックス病院臨床研究コーディネーターホリーGallimore、ヘザーHuryk、そしてエミールカマルによって導かれました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10 cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2 µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10 mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100 µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10 mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10 mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22 µm PES membrane |
| 25 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115 cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 °C, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8 M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
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