स्नायु संवेदी न्यूरॉन्स proprioceptor संकेतन में शामिल है और यह भी चयापचय राज्य और चोट से संबंधित घटनाओं पर रिपोर्ट कर रहे हैं. हम खिंचाव सक्रिय पेशी afferents पर अध्ययन के लिए इन विट्रो मांसपेशी तंत्रिका तैयारी में एक वयस्क माउस का वर्णन.
स्नायु संवेदी न्यूरॉन्स पेशी spindles और Golgi कण्डरा अंगों proprioception के लिए आवश्यक लंबाई और बल परिवर्तन सांकेतिक शब्दों innervating. अतिरिक्त अभिवाही फाइबर metabolite buildup, तापमान, और nociceptive उत्तेजनाओं सहित पेशी पर्यावरण की अन्य विशेषताओं, निगरानी. कुल मिलाकर, संवेदी न्यूरॉन्स की असामान्य सक्रियण आंदोलन विकारों या पुराने दर्द सिंड्रोम हो सकता है. हम वयस्क माउस में खिंचाव पैदा अभिवाही प्रतिक्रियाओं की इन विट्रो अध्ययन के लिए extensor digitorum longus (EDL) मांसपेशी और तंत्रिका के अलगाव का वर्णन. संवेदी गतिविधि एक चूषण इलेक्ट्रोड के साथ तंत्रिका से दर्ज की गई है और व्यक्तिगत afferents स्पाइक छँटाई सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है. इन विट्रो तैयारी संज्ञाहरण के संभावित घालमेल कर दिया है या बदल पेशी छिड़काव के बिना संवेदी afferents पर अच्छी तरह से नियंत्रित अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं. यहाँ हम पहचान करने और फैलाने के लिए मांसपेशी धुरी afferents की प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. महत्वपूर्ण बात है,इस तैयारी भी दवा आवेदन और चूहों में शक्तिशाली आनुवंशिक दृष्टिकोण और रोग मॉडल का समावेश निम्नलिखित पेशी afferents, प्रतिक्रिया गुणों के अन्य subtypes के अध्ययन का समर्थन करता है.
कंकाल की मांसपेशियों मांसपेशी पर्यावरण के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी के साथ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र प्रदान कि संवेदी न्यूरॉन्स द्वारा innervated रहे हैं. स्नायु स्पिंडल अत्यधिक extrafusal मांसपेशी फाइबर के साथ समानांतर में स्थित हैं कि intrafusal मांसपेशी फाइबर से बना समझाया संरचनाओं विशेष कर रहे हैं. Spindles समूह आइए और मांसपेशियों की लंबाई और intrafusal फाइबर स्वर में परिवर्तन गतिशील innervating गामा मोटर न्यूरॉन्स 1 द्वारा नियंत्रित किया जाता है सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि द्वितीय afferents द्वारा innervated रहे हैं. समूह आईबी afferents मांसपेशी फाइबर और उनके पट्टा सम्मिलन के बीच तैनात है और मांसपेशियों में संकुचन 2 के दौरान उदाहरण के लिए पेशी बल में परिवर्तन, के प्रति संवेदनशील होते हैं. समूह आइए, आईबी और द्वितीय afferents उपयुक्त मोटर नियंत्रण में एड्स कि proprioceptive प्रतिक्रिया प्रदान करते हैं. पेशी भर में स्थित मांसपेशियों afferents की अतिरिक्त आबादी (समूह तृतीय और चतुर्थ) metabolite buildup, nociceptive उत्तेजनाओं की उपस्थिति, और मांसपेशियों तापमान संकेत की सेवा <sup> 3. इस पेशी संवेदी जानकारी, homeostasis बनाए रखने मांसपेशियों की क्षति को रोकने और आंदोलन नियमन के लिए महत्वपूर्ण है. स्नायु afferents पूर्व के अनुभव के 4 पर आधारित उनकी फायरिंग पैटर्न बदल सकते हैं. Nociceptors की सक्रियता संतुलन या आंदोलन 6 के साथ समस्याओं को जन्म दे सकता है पुराने दर्द राज्यों 5 और मांसपेशियों proprioceptors से न्यायपालिका सिगनल की प्रेरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. हम (हैं दिखाया 2-4 महीने पुराने C57BL / 6 चूहों से प्रतिक्रियाएं) दोनों लिंगों के वयस्क चूहों से पेशी संवेदी न्यूरॉन रिसेप्टर अंत की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो तैयारी में एक अलग मांसपेशी तंत्रिका का उपयोग करें. माउस स्तनधारियों में पढ़ाई के लिए मॉडल आनुवंशिक प्रजाति है. यह तैयारी sciatic तंत्रिका के गहरे peroneal शाखा और extensor digitorum longus (EDL) मांसपेशी, कम पैर के पार्श्व भाग में पाया peroneal समूह की एक तेजी से चिकोटी मांसपेशियों के अलगाव की आवश्यकता है. EDL अक्सर मांसपेशी सिकुड़ा गुण 7-9 अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, ते हैआसान कर रहे हैं कि ndons अलग और बाकी पर और उचित संकुचन कर्तव्य चक्र 10 के साथ पर्याप्त वाचाल ऑक्सीजन की आपूर्ति की अनुमति देने के लिए काफी छोटा है. (उदाहरण soleus और tibialis पूर्वकाल के लिए) इस क्षेत्र में अन्य मांसपेशियों समान आकार के हैं और इस तैयारी आसानी से इन मांसपेशियों से afferents से रिकॉर्ड करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. एक चूषण इलेक्ट्रोड पेशी संवेदी अभिवाही फायरिंग रिकॉर्ड करने के लिए तंत्रिका की कटौती अंत पर रखा गया है. व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की पहचान और स्पाइक छँटाई सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अपने कील आकार के आधार पर विश्लेषण किया जा सकता है. स्नान में या तंत्रिका पर उत्तेजक इलेक्ट्रोड मांसपेशियों में संकुचन पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मांसपेशियों की लंबाई और बल नियंत्रित और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिस्टम का उपयोग कर मापा जा सकता है. इसी प्रकार इन विट्रो तैयारी EDL 11 चूहे में टी में, चूहे चौथे lumbrical पैर के अंगूठे की मांसपेशी में समूह आइए और द्वितीय धुरी afferents 12 और समूह III और IV पेशी afferents समूह तृतीय और चतुर्थ पेशी afferents अध्ययन करने के लिए कृन्तकों में इस्तेमाल किया गया है मेंमाउस तल पेशी 13 वह.
