Summary
肌肉感觉神经元参与本体感受器的信号，并在代谢状态和伤害相关的事件报告。我们描述了成年小鼠的体外肌肉神经准备在拉伸激活肌肉传入的研究。
Abstract
肌肉感觉神经支配肌梭和高尔基腱器官编码的长度和力量的变化必需的本体。额外传入纤维监视其他特征肌肉环境，包括代谢物的积累，温度，和感受伤害的刺激。总体而言，感觉神经元的异常激活可能导致运动障碍或慢性疼痛综合症。我们描述趾长伸肌（EDL）的肌肉和神经的，在成年小鼠拉伸诱发传入的反应在体外研究中的隔离。感官的活动记录从神经与抽吸电极和个人传入可以用秒杀排序软件进行分析。 体外准备允许在感觉传入了很好的控制研究没有麻醉的潜在的困惑或改变肌肉的灌注。在这里，我们描述了一个协议来识别和测试肌梭传入响应舒展。重要的是，这种准备还支持肌肉的传入，响应特性下列药物的应用和强大的遗传方式和疾病模型小鼠中掺入其他亚型的研究。
Introduction
骨骼肌是由感觉神经元提供对中枢神经系统具有对肌肉环境的重要信息支配。肌梭是高度专业化的梭内肌纤维分布在梭外肌纤维平行的由封装结构。主轴是由集团IA和II传入编码改变肌肉的长度和梭内纤维音通过动态伽玛支配运动神经元1规定支配。 Ib族传入位于肌纤维和它们的肌腱插入之间，并且在肌肉2收缩的变化，肌肉力量，例如敏感。第Ia，Ib和II传入提供有助于适当的电机控制本体的反馈。位于整个肌肉肌肉传入的附加种群（组III和IV），用于发信号的代谢物的积累，伤害性刺激的存在下，和肌肉温度
一种体外系统具有药理访问和直接控制如温度和pH值灌洗液和物理变量的优点。 体外方法消除体内的潜在混淆的麻醉和肌肉的灌注状态。而肌肉的神经制剂允许的扰动对传入的直接反应的研究中，研究主轴敏感度等综合应对伽玛传出调制的能力是可以在体内14或离体3准备的牺牲有这个准备没有神经元胞体。
这种准备是以前用来表征鼠标肌梭传入到斜坡的电池反应并保持伸展和震动，它被确定鼠标梭传入responsES类似于所报告的其他物种例如大鼠，猫和人类。鼠标梭传入的反应被认为是在两个24°C和34℃的水浴温度相似，虽然在34℃的绝对发射率和更快的传入更能够更快地响应长度变化15。我们在下面说明如何编写可用于确定和研究的肌梭传入。此外，该制剂可以很容易地进行修改，以研究其他肌肉传入神经 亚型13的响应，以响应于药物或疾病状态或分类的其他变量（ 例如年龄，性别，基因敲除）比较感觉传入的属性。
Protocol
适当的国家和机构伦理应该进行动物实验前获得。
1，拆卸EDL肌肉和神经的
- 称量并深深麻醉成年小鼠吸入异氟烷用5％异氟醚蒸发器加上1.5升/分钟的氧气流量或钟形罩，底部异氟醚浸泡的棉花。
- 确保鼠标是深度麻醉，不给脚趾捏回应。快速斩首使用大，锋利的剪刀或断头台。
- 请通过用剪刀肋骨下腹正中切口和除去内脏。
- 通过抓住从颈部区域的皮肤和拉过去脚部皮肤的动物。
- 通过切割上述的臀部除去腿部和放置面皮腿与冷藏（4℃）的培养皿，carbogenated（95％O 2，5％CO 2）低钙，高镁的碳酸氢盐缓冲的盐水溶液周转箱宁以mM：128氯化钠，氯化钾1.9，1.2 KH 2 PO 4，26的NaHCO 3，0.85氯化钙 ，16 6.5 MgSO 4干燥，和10葡萄糖（7.4±0.05的pH）。低钙，高镁溶液在解剖抑制突触传递。
- 将腿背侧的菜和脚的腿和臀部向下用针或昆虫针，使得膝关节和踝关节是在一个90°的角。放置在脚的每一端与一个销上的每个前侧和后侧的大腿的销来固定到位的组织。
- 使用Castroviejo弹簧剪刀，抬起肌的大腿上的顶层，并切割以暴露坐骨神经直接下方的中线。坐骨神经位于正下方的顶端肌肉层和运行从其出口股骨附近的臀部上方，直到其分支成刚膝关节前腓总和胫神经。
- 删除上述坐骨神经肌肉，直到POINT在此深腓神经的分支潜入拇长屈肌（FHL）肌肉可见。
- 使用＃55钳子，解剖周围腓分支的结缔组织，从腓肠肌和比目鱼肌，这是对内侧胫骨释放它。切断腓肠肌和比目鱼肌的肌腱和小心地从神经下将其删除。
- 除去在胫骨的侧面浅表肌肉以暴露三个不同的腱束在踝关节，从内侧到外侧：FHL，EDL，和胫骨前肌（TA），与EDL隐藏在TA下方。
- 切助教肌腱在踝关节，从EDL解除助教起来了，并切断肌肉膝盖附近将其删除。
