עצב סנסורי שרירים מעורב באיתות proprioceptor וגם לדווח על אירועים ממלכתיים ופציעה קשורה חילוף חומרים. אנו מתארים עכבר בוגר בהכנת שריר עצבים מבחנה ללימודים בafferents שרירים מופעל מתיחה.
עצב סנסורי שריר innervating צירים שרירים ואיברי גיד Golgi לקודד אורך וכוח שינויים חיוניים לפרופריוספציה. סיבים הביא נוספים לפקח על מאפיינים אחרים של סביבת השריר, כוללים הצטברות המטבוליט, טמפרטורה, וגירויים nociceptive. בסך הכל, הפעלה לא תקינה של תאי עצב תחושתיים יכולה להוביל להפרעות תנועה או תסמונות כאב כרוניות. אנו מתארים את הבידוד של longus digitorum פושטי השריר (EDL) ועצב למחקר במבחנה של תגובות מביא עורר קטע בעכבר המבוגר. פעילות חושית נרשמה מהעצבים עם האלקטרודה יניקה וניתן לנתח afferents בודדת באמצעות תוכנת מיון ספייק. במבחנה הכנות לאפשר למחקרים מבוקרים היטב על afferents החושית ללא בלבול הפוטנציאלי של הרדמה או זלוף השריר שינה. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזהות ולבחון את התגובה של afferents כישור השריר למתוח. חשוב לציין,הכנה זו תומכת גם במחקר של סוגים אחרים של afferents שריר, מאפייני התגובה הבאים יישום סמים ושילוב של גישות חזקות גנטיות ומודלי מחלה בעכברים.
שרירי שלד מעוצבבים על ידי נוירונים חושיים המספקים את מערכת העצבים המרכזית עם מידע חשוב על סביבת השריר. צירים שריר מאוד מתמחים מבנים במארז מורכבים מסיבי שריר intrafusal הממוקמים במקביל לסיבי שריר extrafusal. צירים מעוצבבים על ידי הקבוצה Ia והשני afferents שלקודד שינויים באורך שריר וטונוס סיבי intrafusal מוסדרים באופן דינמי על ידי הנוירונים מוטוריים גמא innervating 1. afferents Ib הקבוצה ממוקמות בין סיבי שריר והוספות גידם ורגישים לשינויים בכוח שרירים, למשל בעת התכווצות שרירים 2. Ia הקבוצה, Ib והשני afferents לספק משוב הפרופריוצפטיבית שמסייע בשליטה מוטורית מתאימה. אוכלוסיות נוספות של afferents שרירים הממוקמים ברחבי השריר (קבוצה שלישית ורביעי) משמש כדי לאותת הצטברות המטבוליט, הנוכחות של גירויי nociceptive, וטמפרטורת שריר <sup> 3. מידע חושי שריר זה הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס, מניעת נזק לשרירים וויסות תנועה. afferents השריר יכולה לשנות את דפוסי הירי שלהם המבוססת על הניסיון קודם 4. הפעלה של nociceptors יכולה להוביל לגיוס של מדינות כאב כרוניות 5 ואיתות סוטה מproprioceptors השריר יכול להוביל לבעיות של שיווי משקל או תנועה 6. אנו משתמשים בשרירי עצבים מבודדים בהכנת מבחנה ללמוד את התגובה של הסופים קולט נוירון חושי שרירים מעכברים בוגרים משני המינים (המוצגים הם תגובות של 2-4 חודש C57Bl / 6 עכברים ישנים). העכבר הוא המין הגנטי המודל למחקרים ביונקים. הכנה זו דורשת הבידוד של הסניף העמוק peroneal של העצב משית ושרירי longus digitorum פושטי (אדי), שרירים עווית מהירים של קבוצת peroneal נמצאת בחלק הלטרלי של הרגל התחתונה. EDL משמש לעתים קרובות כדי לחקור את תכונות התכווצות השרירים 7-9, יש tendons כי הם קלים לבודד והוא קטן מספיק כדי לאפשר אספקת חמצן diffusive נאותה במנוחה ועם מחזורי חובת התכווצות סבירים 10. שרירים אחרים באזור זה (לדוגמא soleus וקדמי tibialis) הם בגודל דומה והכנה זה יכול לשנות בקלות כדי להקליט מafferents משרירים אלו. האלקטרודה יניקה ממוקמת על קצה החתך של העצב להקליט ירי מביא חושי שריר. ניתן לזהות נוירונים בודדים ונותחו על פי צורת ספייק שלהם באמצעות תוכנת מיון ספייק. גירוי אלקטרודות באמבטיה או על העצב יכול לשמש כדי לעורר התכווצות שרירים. אורך שריר וכוח יכולים להיות מבוקר ונמדדו באמצעות מערכות זמינות מסחרי. דומה במבחנה הכנות כבר בשימוש במכרסמים כדי ללמוד afferents שריר הקבוצה השלישית והרביעית בחולדה 11 EDL, afferents ציר הקבוצה Ia והשנייה בשריר בוהן העכברוש הרביעי lumbrical 12 ושרירים הקבוצה שלישי והרביעיים afferents בtהוא שריר plantar העכבר 13.
