Summary
Cultivo de células primarias de tejido intacto utilizando organoides proporciona un sistema modelo que imita el microambiente multi-celular in vivo. Desarrollamos un modelo de cultivo libre de suero primaria tejido epitelio de mama que perpetúa los linajes de cultivo de células mixtas y exposiciones morfología diferenciados, sin interrupción tejido enzimática. Organoides mamarios permanecen viables durante> 6 meses.
Abstract
Ductal carcinoma de mama in situ (DCIS), por definición, es la proliferación de células epiteliales neoplásicas dentro de los confines del conducto de la mama, sin violar la membrana basal de colágeno. Mientras DCIS es un precursor no obliga a los cánceres de mama invasivos, los mecanismos moleculares y las poblaciones de células que permiten la progresión a cáncer invasivo no se conocen totalmente. Para determinar si las células progenitoras capaces de invasión existían dentro de la población de células DCIS, se desarrolló una metodología para la recogida y el cultivo de tejido de mama humano estéril en el momento de la cirugía, sin interrupción enzimática de tejido.
Tejido del seno estéril que contiene segmentos ductales se cosecha a partir de tejido de mama extirpada quirúrgicamente tras el examen patológico de rutina. Tejido que contiene DCIS se coloca en un medio rico en nutrientes, que contiene antibiótico, sin suero, y se transporta al laboratorio de cultivo de tejidos. El tejido mamario es más dissected para aislar las áreas calcificadas. Múltiples piezas de tejido de mama (organoides) se colocan en un volumen mínimo de medio libre de suero en un matraz con una tapa extraíble y se cultivaron en un incubador de CO2 humidificado. Poblaciones de células epiteliales y fibroblastos emergen de la organoide después de 10 - 14 días. Mammospheres formar espontáneamente en y alrededor de la monocapa de células epiteliales. Poblaciones específicas de células pueden ser cosechadas directamente desde el matraz sin interrumpir las células vecinas. Nuestro sistema de cultivo de tejidos no enzimática revela de forma fiable, células progenitoras invasivos citogenéticamente anormales de lesiones de CDIS humanos frescos.
Introduction
Proliferación de las células epiteliales dentro de los confines de los conductos mamarios y los alvéolos (carcinoma ductal in situ) es reconocido como un precursor obligado a ductal infiltrante y el carcinoma de mama lobular. Sin embargo, los mecanismos moleculares y dinámica de la población de células que permiten la progresión a cáncer invasor, son poco conocidos. Dilucidar los mecanismos de supervivencia utilizados por las células de carcinoma de mama pre-invasoras, o cualquier tumor pre-invasivo, puede revelar las estrategias terapéuticas para matar, o incluso prevenir, neoplasias pre-invasoras 1. Sin embargo, los métodos simples de bajo costo para estudiar funcionalmente lesiones pre-invasoras humanos han faltado. Aunque el cultivo monocapa in vitro de líneas celulares transformadas es un método de laboratorio establecida, el fenotipo y el genotipo de estas líneas celulares inmortalizadas falla para recapitular el estado molecular de las células tumorales humanas primarias 2. Además, incluso la no tumorigénicos línea celular MCF-10A, que recapitulates 3-D arquitectura de la glándula mamaria, falla para representar adecuadamente el fenotipo funcional y características moleculares de pre-invasiva lesión de la mama de un paciente individual 3,4.
Para determinar si las células neoplásicas-madre como capaces de invasión existían en el carcinoma ductal in situ (CDIS) población de células, hemos desarrollado una metodología para la recolección y el cultivo de tejidos de mama humana estéril en el momento de la cirugía (Figura 1) 5. Nuestro sistema de cultivo ex vivo organoide de mama no se basa en la interrupción enzimática de tejido, extracto de matriz de membrana basal, o el agotamiento de fibroblastos, para aislar y propagar células formadoras de mammosphere fresco ductal de mama humano tejido de carcinoma de 6-8. Nuestro nuevo sistema se basa en el principio de transmisión de célula / migración 5. Los conductos mamarios discernibles, y estroma circundante se sumergen en un volumen mínimo de medio nutriente libre de suero (sólo correonough para cubrir los fragmentos de cajón) para maximizar el intercambio de gas, con la superficie de corte del conducto expuesta al medio de cultivo, pero en ninguna orientación específica en el matraz (Figura 1E-F). Este sistema de cultivo permite que las células migran fuera del conducto y en / sobre el matraz de estroma y de cultivo autólogo. El medio nutriente, suplementado sólo con el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF), insulina y antibióticos, apoya el crecimiento de las poblaciones de células mixtas que emanan de la organoide. El matraz de cultivo tisular tiene un re-sellable tapa extraíble, que permite que los organoides y / o células que se recogerán sin interrumpir la totalidad del frasco o vecinos organoides, mientras que el mantenimiento de un entorno humidificado estéril.