- 切FHL肌腱在脚踝，将其返回到到达那里的神经进入FHL的区域。切略低于该点并删除FHL肌肉〜2/3。
- 切断坐骨神经尽可能靠近髋关节为POSsible，轻轻去掉所有的神经分支除外腓深神经分支。
- 切筋EDL在两个用大弹簧剪刀踝关节和膝关节。
- 使用锋利的剪刀，从周围组织中取出的EDL，剩余FHL和神经通过在膝关节切削穿过胫骨和中途的大腿。切去其余的胫骨，这样就在EDL中，信望爱和神经的一部分保留下来。
2，安装EDL肌肉和神经进入组织浴（图1A）
- 在实验开始之前，准备的组织浴中。不断灌注同浴含氧（100％O 2）合成的组织间液（SIF）含（单位mm）123氯化钠，氯化钾3.5，0.7 硫酸镁 ，1.7 磷酸二氢钠，2.0 氯化钙 ，9.5 NAC 6 H 11 O（葡糖酸钠），5.5葡萄糖，7.5蔗糖和10 N -2 - hydroxyethylpiperazine- N'-2 -等hanesulfonic磺酸（HEPES）; pH值7.4±0.05 17。 15-30毫升/分钟的流速被推荐。显示的是25毫升容量与固定在浴缸的底部，有一个组织安装后和安装的力和长度控制器（约计浴缸尺寸2刺激电极市售洗澡8.5厘米×3厘米×1厘米;适合的产品。参照表的材料/设备）。
- 用剩余的FHL组织处理隔离肌肉神经，并将其放入组织浴。放置一小片SYLGARD对培养皿的底部，并用驱虫针通过剩余FHL组织稳定的肌肉。
- 用6-0丝线缝合扎两个筋并加盖一端到组织后，其他的力和长度控制器的控制杆臂（见表材料/设备规范）。使用最小的缝线长度是可行的。取出昆虫针和SYLGARD你绑筋后。注：为便于连接到所述杠杆臂的小片金属丝可以弯曲成“J”形钩和固定到该杆臂与环氧树脂。缝合线可以被连接到导线，而不是拧入于该杆臂的小孔。
- 请从SA的16玻璃吸电极先用玻璃微拉马（热火= 286，拉= 0，速度= 150，时间= 200）;突破尖端背部和手动磨它放在磨刀石，直到有大约3毫米的锥形。使用microforge尖端融化到10之间所需的尖端内径- 100微米取决于神经的一个希望从取样的区域（ 见图1B，1C的电极原理图和表格材料/设备产品信息）。
- 填写预制玻璃吸电极的内银线与SIF。
- 抽吸神经的切断端插入电极和连接到差分放大器的正端口。包裹在电极与氯化的银导线连接到探头的负极端口。从浴缸到探头的接地端口上运行的第二氯化的银线接地的SIF洗澡。另外地灌注管法拉第笼在多个点，以减轻通过灌注泵推出的电噪声。
- 刺激通过安装在该组织浴中的肌肉的任一侧以诱导肌收缩，电极的肌肉。可选地放置在神经的切断端部的刺激电极。增加刺激电压，直到峰值收缩力观察，然后增加电压通过一个额外的15％，达到超强的电压（0.5毫秒脉冲宽度）。继续抽搐收缩在超最大电压，用10秒的休息在中间，但改变肌肉的长度，直到峰值收缩力达到找到肌肉的最佳长度（L O）。所有的长坡道和震动将开始与肌肉在这个冷日。
- 允许肌肉的神经制剂保持在该浴中的至少1小时，随后的数据采集之前，以允许所述组织，以达到熔池温度和正常的突触传递，以恢复以下清扫低钙溶液。
- 为了收集数据，在比室温等的温度，将温度探头到附近的肌肉组织浴。慢慢地由穿过组织浴底板泵送加热的水使浴加热到所需温度。环绕SIF水库粘土微波炉加热垫，以帮助保持稳定的温度。
3，数据收集
- 要确定一个传入的梭传入，在一个0.5毫秒超强电压刺激产生重复发表抽搐收缩每秒一次记录的神经元活动。注：肌梭传入应抽搐收缩18,19（ 图2）期间暂停。
- 使用DATA采集软件适用长度的变化以不同的速度和不同的长度。使用自定义脚本来自动完成这个任务（见补充信息的脚本和方向如何自定义给出的延伸截图）。应用4秒的斜坡和保持伸展为2.5％，5％，7.5％L O伸缩长度为20，40，或60％L O / 15秒的拉伸速度。注：请参阅具体的力量和长度控制器所需的电压 - 毫米换算系数使用手册。
- 在实验结束时，确定肌肉健康在24℃下使用最大等长强直收缩（500毫秒列车，120赫兹串频率，0.5毫秒的脉冲宽度，超最大电压）。峰值收缩力比较先前报道的值（〜24牛顿/厘米2 9,20）。
Representative Results