מערכת במבחנה יש את היתרונות של נגישות תרופתית ושליטה ישירה של משתני perfusate וphysiochemical כמו טמפרטורה וחומציות. גישה במבחנה מבטלת את הפוטנציאל in vivo מבלבל מעמד זלוף הרדמה ושרירים. בעוד הכנת שריר העצבים מאפשרת לחקר התגובה הישירה של ההפרעות בafferents, היכולת ללמוד אפנון efferent גמא של רגישות ציר ותגובות משולבות אחרות שאפשרי עם in vivo 14 או ex vivo 3 הכנות הוא הקריבה כ אין גופי תא עצביים בהכנה זו.
הכנה זו שימשה בעבר כדי לאפיין את התגובה של afferents כישור שריר עכבר לסוללה של רמפה ולהחזיק מתיחות ורעידות ונקבע כי respons מביא ציר העכברes היו דומה לאלו שדווחו במינים אחרים כגון חולדות, חתולים, ובני אדם. תגובות מביא ציר עכבר נמצאו דומה בשתי מעלות צלזיוס 24 ו34 ° טמפרטורות האמבטיה C, אם כי ב34 ° שיעורי ירי מוחלט C היו מהירים יותר וafferents היו יותר מסוגל להגיב לאורך מהר משנה 15. אנו מתארים בהמשך כיצד הכנה זו יכולה לשמש כדי לזהות וללמוד את afferents כישור שריר. יתר על כן, הכנה זו יכולה בקלות להיות שונה כדי ללמוד את התגובה של תת מביא שריר אחר 13, כדי להשוות את המאפיינים של afferents החושית בתגובה למדינת תרופה או מחלה או משתנה שונים אחרים (למשל, גיל, מין, נוקאאוט גן).
מטרתו של מאמר זה הייתה לתאר שיטת רישום מafferents כישור שריר בהכנת שריר עצבים עכבר בודדת. מצאנו כי afferents ציר העכבר מגיבה באופן דומה למתוח כמו אלה מחולדות, חתולים ובני אדם 15, ומעבדות אחרות השתמשו עכברים כיצורי מודל ללמוד נוירונים חושיים בשני השרירים והעור במבחנה (לדוגמא 3,13) .
afferents החושית השריר ניתן להקליט לפחות 6-8 שעות בשני 24 מעלות צלזיוס ו34 C °. כדי למזער את הטיפול באדים ועצב, להשתמש בחלק הנותר של FHL לטפל רקמה בכל ההזדמנות אפשרית. בעקבות הנתיחה, לחכות לפחות שעה 1 כדי להתחיל אוסף נתונים כדי לאפשר לרקמות לאזן לטמפרטורת אמבטיה ולשידור סינפטי נורמלי להתאושש. בעבר, בריאות שרירים אומתה על קבוצת משנה של שרירים המשמשים בהכנה זו על ידי קביעה כי קונטרה tetanic המקסימליכוח ctile שנוצר על ידי השרירים דומה לזה שדווח על ידי אחרים בתחילת והסיום של הניסוי 15.
