Summary
Muscolari neuroni sensoriali sono coinvolti nella segnalazione propriocettiva e anche la relazione su eventi di stato e di pregiudizio legate metaboliche. Descriviamo un topo adulto in vitro preparazione muscolare-nervosa per gli studi sulla afferenze muscolari tratto attivato.
Abstract
Muscle neuroni sensoriali che innervano fusi neuromuscolari e organi tendinei del Golgi codificano lunghezza e forza modifiche essenziali alla propriocezione. Ulteriori fibre afferenti monitorare altre caratteristiche dell'ambiente muscolare, tra cui metabolita accumulo, temperatura, e stimoli nocicettivi. Nel complesso, l'attivazione anormale dei neuroni sensoriali può portare a disturbi del movimento o sindromi da dolore cronico. Descriviamo l'isolamento della estensore lungo delle dita (EDL), muscoli e nervi per lo studio in vitro delle risposte afferenti tratto evocati nel topo adulto. L'attività sensoriale viene registrata dal nervo con un elettrodo di aspirazione e singole afferenze può essere analizzato utilizzando spike software di ordinamento. Preparati in vitro consentono di studi ben controllati sulle afferenze sensoriali, senza i potenziali confonde di anestesia o di perfusione muscolare alterato. Qui si descrive un protocollo per individuare e testare la risposta delle afferenze dei fusi muscolari per allungare. È importante sottolineare che,questa preparazione supporta anche lo studio di altri sottotipi di afferenze muscolari, proprietà di risposta in seguito all'applicazione di droga e l'integrazione di approcci genetici potenti e modelli di malattia nei topi.
Introduction
I muscoli scheletrici sono innervati dai neuroni sensoriali che forniscono il sistema nervoso centrale con importanti informazioni circa l'ambiente muscolo. Fusi muscolari sono altamente specializzati strutture incapsulate composte di fibre muscolari intrafusali che si trovano in parallelo con le fibre muscolari extrafusali. Mandrini sono innervati dal Gruppo Ia e II afferenze che codificano variazioni di lunghezza e il tono muscolare fibra intrafusali è regolata dinamicamente da innervano gamma motoneuroni 1. GRUPPO IB afferenze sono posizionati tra le fibre muscolari e le loro inserzioni tendinee e sono sensibili alle variazioni di forza muscolare, per esempio durante la contrazione muscolare 2. Il Gruppo Ia, Ib e II afferenze fornire un feedback propriocettivo che aiuta nel controllo motorio adeguato. Ulteriori popolazioni di afferenze muscolari situate in tutto il muscolo (gruppo III e IV) servono per segnalare metabolita accumulo, la presenza di stimoli nocicettivi, e la temperatura del muscolo
Un sistema in vitro ha i vantaggi di accessibilità farmacologico e controllo diretto delle variabili perfusato e fisiochimiche come temperatura e pH. Un approccio in vitro elimina il potenziale in vivo confonde di anestesia e lo stato di perfusione del muscolo. Mentre la preparazione muscolo-nervo consente lo studio della risposta diretta di una perturbazione sulle afferenze, la capacità di studiare gamma modulazione efferente di sensibilità mandrino ed altre risposte integrate che è possibile con 14 in vivo o ex vivo 3 preparazioni è sacrificato come non ci sono corpi cellulari neuronali in questa preparazione.
Questa preparazione è stato precedentemente utilizzato per caratterizzare la risposta di afferenze dei fusi muscolari mouse per una batteria di rampa e tenere tratti e vibrazioni ed è stato determinato che il mouse mandrino respons afferenties erano simili a quelli riportati in altre specie, come i ratti, gatti, e gli esseri umani. Risposte mandrino afferenti mouse sono risultati simili sia a 24 ° C e 34 ° C la temperatura del bagno, anche se a 34 ° C tassi di cottura assoluto sono stati più veloci e le afferenze erano più in grado di rispondere più velocemente cambia di lunghezza 15. Descriviamo di seguito come questo preparato può essere utilizzato per identificare e studiare le afferenze dei fusi muscolari. Inoltre, questa preparazione può essere facilmente modificato per studiare la risposta di altri sottotipi afferenti muscolare 13 di confrontare le proprietà di afferenze sensoriali in risposta ad uno stato di farmaco o malattia o assortiti altre variabili (ad esempio età, sesso, gene bloccato).
