Summary
Coltura cellulare primaria utilizzando organoidi tessuto intatto fornisce un sistema modello che simula il microambiente multi-cellulare in vivo. Abbiamo sviluppato un primo modello di coltura di tessuti epitelio mammario senza siero che perpetua linee di colture cellulari miste e mostre differenziati morfologia, senza interruzione del tessuto enzimatico. Organoidi seno rimangono vitali per> 6 mesi.
Abstract
Breast carcinoma duttale in situ (DCIS), per definizione, è la proliferazione delle cellule epiteliali neoplastiche entro i confini del condotto del seno, senza violare la membrana basale collagene. Mentre carcinoma duttale in situ è un precursore non obbligato a tumori al seno invasivi, i meccanismi molecolari e le popolazioni di cellule che permettono la progressione a carcinoma invasivo non sono completamente noti. Per determinare se le cellule progenitrici capaci di invasione esistevano all'interno della popolazione di cellule carcinoma duttale in situ, abbiamo sviluppato una metodologia per la raccolta e la coltura di tessuto mammario umano sterile al momento della chirurgia, senza interruzione enzimatica del tessuto.
Tessuto del seno sterile contenente segmenti duttali è raccolto da tessuto mammario asportato chirurgicamente dopo esame patologico di routine. Tessuto contenente DCIS è posto in ricca di nutrienti, antibiotici contenenti, mezzo privo di siero, e trasportato al laboratorio di coltura di tessuti. Il tessuto del seno è più dissected per isolare le zone calcificate. Molteplici pezzi di tessuto mammario (organoidi) sono posti in un volume minimo di mezzo privo di siero in un pallone con un coperchio amovibile e coltivate in un incubatore umidificato CO 2. Popolazioni di cellule epiteliali e fibroblasti emergono dal organoide dopo 10 - 14 giorni. Mammospheres spontaneo formarsi intorno e sul monostrato di cellule epiteliali. Specifiche popolazioni cellulari possono essere raccolte direttamente dal pallone senza interrompere le cellule vicine. Il nostro sistema di coltura di tessuti non-enzimatica rivela affidabile citogeneticamente anormali, invasive cellule progenitrici di nuove lesioni DCIS umani.
Introduction
Proliferazione delle cellule epiteliali entro i confini di dotti mammari e alveoli (carcinoma duttale in situ) è riconosciuto come un precursore obbligato a duttale invasivo e carcinoma mammario lobulare. Tuttavia, i meccanismi molecolari e dinamica delle popolazioni di cellule che consentono la progressione a carcinoma invasivo sono poco conosciuti. Chiarire i meccanismi di sopravvivenza utilizzate da cellule di carcinoma mammario pre-invasive, o qualsiasi tumore pre-invasivo, può rivelare strategie terapeutiche per l'uccisione, o addirittura prevenire, neoplasie pre-invasive 1. Tuttavia, i metodi a basso costo per semplici funzionalmente studiano lesioni pre-invasive umani sono mancati. Sebbene monostrato coltura in vitro di linee cellulari trasformate è un metodo di laboratorio stabilita, il fenotipo e il genotipo di queste linee cellulari immortalizzate riesce ricapitolare lo stato molecolare delle cellule tumorali umane primarie 2. Inoltre, anche la linea cellulare MCF-10A non oncogeno, che Recapitulates 3-D architettura della ghiandola mammaria, non riesce a rappresentare adeguatamente il fenotipo funzionale e le caratteristiche molecolari di pre-invasiva della lesione al seno di un singolo paziente 3,4.
Per determinare se le cellule staminali neoplastiche, come in grado di invasione esistevano all'interno del carcinoma duttale in situ (DCIS) popolazione di cellule, abbiamo sviluppato una metodologia per la raccolta e la coltura di tessuto mammario umano sterili al momento dell'intervento chirurgico (Figura 1) 5. Il nostro ex vivo seno sistema di coltura organoide non si basa sulla rottura enzimatica dei tessuti, estratto di membrana basale della matrice, o fibroblasti esaurimento, per isolare e propagare le cellule che formano mammosphere dal fresco duttale mammario umano carcinoma tessuto 6-8. Il nuovo sistema si basa sul principio della cella di flusso / migrazione 5. I dotti mammari discernibili e stroma circostante vengono immersi in un volume minimo di mezzo privo di siero nutriente (solo postanough per coprire i frammenti cassone) per massimizzare lo scambio di gas, con la superficie di taglio del condotto esposta al mezzo di coltura, ma in nessun orientamento specifico nel pallone (Figura 1E-F). Questo sistema di coltura consente alle cellule di migrare dal condotto e nella / sulla stroma e la cultura matraccio autologo. Il mezzo nutriente, integrato solo con Epidermal Growth Factor (EGF), l'insulina, e gli antibiotici, sostiene la crescita di popolazioni cellulari miste provenienti dalla organoide. Il pallone di coltura tissutale ha un coperchio richiudibile rimovibile che permette ai organoidi e / o cellule per essere raccolti senza interrompere l'intero boccetta adiacente organoidi, pur mantenendo un ambiente umidificato sterile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tessuto mammario umano è stato raccolto da pazienti arruolati in uno studio di ricerca, con il consenso informato scritto, in seguito Dipartimento della Difesa, George Mason University, e protocolli approvati di Inova Health System Institutional Review Board.