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Protocol
Tejido mamario humano se obtuvieron de pacientes que participaron en un estudio de investigación, con el consentimiento informado por escrito, siguiendo Departamento de Defensa, la Universidad George Mason, y los protocolos aprobados por Inova Health System Junta de Revisión Institucional.
1. Prepare rica en nutrientes medio con Factores de crecimiento y antibióticos
- Preparar soluciones madre de insulina, factor de crecimiento epidérmico (EGF), sulfato de estreptomicina y sulfato de gentamicina.
- Reconstituir la insulina en agua filtrada estéril hasta una concentración final de 10 mg / ml. Aspirar 10 ml de agua de tipo 1 grado reactivo en un 10 ml jeringa desechable estéril. Adjuntar un filtro de 0,22 micras polietersulfona a la jeringa. Dispensar el agua filtrada estéril en un tubo cónico de 15 ml estéril.
- Añadir 10 ml de agua filtrada estéril a un vial de 100 mg de la insulina. Mezclar el contenido brevemente en un mezclador de vórtice. Conservar el vial de insulina en el hielo. Dispense 450 l de la insulina de la solución en la etiqueta, tubos de microcentrífuga estériles y almacenar a -20 ° C. Solución de insulina de valores es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el vial.
- Preparar la solución madre de factor de crecimiento epidérmico (EGF): Añadir 500 l de agua estéril y 500 mg de EGF (agotadas 1 mg / l). Mezclar el contenido brevemente en un mezclador de vórtice. Conservar el vial de EGF en el hielo.
- Preparar una solución madre de trabajo de EGF: Añadir 100 l de la solución madre FEAG a 900 l medio nutritivo (madre de trabajo será de 0,1 mg / l). Mezclar el contenido brevemente en un mezclador de vórtice. Dispensar 50 l de la solución de EGF trabajo stock en, tubos de microcentrífuga estériles etiquetados y almacenar a -80 ° C.
NOTA: solución madre EGF (1 mg / l) es estable por 1 año a -80 ° C; trabajando solución madre (0,1 mg / l) es estable durante 2 meses a -80 ° C.
- Preparar una solución madre de trabajo de EGF: Añadir 100 l de la solución madre FEAG a 900 l medio nutritivo (madre de trabajo será de 0,1 mg / l). Mezclar el contenido brevemente en un mezclador de vórtice. Dispensar 50 l de la solución de EGF trabajo stock en, tubos de microcentrífuga estériles etiquetados y almacenar a -80 ° C.
- Pesar 40 mg de sulfato de estreptomicina en una balanza analítica. Coloque el int sulfato de estreptomicinaOA estériles 15 ml tubo cónico. Añadir 4 ml de medio nutriente. Mezclar el contenido brevemente en un mezclador de vórtice. La solución debe ser ligeramente rosado. Almacenar a 4 ° C protegida de la luz. Solución de sulfato de estreptomicina es estable durante 7 días.
- Pesar 20 mg de sulfato de gentamicina en una balanza analítica. Coloque el sulfato de gentamicina en un tubo cónico de 15 ml estéril. Añadir 2 ml de medio nutriente. Mezclar el contenido brevemente en un mezclador de vórtice. La solución debe ser de color amarillo. Almacenar a 4 ° C protegida de la luz. Solución de sulfato de gentamicina es estable durante 7 días.
- Preparar dos 200 ml lotes de medio nutriente suplementado con EGF recombinante humano (10 ng / ml concentración final.), Insulina (10 mg / ml conc.), Sulfato de estreptomicina (100 mg / ml conc.) Y sulfato de gentamicina (20 g / ml concentración final.).
- Añadir 200 ml medio nutriente a un matraz de filtro de vacío equipado con un matraz de filtro de 0,2 micras de polietersulfona y una botella de recibir 250 ml. Añadir 20 y# 181; l madre de trabajo EGF, 200 l de stock de insulina, 2 ml de stock de sulfato de estreptomicina, y 400 l de stock de sulfato de gentamicina a la 200 ml de medio nutriente. Conecte el matraz de filtración al vacío. Filtra el medio. Deseche el filtro y la etiqueta del frasco como "medio rico en nutrientes". Almacenar a 4 ° C durante un máximo de 14 días.