afferents כישור השריר זוהו פונקציונלי בהכנה זה על ידי מחפש אתנחתא אופיינית בירי בתגובה לעווית התכווצות (איור 2), כמו גם את העליות בתדירות מיידית הצפויות בתגובה לשינויים באורך (איור 3). מניסיוננו, רוב afferents שהופעלה בתנאי שליטה היא afferents כישור שריר. אורכו של העצב נשמר בהכנה זו (~ 7 מקסימום מ"מ) הוא לא מספיק זמן כדי להשתמש בהבדלי מהירות הולכה מביא לזהות תת מביא שריר 13. בנוסף, שלא כמו בחתולים ובני אדם, באמצעים של רגישות דינמית לא היו מסוגלים להבחין בבירור הקבוצה Ia והשני afferents בעכברים (לדיון נוסף ראה וילקינסון et al. 15). סוגים אחרים של afferents (כלומר., הקבוצה שלישית ורביעי) יכול להיות מזוהה בבדיקות פונקציונליות נוספות בהכנה זו, למשל על ידי הוספת חומרים כמו קפסאיצין, ATP, או ברדיקינין, ירידת pH אמבטיה, חושף את השרירים לאיסכמיה, וכו '3,13,21-23 באמצעות אלקטרודות יניקה מאפשר הפעילות מתא עצב חושי מרובה שתירשם בו זמנית, דבר המגדיל את כמות הנתונים שניתן לאסוף משריר אחד. הכנה זו יכולה לשמש כדי לאמוד את ההשפעה הכוללת של ההפרעות על תגובות אוכלוסיית נוירון חושיות או התגובות של afferents המזוהות. אם צורות ספייק הן ייחודיות מספיק, עד 4 תאי עצב תחושתיים יכולה להיות מופלה על ידי תוכנה (שני Spike2 (Cambridge אלקטרוני עיצוב) ו( מכשירים לספירה Pro LabChart) ביצע באופן דומה). במקרים בהם לא יכולים להיות מופלים נוירונים, שינויים במיקום האלקטרודה או קוטר קצה יכולים בקלות להיות מיושמים.
לסיכום, שריר העצבים עכבר בהכנה מבחנהני הוא גישה ניסויית פשוטה, שניתן להשתמש כדי לחקור את מאפייני התגובה של afferents החושית שרירים לדגמי הפרעות, פציעה והמחלה physicochemical שונים. בנוסף, הכנה זו היא אידיאלית לנצל את כלים רבי עוצמה הגנטיות הזמינים בעכברים, כולל בעלי חיים מהונדסים וכלים optogenetic.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.
Force and Length Controller & Tissue Bath | Aurora Scientific, Inc. | 300C-LR & 809B-IV | |
Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump & Easy Load II Pump Head | Cole Parmer | EW-07523-80 & EW-77200-60 | |
2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier & Headstage Amplifier | A-M Systems | Model 1800; 700000 & 700500 | |
Simulator | Grass OR Aurora Scientific, Inc. |
S88 OR 701 C |
|
Dissecting Microscope | Swift | 892070 | |
Fiber Optic Light Source | Fiberlite | Model 190 | |
Analog to Digital Board | AD Instruments | PL3508/P (PowerLab 8/35) | |
Data Acquisition & Analysis Software | AD Instruments | LabChart Pro 7 | |
Electrode Holder | A-M Systems | 672445 | |
Electrode Glass | Dagan | SA16 | |
Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | P-80/PC | |
Microforge | Narishige | MF-9 | |
Isoflourane | MWI Veterinary Supply | 18627 | |
Surgical Tools | |||
Large Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
Large Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
#5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
#55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | |
6-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF (Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 ± 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 ± 0.05) |
|||
Sodium Chloride | Sigma | S9888-1KG | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma | 230391-500G | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Sodium Gluconate | Sigma | S2054-500G | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282-500G | |
Glucose | Sigma | G5767-500G | |
Sucrose | Sigma | S5016-500G | |
HEPES | Sigma | H3375-250G | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P0662-500G | |
Potassium Chloride | Sigma | P3911-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014-500G |