1. Preparare nutrienti Rich Media con fattori di crescita e antibiotici
- Preparare soluzioni di riserva di insulina, fattore di crescita epidermico (EGF), solfato di streptomicina e gentamicina solfato.
- Ricostituire insulina in acqua filtrata sterile a una concentrazione finale di 10 mg / ml. Aspirare 10 ml di tipo 1 acqua distillata in una sterile 10 ml siringa monouso. Collegare un filtro da 0,22 micron polietersulfone alla siringa. Versare l'acqua filtrata sterile, in un tubo da 15 ml sterile.
- Aggiungere 10 ml di acqua filtrata sterile per un flaconcino da 100 mg di insulina. Mescolare il contenuto brevemente su un vortex. Conservare il flaconcino dell'insulina sul ghiaccio. Dispensare 450 ml di insulina magazzino Soluzione in etichetta, microprovette sterili e conservare a -20 ° C. L'insulina soluzione madre è stabile fino alla data di scadenza sul flacone.
- Preparare soluzione madre del fattore di crescita epidermico (EGF): Aggiungere 500 ml di acqua sterile a 500 mg FEG (azione 1 mg / mL). Mescolare il contenuto brevemente su un vortex. Conservare il flaconcino FEG sul ghiaccio.
- Preparare una soluzione madre di lavoro del FEG: Aggiungere 100 ml di soluzione madre FEG a 900 microlitri terreno nutritivo (brodo di lavoro sarà di 0,1 mg / mL). Mescolare il contenuto brevemente su un vortex. Dispensare 50 ml di soluzione di FEG di lavoro stock in etichetta, microprovette sterili e conservare a -80 ° C.
NOTA: soluzione madre EGF (1 mg / mL) è stabile per 1 anno a -80 ° C; lavora soluzione madre (0.1 mg / mL) è stabile per 2 mesi a -80 ° C.
- Preparare una soluzione madre di lavoro del FEG: Aggiungere 100 ml di soluzione madre FEG a 900 microlitri terreno nutritivo (brodo di lavoro sarà di 0,1 mg / mL). Mescolare il contenuto brevemente su un vortex. Dispensare 50 ml di soluzione di FEG di lavoro stock in etichetta, microprovette sterili e conservare a -80 ° C.
- Pesare 40 mg di solfato di streptomicina su una bilancia analitica. Posizionare il int streptomicina solfatooa sterili tubo da 15 ml. Aggiungere 4 ml di terreno di coltura. Mescolare il contenuto brevemente su un vortex. La soluzione deve essere leggermente rosa. Conservare a 4 ° C al riparo dalla luce. Soluzione di solfato di streptomicina è stabile per 7 giorni.
- Pesare 20 mg di solfato di gentamicina su una bilancia analitica. Posizionare il solfato di gentamicina in un tubo da 15 ml sterile. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura. Mescolare il contenuto brevemente su un vortex. La soluzione deve essere di colore giallo. Conservare a 4 ° C al riparo dalla luce. Soluzione di solfato di gentamicina è stabile per 7 giorni.
- Preparare due 200 ml lotti di terreno nutriente addizionato con EGF umano ricombinante (10 ng / ml conc def.), Insulina (10 mcg / ml conc def.), Solfato di streptomicina (100 mcg / ml conc def.) E solfato di gentamicina (20 ug / ml conc def.).
- Aggiungere mezzo 200 ml di nutrienti una beuta per filtrazione a vuoto equipaggiato con una beuta per filtrazione 0,2 micron polietersulfone e ricevere flacone 250 ml. Aggiungere 20 &# 181; l stock di lavoro FEG, 200 ml brodo di insulina, 2 ml di brodo di streptomicina solfato, e 400 microlitri magazzino gentamicina solfato ai 200 ml di terreno di coltura. Attaccare beuta per filtrazione a vuoto. Filtrare il mezzo. Eliminare il filtro e l'etichetta del pallone come "terreno ricco di sostanze nutritive". Conservare a 4 ° C per un massimo di 14 giorni.