2. Tejido Adquisición y Ventas
- En la sala de operaciones, mantener una técnica estéril después de la adquisición de los tejidos del seno. Coloque el tejido mamario en una bandeja estéril y cubrir la bandeja con papel de plástico estéril.
- Transporte el tejido en la bandeja cubierta de Radiología / Patología como es requerido por su institución. No abra la bandeja. Los plazos de transporte varían dentro de las instituciones. El tejido puede permanecer viable en esta bandeja cubierto a temperatura ambiente durante la escisión posterior de hasta 45 min. Sin embargo, el procesamiento oportuno de los tejidos en un medio rico en nutrientes proporciona las condiciones óptimas para el cultivo organoid posterior.
- Disección de tejido bruto a identificar las áreas de carcinoma ductal in situ dentro del tejido del seno: Usar guantes estériles, cuchillas, bisturís, tejido tinturas para marcar, y vinagre durante la disección de tejidos para mantener la esterilidad de los tejidos.
- Limpie el área de trabajo con etanol al 70% o el 1% de lejía. Abra los guantes estériles y colocar la envoltura de los guantes en la superficie de trabajo. Coloque el interior de la envoltura estéril guante hacia arriba. Póngase los guantes estériles.
- Limpiar la superficie de la recipiente de la muestra con etanol al 70%. Quite la envoltura de plástico del contenedor de muestras de tejido y colocar la muestra en la envoltura del guante.
- Sumerja dos hisopos con punta de algodón en el tinte marcado tejido. Aplicar el colorante a la superficie del tejido haciendo rodar los hisopos a través de la superficie del tejido.
NOTA: Cada departamento de patología tiene un protocolo de orientación color del tinte / tejido estandarizado. Tissue está marcado con colorante para orientar el tejido en relación con su posición en el paciente. El colorante se borró opintada sobre el tejido. No vierta el colorante sobre el tejido. Verter el medio de contraste puede provocar que el medio de contraste para ejecutar / goteo en las grietas de tejido confundiendo así la orientación de los márgenes quirúrgicos. De orientación del tejido proporciona al cirujano y el patólogo con puntos de referencia anatómicos a a) describir la muestra de tejido, y b) determinar la ubicación de los márgenes quirúrgicos en relación con el tumor. - Vierta vinagre blanco destilado (5% de ácido acético) sobre gasas estériles. Seque el tejido teñido con el vinagre empapado gasa. Deseche la gasa. El vinagre se utiliza para fijar la marca de tintes de tejidos.
- Cortar el tejido mamario en rebanadas verticales de aproximadamente 5 mm de espesor. No corte todo el camino a través del tejido (Figura 2). Observar / palpar el tejido para las áreas de calcificación. Identificar lesiones de CDIS por su firma característica, pálida apariencia rojiza rodeada, bordes de goma que se sienten arenosos (debido a las espículas de calcio).
NOTA: En algunos casos, comedo áreas (espinilla-como pueden ser)visto como puntos blancos, que representan el material necrótico de gran diámetro lesiones de CDIS. - Cortar áreas de DCIS / tejido mamario calcificado, incluyendo una pequeña cantidad de tejido circundante del pecho. Coloque el tejido del seno en un tubo de 50 ml estéril que contiene 20-30 ml de medio rico en nutrientes preparado en la etapa 1.
- Mezclar el tejido y por medio suavemente invirtiendo el tubo varias veces. Deseche el medio y añadir medio fresco. Coloque el tubo que contiene el tejido y medio en un contenedor aislado y transportar el tejido al laboratorio de cultivo de tejidos.
- Limpie el área de trabajo con etanol al 70% o el 1% de lejía. Abra los guantes estériles y colocar la envoltura de los guantes en la superficie de trabajo. Coloque el interior de la envoltura estéril guante hacia arriba. Póngase los guantes estériles.
3. Tissue Culture
- Trabajar en un gabinete de seguridad biológica, verter el tejido y una pequeña cantidad del medio nutriente en una placa de Petri estéril. Con un bisturí estéril cortar y desechar el tejido fibroso. Cortar el tejido mamario en piezas (organoides) aproximadamente 3 mm 2 (Figura 1C-D). Trate de cortar el tejido de manera que cada órganooid contiene al menos un segmento de conducto discernible con estroma circundante.