Protocol
Adeguati etici nazionali e istituzionali devono essere ottenuti prima di eseguire esperimenti su animali.
1 Rimozione di EDL muscoli e dei nervi
- Pesare e anestetizzare profondamente un topo adulto con isofluorane inalato usando un vaporizzatore con il 5% isofluorane più un 1,5 L / min flusso di ossigeno o di una campana di vetro con isofluorane imbevuto di cotone sul fondo.
- Assicurarsi che il mouse è profondamente anestetizzato e non risponde ad un pizzico punta. Decapitare rapidamente utilizzando grandi, forbici affilate o una ghigliottina.
- Fare un taglio linea mediana ventrale attraverso le costole con le forbici e rimuovere gli organi interni.
- Pelle animale afferrando la pelle dal collo e tirandolo oltre i piedi.
- Rimuovere le gambe tagliando sopra i fianchi e posizionare le gambe dalla pelle in un piatto con freddo (4 ° C), carbogenated (95% O 2, 5% di CO 2) basso livello di calcio, magnesio bicarbonato alta tamponata contai soluzione salinaning in mM: 128 NaCl, KCl 1.9, 1.2 KH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 0.85 CaCl 2, 6.5 MgSO 4, e 10, il glucosio (pH di 7,4 ± 0,05) 16. Il basso di calcio, soluzione ad alta magnesio inibisce la trasmissione sinaptica durante la dissezione.
- Posizionare le gambe lato dorsale nel piatto e pin le gambe e fianchi in giù con aghi o spilli insetti in modo che le articolazioni del ginocchio e della caviglia sono ad un angolo di 90 °. Inserire un perno su ciascuna estremità dei piedi e un pin su ciascuna delle cosce anteriore e posteriore per tenere il tessuto in posizione.
- Utilizzando le forbici a molla Castroviejo, sollevare lo strato superiore del muscolo sulle cosce e fare una linea mediana tagliare per esporre il nervo sciatico direttamente sotto. Il nervo sciatico si trova appena sotto lo strato muscolare superiore e corre sopra il femore dalla sua uscita in prossimità dei fianchi finché si dirama nel peroneo comune e nervo tibiale appena prima l'articolazione del ginocchio.
- Rimuovere il muscolo sopra il nervo sciatico fino al Point in cui le profonde peronei immersioni ramo del nervo nel muscolo flessore lungo dell'alluce (FHL) è visibile.
- Utilizzando # 55 pinze, sezionare il tessuto connettivo intorno al ramo peroneo per liberarlo dalle gastrocnemio e soleo muscoli, che sono sul lato mediale della tibia. Tagliare i tendini dei muscoli gastrocnemio e soleo e rimuovere con cautela li da sotto il nervo.
- Rimuovere il muscolo superficiale sulla parte laterale della tibia per esporre tre fasci distinti tendine alla caviglia-da mediale a laterale: FHL, EDL, e tibiale anteriore (TA), con l'EDL nascosto sotto il TA.
- Tagliare il tendine TA alla caviglia, sollevare il TA e lontano dalla EDL, e tagliare il muscolo vicino al ginocchio per rimuoverlo.
- Tagliare il tendine FHL alla caviglia e sollevarlo di nuovo per raggiungere la zona in cui il nervo entra nel FHL. Tagliare appena sotto quel punto e rimuovere ~ 2/3 del muscolo FHL.