2. Acquisizione dei tessuti e di incassi
- In sala operatoria, mantenere una tecnica sterile dopo procurare il tessuto del seno. Posizionare il tessuto del seno in un vassoio sterile e coprire il vassoio con pellicola trasparente sterile.
- Trasportare il tessuto nel vassoio coperto di Radiologia / patologia come richiesto dal vostro istituto. Non aprire il cassetto. Tempi di trasporto variano all'interno delle istituzioni. Tessuto può rimanere vitale in questo vassoio coperto a temperatura ambiente per un massimo di 45 minuti dopo l'escissione. Tuttavia, rapida trasformazione del tessuto in terreno ricco di sostanze nutritive offre le condizioni ottimali per la successiva cultura organoide.
- Dissezione dei tessuti lordo per identificare le aree di carcinoma duttale in situ all'interno del tessuto del seno: Utilizzare guanti sterili, lame, bisturi, tessuto coloranti marcatura e aceto durante la dissezione dei tessuti per mantenere la sterilità dei tessuti.
- Pulire l'area di lavoro con il 70% di etanolo o 1% di candeggina. Aprire i guanti sterili e posizionare l'involucro guanto sul piano di lavoro. Posizionare l'interno del guanto sterile involucro a faccia in su. Indossare i guanti sterili.
- Pulire la superficie del contenitore del campione con il 70% di etanolo. Rimuovere la pellicola trasparente dal contenitore del campione del tessuto e posizionare il campione sulla confezione guanto.
- Immergere due tamponi di cotone con punta nella tintura dei tessuti marcatura. Applicare il colorante alla superficie del tessuto facendo rotolare i tamponi sulla superficie del tessuto.
NOTA: Ogni reparto di patologia ha un protocollo di orientamento colore della tintura / tessuto standardizzato. Tissue è etichettato con la tintura per orientare il tessuto in relazione alla sua posizione nel paziente. Il colorante viene cancellato odipinto sul tessuto. Non versare il colorante sul tessuto. Versare il colorante può causare il colorante per eseguire / goccia a goccia in fessure del tessuto confondendo in tal modo l'orientamento dei margini chirurgici. Orientamento tessuto fornisce al chirurgo e patologo con reperi anatomici ad a) descrive il campione di tessuto, e b) determinare la posizione dei margini chirurgici in relazione al tumore. - Versare aceto bianco distillato (5% di acido acetico) su garze sterili. Asciugare il tessuto tinta con la garza imbevuta di aceto. Eliminare la garza. L'aceto è usato per fissare la marcatura tinture dei tessuti.
- Tagliare il tessuto mammario a fette verticali spesse circa 5 mm. Non tagliare tutto il percorso attraverso il tessuto (Figura 2). Osservare / palpare il tessuto per le aree di calcificazione. Identificare le lesioni DCIS dalla loro impresa caratteristico, pallido aspetto circondato da rossastro, confini gommose che si sentono grintoso (a causa di spicole di calcio).
NOTA: In alcuni casi, comedo (brufolo-like) aree possono esserevisto come puntini bianchi, che rappresentano il materiale necrotico dal grande diametro lesioni DCIS. - Tagliare le aree di carcinoma duttale in situ / tessuto mammario calcificata, tra cui una piccola quantità di tessuto mammario circostante. Posizionare il tessuto del seno in una provetta sterile da 50 ml contenente 20-30 ml di terreno ricco di sostanze nutritive preparato al punto 1.
- Mescolare il tessuto e medie capovolgendo delicatamente il tubo più volte. Eliminare il medio e aggiungere mezzo fresco. Posizionare il tubo contenente il tessuto e medio in un contenitore coibentato e trasportare il tessuto al laboratorio coltura tissutale.
- Pulire l'area di lavoro con il 70% di etanolo o 1% di candeggina. Aprire i guanti sterili e posizionare l'involucro guanto sul piano di lavoro. Posizionare l'interno del guanto sterile involucro a faccia in su. Indossare i guanti sterili.
Cultura 3. Tessuto
- Lavorando in una cappa di sicurezza biologica, versare il tessuto e una piccola quantità del mezzo nutritivo in una piastra di Petri sterile. Usando un bisturi sterile tagliato via ed eliminare il tessuto fibroso. Tagliare il tessuto del seno in pezzi (organoidi) circa 3 mm 2 (Figura 1C-D). Prova a tagliare il tessuto in modo che ciascun organooid contiene almeno un segmento di condotto distinguibile con stroma circostante.
- Aprire il coperchio del pallone di coltura tissutale. Con una pinzetta sterili o pinze, inserire i organoidi nel pallone. Chiudere il coperchio. Gettare la capsula di Petri.