- Abrir la tapa del frasco de cultivo de tejidos. El uso de pinzas o fórceps estériles, colocar los organoides en el matraz. Cierre la tapa. Deseche la placa de Petri.
- Añadir medio rico en nutrientes suero libre de 11 ml (preparado en el paso 1) al matraz de cultivo de tejidos. Cerrar el frasco y agitar el frasco de manera que los organoides y medio se distribuyen de manera uniforme en toda la superficie del matraz (Figura 1E-F).
- Incubar el matraz a 37 ° C en un 5,0% de CO 2 humidificado ambiente durante 2 días. No mueva el frasco durante este tiempo.
- El día 2 de post incubación, retirar el frasco de la incubadora para comprobar la posible contaminación bacteriana / por hongos. Evite movimientos repentinos y agudos, o remolino del matraz. Colocar el matraz en un escenario microscopio invertido.
- Observar el medio para las bacterias, levadura, y / o hongos. Si no se observa contaminación, devuelva el frasco a la incubadora durante un complementodía itional. Si se observa contaminación, deseche el matraz y su contenido en un recipiente apropiado.
- En el día 3 después de la incubación, sustituir el medio con medio fresco acondicionado.
- Colocar 11 ml de medio en un tubo estéril a 37 ° C durante 20-30 min. Retirar el matraz de cultivo de tejidos de la incubadora. Sin molestar a los organoides, retire y deseche el medio en el matraz con una pipeta serológica estéril.
- Utilizando una nueva pipeta serológica estéril, añadir 11 ml de medio fresco precalentado. Girar muy suavemente el frasco para distribuir el medio a través de la superficie del matraz.
- Incubar el matraz a 37 ° C en un 5,0% humidificado atmósfera de CO 2.
4. Mantenimiento de la empresa organoide / colonias de células epiteliales
- Preparar medio fresco cada 2 semanas y reemplazar los medios de comunicación en el matraz de cultivo de tejido 3 veces por semana.
- Colocar 11 ml de medio en un recipiente estéril a 37° C durante 20-30 minutos. Retirar el matraz de la incubadora. Con una pipeta serológica estéril, retire y deseche el medio condicionado del frasco, teniendo cuidado de no molestar a los organoides.
- Utilizando una nueva pipeta serológica estéril, añadir 11 ml de medio fresco precalentado. Girar muy suavemente el frasco para distribuir el medio a través de la superficie del matraz. Incubar el matraz a 37 ° C en un 5,0% humidificado atmósfera de CO 2.
- Después de 10 - 14 días en cultivo, retire todos los trozos de tejido en el frasco de cultivo que no son adherentes.
- Células y / o organoides del matraz para la propagación en nuevos matraces de cultivo periódicamente cosecha, para transplante de xenoinjerto, o para fenotípica y / o análisis molecular.
- Retirar el matraz de cultivo de tejidos de la incubadora. Pulverizar el matraz con etanol al 70%. Limpie el exceso de etanol en el matraz con una toalla de papel limpia que ha sido rociado con etanol al 70%.
- Propagación organoid: <ol>
- Abra la tapa del frasco y coloque la tapa boca arriba en la cabina de seguridad biológica. Bajo la visualización microscópica, localizar el organoide (s) para ser cosechado. Utilice pinzas o fórceps estériles para recoger un organoide.
- Para propagar la organoide en un nuevo frasco de cultivo, coloque el organoide en el nuevo frasco. Añadir 11 ml de medio fresco, cálido. Incubar a 37 ° C, en una atmósfera de 5% CO 2 humidificado tal como se describe en los pasos 3.3 - 3.6.3. Sustituir el medio de cultivo celular en el cultivo de tejidos matraz de tres veces por semana.
- La recolección de células:
- Bajo vixualization microscópico directo, raspan suavemente y las células de aspirado y mammospheres utilizando una pipeta de 1.000 l con puntas de pipeta desechables estériles. Aspirar las células y el medio circundante. Prescindir de la células / medio en un tubo de microcentrífuga estéril.
- Haga girar las células brevemente en un mini-centrifugar a 12.100 xg durante 5 seg. Retire y deseche el medio. <ol>
- Para el análisis de ADN, congelar inmediatamente el sedimento de células en hielo seco, en un pequeño volumen de medio (10 l), con almacenamiento a largo plazo a -80 ° C.
