Summary
全血细胞毒性测定（WCA）是通过将高通量细胞定位技术与荧光显微镜和自动化图像处理开发了细胞毒性测定。在这里，我们描述了如何用抗CD20抗体治疗的淋巴瘤细胞可以分析实时人全血中，以提供定量细胞的细胞毒性分析。
Abstract
的实时的基于细胞的全血中的细胞毒性测定法（WCA），允许访问整个细胞的细胞毒作用的时间信息被开发的高通量细胞定位技术。靶向肿瘤细胞群体的第一预编程，以固定到一个数组的格式，并标记有绿色荧光胞浆染料。以下的单元阵列形成，抗体药物的加入与人全血组合。碘化丙啶（PI），然后加入以评估细胞死亡。单元阵列是用自动成像系统进行分析。而细胞质染料标记的靶向肿瘤细胞群，PI标签死肿瘤细胞群。因此，靶癌细胞的细胞杀伤百分比可通过计算存活的靶细胞，以死靶向细胞的数目的数量进行定量。用这种方法，研究人员能够访问时间依赖性和剂量依赖性细胞的细胞毒性的信息。值得注意的是，没有任何有害的无线电化学品的使用。这里介绍的WCA已经过测试与淋巴瘤，白血病和实体瘤细胞系。因此，WCA可以让研究人员评估在一个高度相关的离体条件下的药物的疗效。
Introduction
在制药工业中的最新进展已经导致了在实现肿瘤细胞抗体和个性化的癌症治疗方法的具体标识的兴趣增加;然而，几个障碍物的过程中遇到。只有5％是在临床前开发的抗癌活性剂都出现在阶段II-III测试1,2足够的疗效后，获得许可。临床前的策略（ 在体外和体内 ）是次优的作为许多例子已经表明，抗肿瘤药物有不同的行为在人类和实验动物的主要是由于其不同的血液成分3-5。
为解决抗肿瘤药物筛选平台的必要性，并提供昂贵的动物实验和临床试验前一个检查点，一个人全血细胞毒性测定法（WCA），提出了用于评价抗肿瘤药物疗效以更加相关的生物环境。该全血中的细胞毒性测定法可用于评估个体的细胞与抗体和其他药物候选物在人全血的响应。
的WCA是通过将高通量细胞定位技术与高通量和高含量成像6开发的。通过利用一种自动成像系统中，两个活细胞和死细胞的数目可以用较高的精确度来确定。由于这一事实，即靶细胞被固定在同一焦平面上，WCA是能够提供实时定量细胞毒性分析，而无需去除红细胞。此外，该自动成像系统提供了若干优点，如已达到指定的搜索条件的唯一的靶细胞（ 例如 ，荧光标记的细胞和细胞形态）被选通，并进行处理。此外，它允许生产每天144的板。因此，这种成像能力和吞吐量允许高-C的运行ontent和同时高通量实验。通过组合的WCA和自动成像系统，高通量定量细胞的细胞毒性分析可以在一个以上生物相关的环境来实现。
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Protocol
1.目标细胞的制备
- 在37℃下保持的靶细胞（ 例如 ，对Raji淋巴瘤细胞）的生长培养基（RPMI 1640培养基，含10％热灭活的胎牛血清（FBS），4nm的L-谷氨酰胺，和500单位/ ml青霉素/链霉素）的在一个5％CO 2的培养箱中培养。
- 离心样品以沉淀靶细胞在15ml试管中。离心时间随不同的细胞类型;离心3分钟，在468×g离心Raji细胞。
- 第一次吸上形成的上清液表面有气泡，并删除整个上清。
- 加入10毫升的PBS到管。通过吸取的溶液上下数次重新悬浮细胞，以打散细胞丛。
- 离心机的样品为3分钟，在468×g下。
- 吸出形成的上层清液的表面上的任何气泡，并删除整个上清液。
2.制备细胞微阵列
- Øbtain细胞附着96孔板中包或单一单元阵列8孔腔室玻片（见表材料/试剂）。
- 适用于1.2微升活化剂从工具包中的DNA试剂。盖小瓶，反其道而行，并轻轻摇动使溶液混合。
- 使该溶液20分钟，在室温下进行反应。
- 适用于该混合溶液中的靶细胞沉淀（在15ml试管中）。
- 添加绿色荧光胞浆染料以500nM的最终浓度。
- 孵育靶细胞与在定轨振荡器的混合溶液和染料为在室温30分钟。
- 用5毫升的PBS洗涤细胞两次，并将细胞重新悬浮在10ml的生长培养基。