- Aggiungere 11 ml di terreno ricco di nutrienti privo di siero (preparato al punto 1) al pallone di coltura tissutale. Chiudere il flacone e agitare il pallone in modo che i organoidi e le medie sono distribuiti uniformemente su tutta la superficie pallone (Figura 1E-F).
- Incubare il matraccio a 37 ° C in un umidificata 5,0% di CO 2 ambiente per 2 giorni. Non spostare il pallone durante questo periodo.
- Il giorno 2 dopo incubazione, togliere il pallone dal termostato per controllare la potenziale contaminazione batterica / fungina. Evitare improvvisi, movimenti bruschi, o vorticoso del pallone. Porre il pallone su una fase microscopio invertito.
- Osservare il mezzo per batteri, lieviti e / o funghi. Se si nota nessuna contaminazione, restituire il pallone incubatore per un addgiorno transi-. Se si nota la contaminazione, scartare il matraccio con il contenuto in un apposito contenitore.
- Il giorno 3 dopo incubazione, sostituire il terreno condizionato con terreno fresco.
- Porre 11 ml di terreno in una provetta sterile a 37 ° C per 20-30 min. Togliere il pallone di coltura di tessuto dal termostato. Senza scomodare i organoidi, rimuovere ed eliminare il supporto nel pallone con una pipetta sierologica sterile.
- Utilizzando una nuova sierologica pipetta sterile, aggiungere 11 ml di mezzo fresco preriscaldata. Ruotare molto delicatamente il pallone di distribuire il mezzo attraverso la superficie matraccio.
- Incubare il matraccio a 37 ° C in un umidificata 5,0% di CO 2 nell'atmosfera.
4. Manutenzione del Fondata colonie di cellule organoide / epiteliali
- Preparare terreno fresco ogni 2 settimane e sostituire il supporto nel pallone di coltura tissutale 3 volte alla settimana.
- Porre 11 ml di terreno in un contenitore sterile a 37° C per 20-30 min. Togliere la beuta dal termostato. Usando una pipetta sierologica sterili, rimuovere ed eliminare il medium condizionato dal pallone, facendo attenzione a non disturbare i organoidi.
- Utilizzando una nuova sierologica pipetta sterile, aggiungere 11 ml di mezzo fresco preriscaldata. Ruotare molto delicatamente il pallone di distribuire il mezzo attraverso la superficie matraccio. Incubare il matraccio a 37 ° C in un umidificata 5,0% di CO 2 nell'atmosfera.
- Dopo 10 - 14 giorni in coltura, rimuovere tutti i pezzi di tessuto nel pallone di coltura che non sono aderenti.
- Cellule Periodicamente raccolta e / o organoidi dal pallone per la propagazione in nuove fiasche di coltura, per il trapianto di xenotrapianto, o per fenotipica e / o l'analisi molecolare.
- Togliere il pallone di coltura di tessuto dal termostato. Spruzzare il pallone con il 70% di etanolo. Rimuovere l'eccesso di etanolo sul pallone con un tovagliolo di carta pulito che è stato spruzzato con il 70% di etanolo.
- Propagazione organoide: <ol>
- Aprire il coperchio della muffola e posizionare il coperchio rivolto verso l'alto nella cappa di sicurezza biologica. Sotto la visualizzazione microscopica, individuare il organoide (s) per essere raccolto. Utilizzare le pinzette sterili o pinze per pick-up di un organoide.
- Per propagare la organoide in un nuovo pallone di coltura, posizionare il organoide nel nuovo fiasco. Aggiungere 11 ml di fresco, di medio caldo. Incubare a 37 ° C, in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera come descritto ai punti 3.3 - 3.6.3. Sostituire il terreno di coltura cellulare in coltura tissutale pallone a tre volte alla settimana.
- Raccolta delle cellule:
- Sotto vixualization microscopico diretto, raschiare delicatamente e le cellule aspirare e mammospheres con una pipetta 1000 ml con puntali per pipette sterili monouso. Aspirare le cellule e mezzo circostante. Erogare il cellule / medio in una provetta sterile.
- Spin le cellule brevemente un mini-centrifugare a 12.100 xg per 5 sec. Rimuovere e gettare il medium. <ol>
- Per l'analisi del DNA, congelare immediatamente il pellet di cellule in ghiaccio secco, in un piccolo volume di terreno (10 ml), con una lunga conservazione a -80 ° C.