- Para el análisis proteómico, la lisis de las células en 10 l de urea 8 M para espectrometría de masas o 2x SDS tampón tris-glicina para el Western Blot / inversa microarrays de proteínas de fase. Alternativamente, las células girar en una citocentrífuga para hacer frotis de células para el análisis inmunohistoquímico.
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Representative Results
Flujo de trabajo para la adquisición y el cultivo de carcinoma ductal de mama estéril en el tejido in situ
Esterilidad El tejido mamario se mantiene desde el quirófano al laboratorio de cultivo celular a través de pequeños cambios en el flujo de trabajo típico de patología del hospital (Figura 1). El tejido se transporta en un recipiente estéril con una cubierta de película de plástico que permite la evaluación radiológica, mientras que se mantiene la esterilidad del tejido. Procesamiento de tejido bruto de una muestra tumorectomía de mama o mastectomía se realiza con guantes estériles, cuchillas, y el marcado de tejido colorantes. Aspecto morfológico bruto de carcinoma ductal in situ de mama se asemeja a las zonas pálidas, ligeramente elevadas con una textura arenosa / empresa, rodeado por el tejido de goma de color rojizo / amarillo. Las áreas de hiperplasia ductal y carcinoma ductal in situ pueden sentirse "valiente" y firme debido a calcificaciones. Estas áreas de tejido de mama a menudo parecen tan o un color ligeramente diferente que el tejido circundante del seno. Sin embargo, ADH cun solo distinguirse tras la recogida de tejidos y la revisión patológica de las secciones de tejidos teñidos. Tejido de mama sigue siendo viable mediante la inmersión de los tejidos y / o organoides ductales en un medio nutriente libre de suero suplementado con EGF humano recombinante (10 ng / ml), insulina (10 mg / ml), sulfato de estreptomicina (100 mg / ml) y sulfato de gentamicina (20 g / ml) 5. Frascos de cultivo celular con tapas removibles / resellable permiten la recolección periódica de células / organoides (Figura 1E-F). Este modelo propaga con éxito de mama lesiones pre-invasivas humanos de más de 20 pacientes diagnosticados con hiperplasia ductal atípica (n = 2) y carcinoma ductal in situ (n = 18).
Mammosphere formación espontánea in vitro e in vivo
Mammospheres y estructuras 3-D surgieron espontáneamente a partir de múltiples fragmentos de tejido, independientes de los conductos humanos DCIS de diferentes pacientes diagnosticados con hiper ductal atípicadisplasia o carcinoma ductal in situ (Figura 3 y 4) 5,9. Alteración enzimática del tejido de mama no se realizó antes de cultivo de tejidos, lo que resultó en un cultivo de células tipo mixto. Se requirieron ni suero, extracto de matrices membrana basal, ni gel-como para la formación de mammosphere espontánea (Figura 4). Los mammospheres generado xenoinjertos de tumores mamarios en un modelo de ratón NOD / SCID con el mismo patrón de crecimiento como el de cáncer invasivo (Figura 5) 5. Estos resultados demuestran que las células progenitoras con potencial invasivo pre-existir dentro de la mama humana CDIS conducto pero al parecer se mantienen bajo control por el nicho ductal y pueden ser inducidas a surgir en la cultura organoide. Estas células constituyen una nueva categoría de células-madre como de mama que existen antes de la manifestación abierta de la 5,9,10 fenotipo invasivo.
Confirmación de epiteliales derivadas mammospheres y xenografts
Los mammospheres y xenoinjertos derivados de los mammospheres fueron confirmados por inmunofluorescencia como tener orígenes epiteliales. Molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) es una glicoproteína de membrana expresada en las células epiteliales 11. La inmunofluorescencia con un anticuerpo monoclonal de ratón reactivo a EpCAM humana (verde) y una tinción nuclear (DAPI, azul) mostró células positivas EpCAM en las mammospheres en cultivo (Figura 6A) y el centro de un xenoinjerto de NOD / SCID (Figura 6B).
Verificación de los límites de la membrana basal intacta
El mammosphere formando, las células epiteliales neoplásicas en este sistema de cultivo se obtuvieron a partir de las lesiones pre-invasoras de mama que estaban desprovistos de invasión o microinvasión franca, según lo verificado por análisis patológico independiente bajo nivel de diagnóstico histopatológico cuidado. Múltiples estructuras de organoides del mismo paciente generado para mammosphereming colonias que resultaron ser tumorigénico. Además, el examen histopatológico del tejido utilizado para el cultivo organoide reveló lesiones intraductales confluentes con los límites de la membrana basal intacta (Figura 7b) 5. Por lo tanto se puede concluir que los mammospheres espontáneos formados en este sistema de cultivo se derivan sólo de las áreas neoplásicas pre-invasivas y no son un producto de las áreas raras de microinvasión 5.