इन विट्रो प्रणाली औषधीय पहुंच और तापमान और पीएच तरह perfusate और physiochemical चर के प्रत्यक्ष नियंत्रण के फायदे हैं. इन विट्रो दृष्टिकोण विवो में संभावित संज्ञाहरण और मांसपेशियों छिड़काव स्थिति का घालमेल कर दिया समाप्त. मांसपेशी तंत्रिका तैयारी afferents पर एक गड़बड़ी की सीधी प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, vivo में 14 या पूर्व 3 की तैयारी के रूप में बलिदान विवो के साथ संभव है कि धुरी संवेदनशीलता और अन्य एकीकृत प्रतिक्रियाओं के गामा अपवाही मॉडुलन अध्ययन करने की क्षमता इस तैयारी में कोई neuronal सेल निकायों रहे हैं.
यह तैयारी पहले से रैंप की एक बैटरी के लिए माउस मांसपेशी धुरी afferents की प्रतिक्रिया विशेषताएँ और फैला है और कंपन पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और यह कि माउस धुरी अभिवाही respons निर्धारित किया गया थातों ऐसे चूहों, बिल्लियों, और मनुष्य के रूप में अन्य प्रजातियों की रिपोर्ट में उन लोगों के लिए समान थे. माउस धुरी अभिवाही प्रतिक्रियाओं 34 डिग्री सेल्सियस निरपेक्ष फायरिंग दरों में तेजी से थे, हालांकि 24 डिग्री सेल्सियस और 34 डिग्री सेल्सियस तापमान स्नान दोनों में समान हो पाया और afferents 15 परिवर्तन तेजी से लंबाई के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम थे. हम इस तैयारी मांसपेशी धुरी afferents की पहचान और अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे नीचे का वर्णन. इसके अलावा, इस तैयारी को आसानी से एक दवा या रोग राज्य या मिश्रित अन्य चर (जैसे, उम्र, लिंग, जीन पीटा) के जवाब में संवेदी afferents के गुणों की तुलना करने, अन्य मांसपेशियों अभिवाही उपप्रकार 13 की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
इस लेख के लक्ष्य के लिए एक अलग माउस मांसपेशी तंत्रिका तैयारी में पेशी धुरी afferents से रिकॉर्डिंग के लिए एक विधि का वर्णन करने के लिए किया गया था. हम माउस धुरी afferents चूहों, बिल्लियों और मनुष्यों 15 से उन के रूप में फैलाने के लिए इसी तरह का जवाब मिल गया है कि, और अन्य प्रयोगशालाओं मांसपेशियों और इन विट्रो में त्वचा दोनों में संवेदी न्यूरॉन्स अध्ययन करने के लिए मॉडल जीवों के रूप में चूहों का इस्तेमाल किया है (उदाहरण 3,13 के लिए) .
स्नायु संवेदी afferents 24 डिग्री सेल्सियस और 34 डिग्री सेल्सियस दोनों में कम से कम 6-8 घंटे के लिए रिकॉर्ड किया जा सकता है. EDL और तंत्रिका निपटने को कम करने के लिए, जब भी संभव ऊतक को संभालने के लिए FHL के शेष भाग का उपयोग करें. विच्छेदन के बाद, ऊतक स्नान के तापमान को और सामान्य synaptic प्रसारण को ठीक करने के लिए संतुलित करने की अनुमति देने के लिए डेटा संग्रह शुरू करने के लिए कम से कम 1 घंटे के इंतजार. इससे पहले, मांसपेशियों स्वास्थ्य अधिक से अधिक धनुस्तंभीय कॉन्ट्रा कि निर्धारित करने से इस तैयारी में इस्तेमाल की मांसपेशियों के एक सबसेट पर सत्यापित किया गया थामांसपेशियों द्वारा उत्पन्न ctile बल प्रयोग में 15 की शुरुआत और अंत में दूसरों के द्वारा सूचित किया है कि के समान है.