- 从步骤2.7向每孔中应用100μl的溶液。用血细胞计数器计数细胞数。确保细胞数，每孔介于5×10 4〜1×10 6个细胞。
- 后在室温下孵育10-15分钟，轻轻两次200-30洗样品0微升生长培养基以除去任何未结合的细胞。
注：关于5-10微升生长培养基洗涤后残留在各孔中。
3.全血细胞毒性分析
- 加入180微升的人全血，以每个样品井。
- 获得抗CD20抗体溶液，在5毫克/毫升，并执行连续稀释，使50，20，10，5,2，1，在1.5ml管中抗CD20抗体溶液0.5微克/毫升。加入20μl抗CD20抗体的各个浓度的每个样品井制备一式三份。
- 加入碘化丙啶以500nM的最终浓度，以每孔中。
- 培养所得到的板在37℃，5％CO 2的16小时。
- 图像上的幻灯片或96孔板，支持8倍的放大倍率自动成像系统的细胞。
- 使用自动成像系统的细胞计数程序进行量化的结果。
注：自动成像系统的软件提供简单一步一步进行细胞计数操作。使用该软件的协议可以在供应商的网站上找到。 - 从该软件的主界面[查看结果。
- 选择[保存的样本文件。
- 第一门FITC平均强度> 50，则门TxRed平均强度> 20。
- 选择[板块综述]。
- 选择[导出表。
注：该方案的百分比的细胞杀伤式如下所示：
％靶细胞杀伤=（＃细胞染色的绿色和红色的/＃细胞染成绿色）* 100％
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Representative Results
抗CD20抗体和淋巴瘤细胞（Raji细胞和MC / CAR）被选择作为模型系统来证明全血细胞毒性测定法（WCA）7,8。 Raji细胞有CD20的高拷贝数的在细胞表面上，而MC / CAR的细胞有CD20的低拷贝数的对它们的膜。靶向细胞首先染成绿色与绿色荧光细胞内的染料，并排列在96孔板中。万 - 50000靶淋巴瘤细胞被固定在每个孔中。 180微升新鲜抽取的人全血加入到每孔中。抗CD20抗体，然后加入到96孔板中以梯度浓度的各孔中。孵化后，在37℃下16小时后，细胞数目通过分析绿色荧光的细胞和红色荧光的细胞数定量评估通过自动成像。由于目标淋巴瘤细胞都排列在同一焦平面上，各单元的荧光直接检测，即使没有雷莫咏的血细胞中的井。
如图1，进行了针对性的Raji淋巴瘤细胞（包括活的和死的）的检测。在图1中绿色的点表示呈现靶细胞的数目。死细胞（红点）在图1中分别通过红色荧光的强度进行定量分析，因为它们进行染色的荧光红色带有PI。抗体的细胞毒性通过死细胞所呈现（绿点）的细胞的比例（染绿色和红色）进行分析。荧光红色点的数目减少为抗CD20抗体的浓度在浓度降低。
每种抗体的浓度一式三份独立地进行测试。对于每种抗体浓度，每孔400多靶细胞进行成像提供的均值和细胞毒性结果的标准偏差。根据我们的数据，有400个数据点的PEř抗体浓度，我们获得了与P值<0.01的统计结果。在图2中，得到的剂量依赖性药物效率，MC / CAR的细胞与CD20抗原的低拷贝数被用作对照细胞系。为对抗的Raji淋巴瘤细胞，这与在常规抗体的细胞毒性测定法，包括补体依赖性细胞毒性测定法（CDC）或抗体依赖性细胞毒作用而得到的值的范围内的WCA结果（制得的0.12微克/ ml的EC 50值ADCC）的测定法。9-11
测定全血中的图1。基于抗体的细胞毒作用。Raji细胞标记有绿色的胞质染色，然后固定。 PI也被加入到访问性细胞死亡。死亡细胞被染成红色了PI。不同concentrat抗CD20抗体的离子加入，增加了全血。 （一）2.5微克/ ml的抗CD20抗体16小时后，（二）1μg/ ml的抗CD20抗体16小时后，（c）后为0.5μg/ ml的抗CD20抗体16小时，（四）0.25微克/ ml的抗CD20抗体16小时后，（例如）为0.1μg/ ml的抗CD20抗体16小时后，（六）0.05微克/ ml的抗CD20抗体16小时后，（克）2.5微克/ ml的对照抗体16小时后。