- Tagliare il nervo sciatico più vicino possibile alla articolazione dell'anca come posbile e striscia delicatamente via tutti i rami nervosi, tranne per il ramo peroneo profondo.
- Tagliare i tendini EDL sia a caviglia e del ginocchio con grosse forbici a molla.
- Utilizzando forbici affilate, rimuovere la EDL, il restante FHL e nervo dal tessuto circostante tagliando attraverso l'osso della tibia al ginocchio ea metà strada attraverso la coscia. Tagliare l'osso della tibia rimanente in modo che solo la EDL, parte della FHL e nervo rimangono.
2 Montaggio del muscolo EDL e Nerve nella Bath Tissue (Figura 1A)
- Prima dell'inizio dell'esperimento, preparare il bagno tessuto. Costantemente profumato il bagno con ossigenata (100% O 2) liquido interstiziale sintetico (SIF) contenente (in mM) 123 NaCl, 3.5 KCl, 0,7 MgSO 4, 1.7 NaH 2 PO 4, 2.0 CaCl 2, 9.5 NaC 6 H 11 O ( gluconato di sodio), 5.5 glucosio, saccarosio 7,5, e 10 N -2-hydroxyethylpiperazine- N '-2-etL'acido hanesulfonic (HEPES); pH 7,4 ± 0,05 17. Si raccomanda una velocità di flusso di 15-30 ml / min. Viene mostrato un bagno disponibile in commercio di 25 ml con due elettrodi stimolanti fissati al fondo della vasca, un post tessuto montato e un supporto per un regolatore di forza e lunghezza (dimensioni approssimative bagno 8,5 centimetri x 3 cm x 1 cm per le specifiche vedi tabella dei materiali / attrezzature).
- Utilizzare il restante tessuto FHL per gestire l'isolato muscolo-nervo e metterlo nella vasca tessuti. Inserire un piccolo pezzo di sylgard sul fondo del piatto e utilizzare un perno insetto attraverso il rimanente tessuto FHL per stabilizzare il muscolo.
- Utilizzare 6-0 punti di sutura in seta per legare entrambi i tendini ed apporre una estremità al posto del tessuto e l'altra al braccio di leva della forza e regolatore di lunghezza (vedi Tabella dei materiali / attrezzature per le specifiche). Utilizzare la lunghezza più piccola sutura che è pratico. Rimuovere il perno di insetti e sylgard dopo aver legato i tendini. NOTA: Per facilitare facilecollegamento alla leva braccio un piccolo pezzo di filo può essere piegato in un "j" gancio sagomato e fissato al braccio leva con resina epossidica. La sutura può essere legato al filo anziché infilato nel piccolo foro sul braccio leva.
- Fai elettrodi di aspirazione da 16 SA vetro da prima con un estrattore micropipetta di vetro (calore = 286, Pull = 0, Velocity = 150, Tempo = 200); rompere la punta posteriore e macinare manualmente su una pietra per affilare fino a quando non vi è circa un cono 3 mm. Sciogliere la punta con un microforge al diametro interno punta desiderato tra 10 - 100 micron a seconda della zona del nervo si vuole campionare (vedi figure 1B-1C per elettrodo schematico e nella tabella dei materiali / Attrezzature per informazioni sul prodotto).
- Riempire un elettrodo di vetro di aspirazione premade al filo d'argento interno con SIF.
- Aspirare l'estremità tagliata del nervo nel elettrodo e collegarlo alla porta positivo di un amplificatore differenziale. Avvolgere l'elettrodo con un argento chloridedfilo che si collega alla porta negativo della headstage. A terra il bagno SIF eseguendo un secondo filo chlorided argento dal bagno alla porta terra del headstage. Anche a terra il tubo di perfusione alla gabbia di Faraday in più punti a ridurre il rumore elettrico introdotto tramite le pompe di perfusione.