Figura 1. Flujo de trabajo para el mantenimiento de la esterilidad del tejido durante la exploración radiológica y disección bruto tejido. (A) En la sala de operaciones, el tejido de mama (tumorectomía muestra se muestra) se coloca en una bandeja estéril y cubierto con una envoltura de plástico estéril. El tejido se pueden obtener imágenes directamente en la bandeja de plástico. (B) Tejido recaudación para identificar áreas de DCIS. De un solo uso sólo tintes de orientación del tejido están pintadas sobre la superficie del tejido de algodón estéril utilizando hisopos con punta. Hogar de vinagre blanco destilado se vierte directamente sobre el tejido y se transfirió con una gasa de algodón estéril. (C y D) El tejido mamario se transporta al laboratorio de cultivo de tejidos en medio rico en nutrientes suplementado con antibióticos. La disección de tejidos, para aislar las áreas de carcinoma ductal in situ, se lleva a cabo utilizando guantes estériles y hojas / escalpelos / tijeras. El tejido CDIS se corta en varios organoides de la cultura. (E y F) Cultivo in vitro de organoides de mama. DCIS tejido humano se coloca directamente en frascos de cultivo de tejidos con tapas removibles, sin digestión enzimática previa del tejido. Una cantidad mínima de medio de cultivo libre de suero suplementado con factor de crecimiento epidérmico y la insulina apoya el crecimiento celular mientras se mantiene una interfaz aire-líquido alrededor de la organoide.6fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 2. Ilustración de procesamiento de tejidos bruto para el tejido de mama DCIS. La lumpectomía o mastectomía tejido se corta en láminas delgadas por cortado el tejido verticalmente sin cortar todo el camino a través de la muestra. Este método de disección se refiere a menudo como "técnica de hogaza de pan", ya que el tejido cortado se asemeja a una barra de pan. El área (s) se sospecha que contiene el CDIS se cortó y cortó en 2 - 3 rebanadas mm para la patología de diagnóstico y la cultura organoide.
Figura 3. Una cultura tipo de células mixtasmantiene representativa en las poblaciones de células in vivo. (A) Imagen de contraste de fase de cultivo celular mixto generado a partir de mama DCIS lesiones de más de 11 semanas (de aumento 4X). (B y C) in vitro organoid cultivo con éxito propagado el DCIS deriva células epiteliales con el crecimiento de anclaje independiente, definida como crecimiento hacia arriba y mammospheres expansión y lobulada, formaciones en 3-D de forma tubular, en medio libre de suero suplementado con EGF, la insulina, la estreptomicina y la gentamicina (aumento 10X). (D) Ejemplo mammosphere formó después de 11 semanas en cultivo (aumento 40X). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 4. espontáneaformación de mammospheres en la cultura organoid libre de suero. Un ejemplo formación mammosphere siguientes 33 días de cultivo (magnificación 10X, 20X recuadro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura / modelo de xenoinjerto de ratón SCID 5. NOD. Xenoinjertos se generaron mediante la inyección de células epiteliales derivadas de una paciente diagnosticada de carcinoma ductal in situ (botón derecho del ratón almohadilla de grasa mamaria) o de un paciente con diagnóstico de CDIS invasiva (ratón a la izquierda de la almohadilla de grasa mamaria). Xenoinjertos derivados de tanto pura DCIS e invasiva CDIS revelaron un patrón de crecimiento similar y tasa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de tsu figura.
Figura 6. mammospheres se confirman a ser de origen epitelial. Inmunofluorescencia con anti-EpCAM conjugado con FITC fue usado para confirmar el origen epitelial de mammospheres y xenoinjertos de ratón generados a partir de conductos mamarios que contienen DCIS. Células positivas EpCAM-FITC (A) (pseudo- de color verde, 488 nm) sólo se observaron en mammospheres de los cultivos de células mixtas que emanan de organoides de mama (DAPI (azul de color de pseudo, 408 nm) tinción nuclear). (B) en formol fija embebidos en parafina secciones de tejidos de xenoinjerto de ratón, EpCAM positivo células sólo se detectaron en el centro de la sección de tumor de xenoinjerto. (Ampliación 20X) Haga clic aquí para ver una versión más grande de este figure.