- Per l'analisi proteomica, lisare le cellule in 10 ml di 8 M urea per la spettrometria di massa o 2x SDS tampone Tris-glicina per blotting / inversione di microarrays della proteina di fase occidentali. In alternativa, far girare le cellule in una citocentrifuga per fare strisci cellulari per l'analisi immunoistochimica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flusso di lavoro per l'approvvigionamento e la coltura sterile carcinoma duttale mammario in situ dei tessuti
Sterilità tessuto mammario viene mantenuta dalla sala operatoria al laboratorio di colture cellulari attraverso piccole modifiche in tipico flusso di lavoro patologia ospedale (Figura 1). Tessuto viene trasportato in un contenitore sterile con un coperchio film plastico che consente la valutazione radiologica pur mantenendo la sterilità dei tessuti. Processazione dei tessuti lordo di un campione mastectomia parziale seno o mastectomia viene eseguita con guanti sterili, pale, e coloranti marcatura di tessuto. Aspetto morfologico lordo del carcinoma duttale in situ della mammella assomiglia pallido, zone leggermente in rilievo con un / consistenza compatta granulosa, circondata da tessuto gommoso rossastro / giallo. Aree di iperplasia duttale e DCIS possono sentirsi "grintoso" e ferma a causa di calcificazioni. Queste aree di tessuto mammario spesso appaiono marrone chiaro o un colore leggermente diverso rispetto al tessuto mammario circostante. Tuttavia, ADH cun essere distinto solo dopo il prelievo del tessuto patologico e la revisione delle sezioni di tessuto colorate. Il tessuto mammario rimane vitale immergendo i tessuti e / o organoidi duttali in terreno privo di siero nutritivo addizionato con EGF umano ricombinante (10 ng / ml), insulina (10 mcg / ml), streptomicina solfato (100 mcg / ml) e solfato di gentamicina (20 mcg / ml) 5. Fiasche di coltura cellulare con coperchio rimovibile / richiudibile permettono la raccolta periodica di cellule / organoidi (Figura 1E-F). Questo modello propagato con successo al seno lesioni pre-invasive umani da più di 20 pazienti con diagnosi di iperplasia duttale atipica (n = 2) e il carcinoma duttale in situ (n = 18).
Formazione mammosphere spontanea in vitro e in vivo
Mammospheres e le strutture 3-D sono sorte spontaneamente da più frammenti di tessuto, indipendenti umani condotto carcinoma duttale in situ di diversi pazienti con diagnosi di iper duttale atipicaplasia o carcinoma duttale in situ (Figura 3 e 4) 5,9. Interruzione enzimatica del tessuto mammario non è stato eseguito prima coltura di tessuti, che ha portato in una cultura di tipo misto-cellula. Né siero, matrici estratto membrana basale, nè gel-simili sono stati richiesti per la formazione mammosphere spontanea (Figura 4). Le mammospheres generate tumori mammari xenotrapianto in un modello NOD / SCID mouse con lo stesso modello di crescita come quello del cancro invasivo (Figura 5) 5. Questi risultati dimostrano che le cellule progenitrici con potenziale invasivo pre-esistere all'interno del seno umano carcinoma duttale in situ condotto, ma a quanto pare sono tenuti sotto controllo da nicchia duttale e possono essere persuasi ad emergere nella cultura organoide. Queste cellule costituiscono una nuova categoria di cellule staminali simil-seno che esistono prima della manifestazione palese del fenotipo invasivo 5,9,10.
Conferma della epiteliali derivate mammospheres e xenografts
Le mammospheres e xenotrapianti derivanti dalle mammospheres sono stati confermati da immunofluorescenza come aventi origini epiteliali. Molecola di adesione delle cellule epiteliali (EpCAM) è una glicoproteina di membrana espressa sulle cellule epiteliali 11. Immunofluorescenza con un anticorpo monoclonale di topo reattivo EpCAM umano (verde) e una colorazione nucleare (DAPI, blu) mostrava cellule positive EpCAM nelle mammospheres in coltura (Figura 6A) e il centro di un xenotrapianto NOD / SCID (Figura 6B).
Verifica dei confini membrana basale intatta
Il mammosphere formatura, cellule epiteliali neoplastiche in questo sistema di coltura sono stati ricavati da lesioni mammarie pre-invasive che erano privi di invasione franca o microinvasione, come verificato da analisi patologiche indipendente secondo lo standard della diagnosi istopatologica cura. Più strutture organoide dello stesso paziente generati mammosphere percolonie ming che hanno dimostrato di essere cancerogeno. Inoltre, l'esame istopatologico del tessuto utilizzato per la cultura organoide rivelato lesioni intraduttali confluenti con confini membrana basale intatta (Figura 7B) 5. Così si può concludere che mammospheres spontanei formati in questo sistema di coltura sono derivati esclusivamente da zone neoplastiche pre-invasive e non sono un prodotto di rare aree di microinvasione 5.