- Stimolare il muscolo attraverso gli elettrodi montati su ciascun lato del muscolo nel bagno tessuto per indurre una contrazione contrazione. In alternativa posizionare un elettrodo stimolante sul tagliata del nervo. Aumentare la tensione stimolante finché si osserva una forza contrattile picco e quindi aumentare la tensione di un ulteriore 15% per raggiungere la tensione sovramassimale (0,5 di larghezza di impulso msec). Continuare le contrazioni contrazione alla tensione sopramassimale, con 10 sec di riposo nel mezzo, ma variare la lunghezza del muscolo finché una forza contrattile picco è raggiunto per trovare la lunghezza ottimale (L o) del muscolo. Tutte le rampe di lunghezza e le vibrazioni inizieranno con il muscolo in questo lengesimo.
- Lasciare la preparazione muscolo-nervo rimanga nel bagno per almeno 1 ora prima della successiva raccolta dati per consentire al tessuto di raggiungere la temperatura del bagno e per la normale trasmissione sinaptica a recuperare dopo dissezione in una soluzione a basso calcio.
- Per raccogliere i dati ad una temperatura diversa temperatura ambiente, posizionare una sonda di temperatura nella vasca di tessuto in prossimità del muscolo. Lentamente portare la vasca a temperatura pompando acqua riscaldata attraverso la piastra di carta igienica di base. Avvolgere argilla rilievi di riscaldamento per microonde intorno al serbatoio SIF per aiutare a mantenere una temperatura costante.
3 Raccolta dati
- Per identificare un afferente come afferente mandrino, registrare l'attività neuronale durante le contrazioni contrazione ripetute prodotte da una tensione di stimolo 0,5 sopramassimale msec consegnato una al secondo. NOTA: Muscle afferenze mandrino devono mettere in pausa durante il 18,19 contrazione contrazione (Figura 2).
- Uso dasoftware di acquisizione ta per applicare le variazioni di lunghezza a velocità diverse e diverse lunghezze. Utilizzare uno script personalizzato per automatizzare questo compito (vedi informazioni supplementari per uno screenshot dello script e le indicazioni su come personalizzare i tratti indicati). Applicare tratti rampa-and-hold di 4 sec a lunghezze tratto di 2,5%, 5%, e 7,5% o L e velocità tratto di 20, 40, o 60% o L / sec 15. NOTA: Vedere il manuale utente per forza specifica e regolatore di lunghezza per necessario fattore di conversione tensione-millimetro.
- Alla fine dell'esperimento, determinare la salute dei muscoli a 24 ° C con massime contrazioni tetaniche isometriche (500 msec treno, treno frequenza 120 Hz, 0,5 di larghezza di impulso msec, tensione sovramassimale). Confrontare la forza contrattile picco a valori precedentemente riportati (~ 24 N / cm 2 9,20).
Representative Results
La risposta di afferenze muscolari possono essere registrati a seguito di una serie di perturbazioni, a seconda di quale afferente sottotipo è studiata. Risposte rappresentativi di afferenze dei fusi muscolari a contrazione muscolare e la rampa e tenere tratto sono mostrati qui. Per identificare un afferente come afferente mandrino, twitch contrazioni sono date una volta al secondo (0,5 larghezza di impulso msec) per vedere se c'è una pausa nella cottura durante la contrazione 18,19. Figura 2 mostra una traccia di rappresentante di attività neuronale e la tensione muscolare durante queste contrazioni contrazione. Nessuna attività neuronale si osserva durante le contrazioni contrazione, come previsto per le afferenze mandrino. Se il afferente registrata era un gruppo Ib Golgi afferente organo tendine, un aumento del tasso di cottura durante la contrazione sarebbe previsto.