मांसपेशी धुरी afferents (चित्रा 3) (चित्रा 2) के संकुचन चिकोटी के जवाब में फायरिंग में एक विशेषता को थामने के लिए देख रहे हैं और साथ ही लंबाई में परिवर्तन करने के लिए प्रतिक्रिया में उम्मीद की तात्कालिक आवृत्ति बढ़ द्वारा इस तैयारी में कार्यात्मक रूप में पहचान की गई. हमारे अनुभव में, नियंत्रण की स्थिति में आग है कि सबसे afferents मांसपेशी धुरी afferents हैं. इस तैयारी (~ 7 मिमी अधिकतम) में बनाए रखा तंत्रिका की लंबाई पेशी अभिवाही उपप्रकार 13 की पहचान करने के लिए अभिवाही चालन वेग मतभेद का उपयोग करने के लिए पर्याप्त समय नहीं है. साथ ही, बिल्लियों और मनुष्यों के विपरीत, गतिशील संवेदनशीलता के उपायों (आगे की चर्चा के लिए विल्किनसन एट अल. 15 देखें) स्पष्ट रूप से चूहों में समूह आइए और द्वितीय afferents अंतर करने में सक्षम नहीं थे. Afferents के अन्य उपप्रकार (यानी., समूह तृतीय और चतुर्थ) आदि, ischemia के लिए मांसपेशियों को उजागर, स्नान पीएच कम, capsaicin, एटीपी, या ब्रैडीकाइनिन तरह 3,13,21-23 पदार्थ जोड़कर उदाहरण के लिए, इस तैयारी में अतिरिक्त कार्यात्मक परीक्षण का उपयोग कर पहचाना जा सकता है चूषण इलेक्ट्रोड का उपयोग एक भी पेशी से एकत्र किया जा सकता है कि डेटा की मात्रा बढ़ जाती है, जो कई संवेदी न्यूरॉन्स से गतिविधि को एक बार में दर्ज होने की अनुमति देता है. यह तैयारी संवेदी न्यूरॉन आबादी प्रतिक्रियाओं या पहचान afferents की प्रतिक्रियाओं पर एक गड़बड़ी के समग्र प्रभाव गेज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कील आकार काफी अद्वितीय हैं, तो 4 संवेदी न्यूरॉन्स के लिए ऊपर () Spike2 दोनों (कैम्ब्रिज इलेक्ट्रॉनिक डिजाइन) और LabChart प्रो (ई साधनों इसी तरह प्रदर्शन किया है) सॉफ्टवेयर द्वारा भेदभाव किया जा सकता है. न्यूरॉन्स भेदभाव नहीं किया जा सकता है जहां मामलों में, इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट या टिप व्यास में परिवर्तन आसानी से लागू किया जा सकता है.
इन विट्रो prepar में संक्षेप में, माउस मांसपेशी तंत्रिकासमझना विभिन्न भौतिक perturbations, चोट और बीमारी मॉडल को पेशी संवेदी afferents की प्रतिक्रिया गुणों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक साधारण प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है. साथ ही, यह तैयारी आदर्श ट्रांसजेनिक जानवरों और optogenetic उपकरण सहित चूहों में उपलब्ध शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण, का लाभ उठाने के लिए अनुकूल है.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.
Force and Length Controller & Tissue Bath | Aurora Scientific, Inc. | 300C-LR & 809B-IV | |
Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump & Easy Load II Pump Head | Cole Parmer | EW-07523-80 & EW-77200-60 | |
2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier & Headstage Amplifier | A-M Systems | Model 1800; 700000 & 700500 | |
Simulator | Grass OR Aurora Scientific, Inc. |
S88 OR 701 C |
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Dissecting Microscope | Swift | 892070 | |
Fiber Optic Light Source | Fiberlite | Model 190 | |
Analog to Digital Board | AD Instruments | PL3508/P (PowerLab 8/35) | |
Data Acquisition & Analysis Software | AD Instruments | LabChart Pro 7 | |
Electrode Holder | A-M Systems | 672445 | |
Electrode Glass | Dagan | SA16 | |
Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | P-80/PC | |
Microforge | Narishige | MF-9 | |
Isoflourane | MWI Veterinary Supply | 18627 | |
Surgical Tools | |||
Large Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
Large Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
#5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
#55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | |
6-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF (Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 ± 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 ± 0.05) |
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Sodium Chloride | Sigma | S9888-1KG | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma | 230391-500G | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Sodium Gluconate | Sigma | S2054-500G | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282-500G | |
Glucose | Sigma | G5767-500G | |
Sucrose | Sigma | S5016-500G | |
HEPES | Sigma | H3375-250G | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P0662-500G | |
Potassium Chloride | Sigma | P3911-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014-500G |