Figura 1. Flusso di lavoro per mantenere la sterilità dei tessuti durante l'imaging radiologico e la dissezione dei tessuti lordo. (A) In sala operatoria, il tessuto del seno (mastectomia parziale di esempio in figura) è collocato in un vassoio sterile e coperto con pellicola trasparente sterile. Il tessuto può essere ripreso direttamente nel vassoio di plastica. (B) Tessuto campione di incassi per identificare aree di DCIS. Solo monouso coloranti orientamento dei tessuti sono dipinti sulla superficie del tessuto con cotone sterile tamponi con punta. Elettrodomestici aceto bianco distillato viene versato direttamente sul tessuto e cancellò con una garza di cotone sterile. (C & D) il tessuto del seno viene trasportato al laboratorio coltura di tessuti in terreno ricco di sostanze nutritive integrato con antibiotici. Tessuto dissezione, per isolare le aree di carcinoma duttale in situ, viene eseguita utilizzando guanti sterili e / lame bisturi / forbici. Il tessuto DCIS viene tagliato in più organoidi per la cultura. (E & F) in vitro cultura della organoidi seno. Tessuto DCIS umana si inserisce direttamente nel tessuto fiasche di coltura con coperchio rimovibile, senza previa digestione enzimatica del tessuto. Una quantità minima di senza siero terreno di coltura supplementato con fattore di crescita epidermico e l'insulina favorisce la crescita cellulare, pur mantenendo l'interfaccia aria-liquido intorno al organoide.6fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Illustrazione di processazione dei tessuti lordo per il seno carcinoma duttale in situ dei tessuti. La tumorectomia o mastectomia tessuto viene tagliato in sezioni sottili tagliando il tessuto in verticale senza tagliare tutto il percorso attraverso il campione. Questo metodo di dissezione è spesso definito come "tecnica pagnotta di pane", in quanto il tessuto taglio assomiglia a un pezzo di pane. L'area (s) sospettato di contenere DCIS sono tagliati fuori e affettato in 2 - 3 fette mm per la patologia diagnostica e la cultura organoide.
Figura 3. Un tipo di cellula mista culturamantiene rappresentante in popolazioni di cellule in vivo. (A) fase di contrasto immagine di coltura cellulare mista prodotta da carcinoma duttale in situ della mammella lesioni più di 11 settimane (4X ingrandimento). (B & C) in vitro organoide coltivazione con successo propagati DCIS derivato cellule epiteliali con la crescita indipendente di ancoraggio, definita come crescita verso l'alto e mammospheres espansione , e lobulati, formazioni 3-D condotto-come, in mezzo privo di siero integrato con EGF, insulina, streptomicina e gentamicina (ingrandimento 10X). (D) Esempio mammosphere formata dopo 11 settimane in coltura (40X con lo zoom). Per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. spontaneaformazione di mammospheres nel siero cultura organoide libero. Un esempio di formazione mammosphere dopo 33 giorni di coltura (ingrandimento 10X, 20X riquadro). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. NOD / SCID modello murino di xenotrapianto. Xenotrapianti sono stati generati iniettando cellule epiteliali derivate da un paziente con diagnosi di carcinoma duttale in situ (destro del mouse pad mammaria grasso) o da un paziente con diagnosi di carcinoma duttale in situ invasiva (sinistro del mouse pad grasso mammario). Xenotrapianti derivate da carcinoma duttale in situ sia puro e invasivo carcinoma duttale in situ ha rivelato un modello di crescita simile e tasso. Clicca qui per vedere una versione più grande di tla sua figura.
Figura 6. mammospheres si confermano essere di origine epiteliale. Immunofluorescenza con anticorpi anti-EpCAM coniugato con FITC è stato utilizzato per confermare l'origine epiteliale di mammospheres e xenotrapianti di topo generati da dotti mammari che contengono DCIS. (A) EpCAM-FITC cellule positive (pseudo- di colore verde, 488 nm) sono stati osservati solo in mammospheres delle colture cellulari miste provenienti da organoidi seno (DAPI (pseudo-colore blu, 408 nm) colorazione nucleare). (B) In fissati in formalina paraffina sezioni di tessuto del mouse xenotrapianto, EpCAM positivo cellule sono state rilevate solo nel centro della sezione tumore xenotrapianto. (20X di ingrandimento) Clicca qui per vedere una versione più grande di questo FIGUri.