In condizioni di controllo la maggior parte delle afferenze con schema di accensione regolare (~ 12 impulsi / sec a 24 ° C e ~ 32 impulsi / sec a 34 ° C) Sono afferenze muscolari del mandrino. Un sottoinsieme di afferenze mandrino sarà solo il fuoco durante tratto (nelle nostre mani ~ 11% delle afferenze mandrino) 15. Figura 3A mostra una traccia crudo rappresentante di due afferenze dei fusi muscolari rispondere a una rampa e tenere tratto prodotta dal regolatore di forza e lunghezza. La funzione di Spike Istogramma di LabChart viene utilizzato per identificare e analizzare la frequenza di emissione istantanea delle due neuroni singoli separatamente (Figure 3B-3C).
Figura 1 isolata del muscolo Preparazione A) L'estensore lungo delle dita (EDL) e innervano nervo sciatico sono montati in un bagno isolata tessuto perfuso con ossigenato liquido interstiziale sintetico (SIF). Un amplificatore extracellulare collegato ad un suctisu elettrodo registra l'attività neurale. Un doppio forza e lunghezza controller con opportuni software-controlli e misure di forza muscolare e la lunghezza. Gli elettrodi da bagno tessuto offrono stimoli per la produzione di contrarsi o contrazioni tetaniche. Pompaggio acqua riscaldata attraverso i canali della piastra bagno interno controlla la temperatura del bagno del tessuto. B) Tirato elettrodo di aspirazione in vetro con ~ 3 millimetri punta conica. C) ingrandita rappresentazione della forma della punta ideale per l'elettrodo di aspirazione che viene prodotto utilizzando un microforge. Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 Mandrino afferenti Risposta a Twitch contrazione. Activit neuronaley (traccia in alto) e la tensione muscolare (traccia inferiore) da 30 contrazioni contrazione si sovrappongono con piano traccia sovrapposizione in nero. Attività afferenti pause durante la contrazione aumento della tensione indotta, che è una risposta caratteristica delle afferenze dei fusi muscolari. Staffa e freccia sopra la traccia in alto indicano il tempo durante la contrazione quando l'attività è in pausa.
Figura 3 Mandrino afferenti risposta a rampa e Tenere Stretch A) attività di Raw neurale di due afferenze (top trace) nel corso di una rampa e tenere premuto tratto applicato al EDL (lunghezza del muscolo mostrato nella traccia di fondo). B), frequenza di emissione istantanea (Inst. P., impulsi al secondo) dell'unità espositrici attività a L o da A (mostrato in blu). C) instantanéfrequenza di emissione ous dell'unità più piccola che solo gli incendi durante l'allungamento (mostrato in arancione). Entrambe le unità presentano l'adattamento frequenza di picco durante il tratto che è caratteristica di afferenze dei fusi muscolari 1.
Discussion
L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un metodo per la registrazione da afferenze dei fusi muscolari in un isolato preparazione del mouse muscolo-nervo. Abbiamo scoperto che le afferenze del mouse mandrino rispondono in modo simile a come allungare quelli di ratti, gatti e gli esseri umani 15, ed altri laboratori hanno utilizzato topi come organismi modello per studiare i neuroni sensoriali sia nel muscolo e la pelle in vitro (ad esempio 3,13) .
Muscle afferenze sensoriali possono essere registrate per almeno 6-8 ore sia a 24 ° C e 34 ° C. Per ridurre al minimo la manipolazione del EDL e nervo, utilizzare la parte rimanente del FHL per gestire il tessuto quando possibile. Dopo la dissezione, attendere almeno 1 ora di iniziare la raccolta dei dati per consentire al tessuto raggiunga la temperatura del bagno e per il normale trasmissione sinaptica per recuperare. In precedenza, la salute dei muscoli è stata verificata su un sottoinsieme di muscoli utilizzati in questa preparazione determinando che la massima tetanica contractile forza generata dai muscoli è simile a quella riportata da altri all'inizio e alla fine dell'esperimento 15.