Figura 7. El colágeno IV inmunohistoquímica revela membranas basales intactas que rodean los conductos. Conductos mamarios normales (A) están rodeados por membranas basales intactas enriquecidas en colágeno IV (Diaminobencidina = tinción de color marrón). A raíz de la cultura organoide, tejido mamario también contiene las membranas basales intactas que confirman que los mammospheres se derivan de las áreas de carcinoma ductal in situ y no de cáncer invasivo (colágeno inmunohistoquímica IV, el panel de ampliación Una 4X, 10X panel B). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
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Discussion
El sistema de cultivo se describe en el presente documento constituye un nuevo modelo para la generación que viven las células mamarias tumorales pre-invasivas para estudios básicos y traslacionales de investigación. En el pasado, la progresión del cáncer de mama pre-maligna típicamente se ha estudiado utilizando tres métodos diferentes. El primer método es histopatológico y el análisis genético de microdissected especímenes humanos congelados o fijos 12-14. El segundo método utiliza modelos de ratón que contienen nódulos alveolares (lesiones hiperplásicas HAN) que se cree que son similares a las lesiones de mama invasivos humanos pre-15. El tercer modelo utiliza estableció líneas celulares de carcinoma de mama, tales como sublíneas MCF7 (MCF10A) que tienen un carcinoma ductal in situ altamente diferenciados como la morfología de 3,4. Aunque estos tres modelos se han proporcionado pistas moleculares a la progresión del cáncer de pecho, ninguno de estos métodos son capaces de evaluar el potencial maligno o el fenotipo molecular en lesión (s) de un paciente individual. Histopathanálisis ologic no proporciona información sobre el fenotipo funcional de las células en las lesiones pre-invasoras. El modelo de ratón de la progresión del cáncer de mama puede no reflejar con exactitud la histomorfología y la diversidad de la hiperplasia ductal atípica humano, el carcinoma lobulillar in situ, y el carcinoma ductal in situ 16-18. Además, el microambiente del estroma y la deposición de matriz extracelular que rodean las lesiones precursoras de ratón son marcadamente diferentes de la contraparte humana 16. Lesiones precursoras murinas espontáneas pueden exhibir un nivel muy bajo de progresión a la invasión y metástasis. El tercer método, las líneas celulares cultivadas, sólo puede proporcionar información fenotípica funcional si trasplantado en huéspedes inmunes suprimidos 3,4. Además, las anomalías genéticas de una línea celular de largo a pases pueden no representar la progresión espontánea cáncer de mama en seres humanos 2. Finalmente, está bien establecido que la neoplasia de cada pacientetiene una combinación única de anomalías genéticas y epigenéticos que conducen a la tasa de crecimiento, estado diferenciado, y la progresión de la invasión y la metástasis 13,14,17. Lesiones pre-invasoras humanos son multifocal y heterogénea en su composición celular y histomorfología. Además, el potencial maligno biológica es desconocida para la lesión pre-invasiva de un paciente individual.
Nuestro método de cultivo de tejidos primaria supera las deficiencias de los modelos anteriores de cáncer de mama antes de la invasión humana y proporciona las siguientes ventajas: 1) El sistema de cultivo organoid apoya el crecimiento de las poblaciones de células neoplásicas en el microambiente del tejido nativo que espontáneamente crecer y generar mammospheres que producirán tumores invasivos en modelos de xenoinjertos de ratón. Las células representan el genotipo y el fenotipo de un paciente individual y por lo tanto proporcionan información para la terapia personalizada, o pronóstico individual. 2) El sistema de cultivo maint organoideAINS las subpoblaciones celulares nativas y proporciona un medio para cultivar células no malignas epiteliales, células del estroma y las células inmunes presentes originalmente en el tejido de mama primario, y llevado a la cultura dentro de la organoide. El bajo volumen de medios de comunicación en el sistema de cultivo permite el intercambio de oxígeno fomentar la formación espontánea mammosphere y conducto diferenciado y alvéolos como estructuras sin la necesidad de un andamio de tres dimensiones artificial. 3) El cultivo de células primarias está libre de modificaciones y selección generados por disociación enzimática o la modificación genética exógena. Además, el medio nutriente es de bajo costo y fáciles de preparar. 4) Molecular y el análisis genético puede llevarse a cabo en poblaciones de células específicas y / o organoides de la cultura en diferentes puntos en el tiempo sin interrumpir toda la cultura. 5) El sistema de cultivo organoide permite el crecimiento, morfología diferenciada y célula-célula interacciones de las poblaciones de células nativas que puedenser estudiados antes y después de la introducción de agentes terapéuticos en los medios de cultivo.