Figura 7. Il collagene IV immunoistochimica rivela membrane basali intatte condotti circostanti. Dotti mammari normali (A) sono circondate da membrane basali intatte arricchito in collagene IV (diaminobenzidina = colorazione marrone). A seguito di cultura organoide, tessuto del seno contiene anche membrane basali intatte che confermano che i mammospheres sono derivati da aree di carcinoma duttale in situ e non da cancro invasivo (collagene IV immunoistochimica, pannello A 4X ingrandimento, pannello B 10X). Clicca qui per vedere una versione più grande questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il sistema di coltura qui descritto costituisce un nuovo modello per la generazione che vivono le cellule del seno neoplastiche pre-invasive per gli studi di ricerca di base e traslazionale. In passato, la progressione del cancro al seno pre-maligne è tipicamente stata studiata utilizzando tre metodi differenti. Il primo metodo è istopatologica e analisi genetica di microdissezionate congelati o fissi campioni umani 12-14. Il secondo metodo utilizza modelli murini che contengono noduli alveolari iperplastici (lesioni HAN) che si pensa di essere simile a lesioni mammarie pre-invasive umani 15. Il terzo modello utilizza stabilito linee cellulari di carcinoma mammario, come sottolinee MCF7 (MCF10A) che hanno un carcinoma duttale in situ altamente differenziati, come la morfologia 3,4. Anche se questi tre modelli hanno fornito indizi molecolari alla progressione del cancro al seno, nessuno di questi metodi sono in grado di valutare il potenziale maligno o il fenotipo molecolare lesione (s) di un singolo paziente. HistopathAnalisi ologic non fornisce informazioni sul fenotipo funzionale delle cellule nelle lesioni pre-invasive. Il modello murino di progressione del cancro al seno può non riflettere accuratamente la istomorfologia e la diversità di iperplasia duttale atipica umano, il carcinoma lobulare in situ e carcinoma duttale in situ 16-18. Inoltre, il microambiente stromale e la deposizione di matrice extracellulare che circondano le lesioni precursori del mouse sono notevolmente diverse da quelle della controparte umana 16. Spontanee lesioni precursori murine possono presentare un livello molto basso di progressione di invasione e metastasi. Il terzo metodo, linee cellulari in coltura, in grado di fornire solo informazioni fenotipiche funzionale se trapiantate in host soppressi immuni 3,4. Inoltre le anomalie genetiche di una linea cellulare di lunga diversi passaggi possono non rappresentare la progressione del cancro al seno spontanea nell'uomo 2. Infine, è pacifico che la neoplasia di ogni pazienteha una combinazione unica di anomalie genetiche ed epigenetiche che guidano il tasso di crescita, dello stato differenziato, e la progressione di invasione e metastasi 13,14,17. Lesioni pre-invasive umani sono multifocale ed eterogenea composizione cellulare e istomorfologia. Inoltre, il potenziale maligno biologica è noto per lesione pre-invasiva di un singolo paziente.
Il nostro metodo di coltura tissutale primario di superare le carenze dei modelli precedenti di cancro al seno pre-invasivo umana e offre i seguenti vantaggi: 1) Il sistema di coltura organoide sostiene la crescita di popolazioni di cellule neoplastiche nel microambiente del tessuto nativo che crescono spontaneamente e generare mammospheres che produrranno tumori invasivi in modelli murini di xenotrapianto. Le cellule rappresentano il genotipo e il fenotipo di un singolo paziente e quindi forniscono informazioni per la terapia personalizzata, o la prognosi individuale. 2) Il organoide maint sistema di colturaAINS le sottopopolazioni cellulari nativi e fornisce un mezzo per coltivare le cellule non maligne epiteliali, cellule stromali e cellule immunitarie originariamente presenti nel tessuto mammario primario, e portato nella cultura all'interno del organoide. Il basso volume di supporto nel sistema di coltura supporta lo scambio di ossigeno favorire la formazione spontanea mammosphere e condotto differenziata e alveoli come strutture senza la necessità di un artificiale tre ponteggio dimensionale. 3) La coltura cellulare primaria è esente da modifiche e selezione generati dalla dissociazione enzimatica o modificazione genetica esogena. Inoltre, il mezzo nutriente è a basso costo e semplice da preparare. 4) Analisi molecolare e genetica possono essere condotte su specifiche popolazioni di cellule e / o organoidi della cultura in diversi punti nel tempo senza interrompere l'intera cultura. 5) Il sistema di coltura organoide permette interazioni crescita, morfologia differenziata e cellula-cellula delle popolazioni cellulari native che puòessere studiato prima e dopo l'introduzione di agenti terapeutici nel terreno di coltura.
Anche se la cultura del tessuto primario ha alcuni vantaggi, non è senza limiti. La cultura organoide sostiene la crescita di colture cellulari miste, senza che la crescita eccessiva di qualsiasi tipo una cella. Tuttavia, il rapporto specifica di tipi di cellule non può essere controllato e quindi non può ricapitolare i rapporti esatti cellulari presenti in vivo. Coltivazione organoide di successo richiede la raccolta e l'elaborazione dei tessuti sterili, entrambi i quali non sono procedure di routine in molti laboratori di patologia Community Hospital. Una buona comunicazione tra i ricercatori clinici, il personale chirurgico, e il personale della patologia sono essenziali per mantenere la sterilità del campione all'interno del continuum di cura del paziente.