Muscle afferenti mandrino stati identificati funzionalmente in questa preparazione, cercando per una pausa caratteristica cottura in risposta alla contrazione contrazione (figura 2), nonché gli attesi frequenza aumenta istantanei in risposta alle variazioni di lunghezza (Figura 3). Nella nostra esperienza, la maggior parte delle afferenze che un incendio in condizioni di controllo sono afferenze dei fusi muscolari. La lunghezza del nervo mantenuto in questa preparazione (~ 7 mm massimo) non è sufficientemente lungo da usare afferenti differenze di velocità di conduzione per identificare sottotipi afferenti muscolare 13. Inoltre, a differenza di gatti e gli esseri umani, le misure di sensibilità dinamica non erano in grado di distinguere chiaramente Gruppo Ia e II afferenze nei topi (per ulteriori approfondimenti vedi Wilkinson et al. 15). Altri sottotipi di afferenze (vale a dire., Gruppo III e IV) può essere identificato tramite ulteriori test funzionali in questa preparazione, per esempio con l'aggiunta di sostanze come la capsaicina, ATP, o bradichinina, diminuendo bagno pH, esponendo il muscolo di ischemia, ecc 3,13,21-23 Utilizzando elettrodi di aspirazione permette l'attività da più neuroni sensoriali da registrare in una sola volta, che aumenta la quantità di dati che possono essere raccolti da un singolo muscolo. Questa preparazione può essere utilizzata per misurare l'effetto complessivo di una perturbazione sulle risposte popolazione di neuroni sensoriali o le risposte dei afferenti identificati. Se le forme picco sono abbastanza unici, fino a 4 neuroni sensoriali possono essere discriminati dal software (sia Spike2 (Cambridge Electronic Design) e LabChart Pro (Strumenti AD) si sono esibiti in modo simile). Nei casi in cui i neuroni non possono essere discriminati, cambiamenti nel posizionamento degli elettrodi o punta di diametro possono essere facilmente implementati.
In sintesi, il topo muscolo-nervo prepar vitrozione è un semplice approccio sperimentale che può essere utilizzata per studiare le proprietà di risposta dei muscoli afferenze sensoriali per vari modelli di perturbazioni, lesioni e malattie fisico-chimiche. Inoltre, questa preparazione è ideale per sfruttare i potenti strumenti genetici disponibili nei topi, compresi gli animali transgenici e strumenti optogenetic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Force and Length Controller & Tissue Bath | Aurora Scientific, Inc. | 300C-LR & 809B-IV | |
| Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump & Easy Load II Pump Head | Cole Parmer | EW-07523-80 & EW-77200-60 | |
| 2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier & Headstage Amplifier | A-M Systems | Model 1800; 700000 & 700500 | |
| Simulator | Grass OR Aurora Scientific, Inc. |
S88 OR 701 C |
|
| Dissecting Microscope | Swift | 892070 | |
| Fiber Optic Light Source | Fiberlite | Model 190 | |
| Analog to Digital Board | AD Instruments | PL3508/P (PowerLab 8/35) | |
| Data Acquisition & Analysis Software | AD Instruments | LabChart Pro 7 | |
| Electrode Holder | A-M Systems | 672445 | |
| Electrode Glass | Dagan | SA16 | |
| Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | P-80/PC | |
| Microforge | Narishige | MF-9 | |
| Isoflourane | MWI Veterinary Supply | 18627 | |
| Surgical Tools | |||
| Large Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
| Large Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | |
| 6-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF (Low Calcium solution is equilibriated with 95% O2/5% CO2 gas and pH of 7.4 ± 0.05; SIF is equilibriated with 100% O2 gas and pH of 7.4 ± 0.05) |
|||
| Sodium chloride | Sigma | S9888-1KG | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391-500G | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
| Sodium gluconate | Sigma | S2054-500G | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | |
| Glucose | Sigma | G5767-500G | |
| Sucrose | Sigma | S5016-500G | |
| HEPES | Sigma | H3375-250G | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662-500G | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911-500G | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
References
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