Aunque el cultivo de tejido primario tiene ciertas ventajas, no es sin limitaciones. La cultura organoide apoya el crecimiento de los cultivos celulares mixtos, sin crecimiento excesivo de un tipo determinado de célula. Sin embargo, la relación específica de tipos de células no puede ser controlada y por lo tanto no puede recapitular las proporciones celulares exacto encontrado in vivo. Cultivo organoid exitosa requiere la recogida de tejidos estéril y procesamiento, los cuales no son procedimientos de rutina en muchos laboratorios de patología del hospital de la comunidad. La buena comunicación entre los investigadores clínicos, el personal quirúrgico, y el personal de la patología son esenciales para mantener la esterilidad de la muestra dentro del continuo de la atención al paciente.
Una limitación adicional de la cultura organoide es el efecto de firmeza sustrato sobre el fenotipo celular y la expresión génica 16,19. La diferenciación de las células madre en cultivopuede ser inducida mediante la adición de medio que contiene suero o puede ser debido al tiempo prolongado en cultivo. Un fenotipo-tallo como se mantuvo después de varios meses de esto, el sistema de cultivo libre de suero organoid no enzimática 5. Sin embargo, en algún punto en el tiempo, las células pueden diferenciarse que se puede ver morfológicamente - las células se hacen más pequeñas, más densas, y dejar de formar mammospheres. Para evitar posibles problemas con los cambios en el fenotipo de células a través del tiempo, experimentos moleculares, tales como transfecciones o derribar los ensayos, se debe realizar con las culturas jóvenes en lugar de con las culturas antiguas (más de 6 meses).
Las claves de la cultura organoide éxito están usando un volumen apropiado de medio en el frasco de cultivo, y permitiendo que el tiempo de organoides se adhiera al matraz de cultivo de tejidos. El exceso en el medio de difusión límites matraz de oxígeno, lo que inhibe la formación de mammosphere. Los primeros 3-7 días de cultivo de tejidos son críticos para los organoides se unan a la tisdemandar frasco de cultivo. En general, si un organoide no ha unido por día 14, es probable que no contiene ningún segmentos viables ductal DCIS y no se convertirá adherente. Organoides que no están adheridas a día 14 deben ser retirados de la cultura. La falta de mama viable conductos DCIS puede ser verificado después del cultivo mediante la fijación de la organoide en 10% de formalina y procesar el tejido en bloques de parafina para la tinción del tejido y la evaluación microscópica.
Nuestro no enzimática, los hallazgos del sistema de cultivo sin suero apoyan la hipótesis de que existen células precursoras neoplásicas genéticamente anormales con potencial invasor dentro de las lesiones pre-invasoras de mama humano 5,9,20. Este resultado está en consonancia con el trabajo previo de Sgroi et al., Que llevó a cabo el análisis genético de mama humano lesiones pre-invasoras y Damonte et al., Que estudió la mamaria consecuencia neoplasia intraepitelial (Mino) modelo murino de la progresión del cáncer de mama 12,14 , 21. Toge TomadoTher con las conclusiones de otros, nuestro modelo de cultivo de las lesiones pre-invasoras cada paciente apoya el concepto de que el fenotipo agresivo de cáncer de mama invasivo de un paciente puede ser en gran medida pre-determinado en la etapa de pre-invasiva.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por (1) el Programa de Investigación del Cáncer (US Army Medical Investigación Adquisición Actividad) premio # W81XVVH-10-1-0781 a LAL y VE, y (2) la donación de la Fundación Susan G. Komen Breast Departamento de Defensa IR122224446 a Lal y VE. Apoyo Patología y taquillera tejido fue proporcionado amablemente por Inova Fairfax Departamento de Patología, el Dr. Hassan Nayer, el Dr. A. Gita Menezes, y el Dr. Charles Bechert. El consentimiento del paciente y la adquisición de la muestra fue hábilmente guiados por Inova Fairfax Hospital coordinadores de investigación clínica del acebo Gallimore, Heather Huryk, y Emil Kamar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10 cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2 µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10 mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100 µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10 mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10 mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22 µm PES membrane |
| 25 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115 cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 °C, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8 M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
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