Un ulteriore limite di coltura organoide è l'effetto del substrato fermezza sul fenotipo cellulare e l'espressione genica 16,19. La differenziazione delle cellule staminali in colturapuò essere indotta mediante aggiunta di terreno contenente siero o possono essere causa di tempo prolungato in coltura. Un fenotipo stelo-come è stato mantenuto dopo diversi mesi in questo non-enzimatica, sistema di coltura senza siero organoide 5. Tuttavia, ad un certo punto nel tempo, le cellule possono differenziarsi visibile morfologicamente - le cellule diventano più piccole, dense, e non riescono a formare mammospheres. Per evitare potenziali problemi con i cambiamenti nel fenotipo delle cellule nel corso del tempo, gli esperimenti molecolari, come ad esempio transfezioni o abbattere test, deve essere eseguito con i giovani le culture, piuttosto che con le culture vecchie (più di 6 mesi).
Le chiavi per cultura organoide successo utilizzano un volume adeguato di fluido nel pallone di coltura, e permettendo il tempo organoidi di aderire al pallone di coltura tissutale. Eccesso di terreno nella diffusione limiti pallone dell'ossigeno, inibendo la formazione mammosphere. I primi 3-7 giorni di coltura di tessuti sono fondamentali per i organoidi di allegare al TIScitare in giudizio pallone di coltura. In generale, se un organoide non ha allegato il giorno 14, è probabile che non contiene segmenti duttali vitali DCIS e non diventerà aderente. Organoidi che non sono aderenti per giorno 14 dovrebbero essere rimossi dalla cultura. La mancanza di dotti mammari DCIS valida può essere verificato seguendo la cultura fissando il organoide in formalina al 10% e la lavorazione del tessuto in blocchi di paraffina per la colorazione dei tessuti e la valutazione microscopica.
Il nostro non-enzimatica, i risultati del sistema cultura libera-siero supportano l'ipotesi che esistano geneticamente anormali cellule precursori neoplastiche con potenziale invasivo nel pre-invasive lesioni mammarie umane 5,9,20. Questo risultato è in linea con il precedente lavoro di Sgroi et al., Che ha condotto l'analisi genetica del seno umano lesioni pre-invasive e Damonte et al., Che ha studiato la neoplasia intraepiteliale mammaria escrescenza (MINO) modello murino di progressione del cancro al seno 12,14 , 21. Toge Presother con le conclusioni degli altri, il nostro modello di cultura del singolo paziente lesioni pre-invasive supporta il concetto che il fenotipo aggressivo di carcinoma mammario invasivo di un paziente può essere in gran parte pre-determinato in fase di pre-invasiva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da (1), il Dipartimento della Difesa Breast Cancer Research Program (US Army Medical Research Acquisition Attività) premio # W81XVVH-10-1-0781 a LAL e VE, e (2) la concessione Susan G. Komen Foundation IR122224446 a Lal e VE. Supporto Patologia e di espansione del tessuto è stato gentilmente fornito da Inova Fairfax Dipartimento di Patologia, il dottor Hassan Nayer, il dottor Gita A. Menezes, e il dottor Charles Bechert. Il consenso del paziente e gli appalti del campione è stata sapientemente guidati da Inova Fairfax Hospital coordinatori di ricerca clinica Agrifoglio Gallimore, Heather Huryk, e Emil Kamar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10 cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2 µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10 mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100 µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10 mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10 mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22 µm PES membrane |
| 25 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115 cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 °C, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8 M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
References
- Shaughnessy, J. A., et al. Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development. Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Espina, V., et al. Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival. PLoS One. 5 (4), (2010).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Farnie, G., et al. Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways. J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).
- Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium. Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).
- Espina, V., Liotta, L. A. What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ. Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).
- Gong, C., et al. Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells. Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).
- Simon, B., et al. Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein. PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).
- Ma, X. J., et al. Gene expression profiles of human breast cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).
- Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet. Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).
- Sgroi, D. C. Preinvasive breast cancer. Annu Rev Pathol. 5, 193-221 (2010).
- Asch, H. L., Asch, B. B. Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas. Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).
- LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Of microenvironments and mammary stem cells. Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The emerging picture of the mouse mammary stem cell. Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).
- Kim, D. H., et al. Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing. Sci Rep. 2, 555 (2012).
- Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy. Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).
- D'amonte, P. Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell. Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).