肌肉传入的反应可以下面的各种扰动被记录，这取决于其传入亚型正在研究上。肌梭传入肌肉收缩和坡道和保持弹力代表答复如下图所示。 图2来识别传入的梭传入，抽搐收缩给出每秒一次（0.5毫秒脉冲宽度），看看是否有在收缩18,19烧成一个暂停。显示的神经元活动和肌肉紧张时代表跟踪这些肌收缩。抽搐时不收缩的神经元活动时观察到，如预期的梭传入。如果所记录的传入是Ib族高尔基腱器官传入，增加了收缩时的燃烧速率将期望。
在控制条件下最传入一个普通的放电模式（〜12脉冲/秒，在24℃〜〜32脉冲/秒，在34℃下）是肌梭传入。梭传入的一个子集，只会火拉伸过程中（在我们的手中〜梭传入的11％）15。 图3A显示了两种肌梭传入具有代表性的原始跟踪响应斜坡和保持受力和长度控制器产生的弹力。 LabChart的峰值直方图功能是用来识别和分析两个单个神经元的瞬时发射频率分开（ 图3B-3C）。
图1：隔离肌肉制备A）趾长伸肌（EDL）和支配坐骨神经被安装在一个孤立的组织浴灌注含氧合成间质液（SIF）。细胞外放大器连接到sucti对电极记录神经活动。双力和长度控制器，用适当的软件控制和措施的肌肉力量和长度。组织浴电极提供刺激来产生抽动或强直收缩。通过内部浴盘频道抽热水控制组织浴温度。 二）拉玻璃吸电极的理想针尖形状，因为这是用microforge产生的吸力电极〜3毫米锥形尖端，C）的放大写照。 请点击这里查看本图的放大版本。
图2主轴传入响应抽搐收缩。神经activitY（上图）和30抽搐的肌肉收缩张力（底部的迹线）叠加在黑色的顶部重叠的痕迹。在收缩引起的张力增加，这是肌梭传入的特征响应传入活动暂停。收缩的过程中支架和箭头上面的顶部曲线表示的时候活动已暂停。
图3主轴传入响应斜坡期间斜坡和保持舒展）两个传入（上部曲线）原始神经活动和保持应用到EDL（在底部的迹线显示肌肉的长度）。 二）瞬时发射频率（研究所舒展。大一，对参展单位从A L O活动的每秒脉冲）（以蓝色显示）。 三）Instantane较小的单位项发射频率，在拉伸唯一火灾（图中橙色）。这两个单位的拉伸是肌梭传入1特征中表现出的秒杀频率调整。
Discussion
这篇文章的目的是描述了一种从肌梭传入在一个孤立的小鼠肌肉，神经的准备记录。我们已经发现，小鼠梭传入响应类似于伸展那些从大鼠，猫和人15，和其它的实验室已经使用小鼠作为模式生物研究中均肌肉和体外的皮肤感觉神经元（例如3,13） 。
肌肉感觉传入可以在两个24°C和34°C的记录至少6-8小时。以最小化处理的EDL和神经，使用FHL的剩余部分，以处理组织只要有可能。以下的夹层，等待至少1小时，以启动数据收集，以使组织平衡到浴温度和正常的突触传递，以进行恢复。先前，肌肉健康是在此制备中所用的肌肉的子集，通过确定最大强直禁忌验证由肌肉产生的ctile力是类似的报告由他人在实验15的开始和结束。
肌梭传入进行功能识别在该制备通过在烧制响应于抽搐收缩（ 图2）寻找一个特性停顿以及预期的瞬时频率增加响应长度的变化（ 图3）。根据我们的经验，大多数传入那团火在控制条件是肌梭传入。保留在该制剂（〜7毫米最大）的神经的长度不够长以使用传入传导速度的差异，以确定肌肉传入神经 亚型13。此外，不像猫和人类的动态灵敏度措施未能明确区分组IA和II传入小鼠（进一步讨论见威尔金森等人。15）。传入的其他亚型（ 即，，第III族和第IV）添加物质，如辣椒辣素，ATP，或缓激肽，降低染液的pH，暴露肌肉局部缺血等 3,13,21-23在此制备使用附加的功能测试可以被识别，例如使用抽吸电极可以从多个感觉神经元的活动被记录一次，这增加了数据，这些数据可以从一个单一的肌肉被收集量。该制剂可用于衡量对感觉神经元群体的反应或识别传入的响应扰动的整体效果。如果尖峰形状是独特的是，高达4的感觉神经元可以通过软件进行鉴别（两者的Spike2（剑桥电子设计）和LabChart临（AD仪表）也同样进行）。在神经细胞不能够被辨别的情况下，改变在电极放置或尖端直径可以很容易地实现。
总之，鼠标肌肉神经体外 preparATION是一个简单的实验方法可用于研究的肌肉感觉传入的响应特性，以各种物理化学的干扰，损伤和疾病模型。此外，该制剂特别适合于利用在小鼠中可用的功能强大的遗传工具，包括转基因动物和光遗传学工具的优点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Force and Length Controller & Tissue Bath | Aurora Scientific, Inc. | 300C-LR & 809B-IV | |
| Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump & Easy Load II Pump Head | Cole Parmer | EW-07523-80 & EW-77200-60 | |
| 2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier & Headstage Amplifier | A-M Systems | Model 1800; 700000 & 700500 | |
| Simulator | Grass OR Aurora Scientific, Inc. |
S88 OR 701 C |
|
| Dissecting Microscope | Swift | 892070 | |
| Fiber Optic Light Source | Fiberlite | Model 190 | |
| Analog to Digital Board | AD Instruments | PL3508/P (PowerLab 8/35) | |
| Data Acquisition & Analysis Software | AD Instruments | LabChart Pro 7 | |
| Electrode Holder | A-M Systems | 672445 | |
| Electrode Glass | Dagan | SA16 | |
| Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | P-80/PC | |
| Microforge | Narishige | MF-9 | |
| Isoflourane | MWI Veterinary Supply | 18627 | |
| Surgical Tools | |||
| Large Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
| Large Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | |
| 6-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF (Low Calcium solution is equilibriated with 95% O2/5% CO2 gas and pH of 7.4 ± 0.05; SIF is equilibriated with 100% O2 gas and pH of 7.4 ± 0.05) |
|||
| Sodium chloride | Sigma | S9888-1KG | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391-500G | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
| Sodium gluconate | Sigma | S2054-500G | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | |
| Glucose | Sigma | G5767-500G | |
| Sucrose | Sigma | S5016-500G | |
| HEPES | Sigma | H3375-250G | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662-500G | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911-500G | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
References
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