图针对人全血中不同的细胞系2的剂量依赖的细胞毒作用。Raji细胞是CD20阳性淋巴瘤细胞，和MC / CAR是CD20阴性细胞系。全血细胞毒性的水平显示出对于不同浓度α-CD20抗体（抗CD20抗体）的。
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Discussion
WCA的体外抗肿瘤筛查工具与单细胞分辨率12-16，传统的放映目标，如CDC和ADCC分析9-11，和之前的临床前动物试验后，最好利用的关键。目前，主要的靶标筛选测定，如CDC或ADCC检测在一个简化的介质或缓冲体系都执行。然而，候选药物，显示功效在这些简化的缓冲系统并不总是有效的，在更复杂的全血系统。因此，WCA可以桥接传统的目标掩护和昂贵的动物研究之间的间隙，减少假阳性，因此，防止了预防的故障在动物试验中或在人类临床试验。在WCA的将有利于工作的临床前研究，以检验在人类全血中的含量的药效，研究人员。用流式细胞仪计数死和活细胞需要的红细胞CE的完整的裂解为了LLS检测靶细胞。 WCA技术过流式细胞仪的优点在于，它能够识别靶细胞无红血细胞溶胞。它是难以完全溶解所有的红血细胞的血液样品中，和靶细胞也部分地在裂解过程中裂解。
更令人兴奋的机会出现，如果能够使用来自个体患者得到的活的原代细胞中产生的筛选板，铺路到个性化癌症治疗，细胞异质性的一个给定的肿瘤中的评价，并且细胞能够抵抗给定的识别药物治疗。移动医疗系统的方法，就是“个性化，预测，预防和围绕病人的需求”是药17,18的未来。健康和人类服务部美国内许多举措，其中包括美国食品药品管理局，疾病控制中心进行，美国国立卫生研究院的中心医疗保险和医疗补助服务，以及卫生资源和服务管理存在的支持措施，以推动个性化服务。个性化医疗的实现依赖于可靠的技术和产品，能够捕捉并保存任何人体细胞，同时保持他们在一个相关的生物状态。我们可以预见施加的WCA筛选药物对癌症患者的肿瘤细胞中的他/她自己的血液基质用于个性化用药的应用程序。
在该协议中的关键步骤是在单元阵列的制剂。用户需要删除所有上清液，而不在细胞洗涤步骤不失细胞。此外，用户需要做的一个短暂离心，如果液体不能在小瓶中可以看出。一旦DNA的试剂溶液被制备，它必须使用在30分钟内的细胞。
在单元阵列的形成效率是细胞类型依赖性的。已经有超过100类型的细胞与本协议测试的;然而，它仍然是可能的，某些特定类型的细胞将不会有效地形成单元阵列。如果没有单元阵列形式的DNA试剂浓度较高，建议来执行相同的协议，以获得更好的单元阵列形成。
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Disclosures
作者有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢美国国家癌症研究所IMAT计划从美国国立卫生研究院对这项工作[R33 CA174616-01A1]资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cells |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolic dye | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Human whole blood | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatic imaging system | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Cell counting program | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
References
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