筋肉感覚ニューロンは自己受容体シグナル伝達に関与し、また代謝状態やけが関連するイベントについて報告している。私たちは、ストレッチ活性化筋求心性神経の研究のためのin vitroでの筋肉の神経に備えて成体マウスについて説明します。
筋肉感覚ニューロンは筋紡錘やゴルジ腱器官は固有感覚に不可欠な長さと力の変化をエンコード支配。追加の求心性線維は、代謝産物の蓄積、温度、および侵害刺激を含む筋肉の環境の他の特性を、監視する。全体的に、感覚ニューロンの異常な活性化は、運動障害または慢性疼痛症候群につながることができます。私たちは、成体マウスでのストレッチ誘発求心性応答のin vitro研究のため長指伸筋(EDL)筋肉と神経の単離を記載している。感覚活動は吸引電極で神経から記録され、個別の求心性は、スパイクソーティングソフトウェアを用いて解析することができる。 インビトロ製剤は、麻酔の潜在的な交絡または変更された筋肉の灌流のない感覚求心性神経上の十分に制御された研究を可能にします。ここでは、識別してストレッチする筋紡錘求心性神経の応答を試験するためのプロトコルを記述します。重要なことは、この製剤はまた、薬物のアプリケーションおよびマウスでの強力な遺伝的アプローチと疾患モデルの取り込み後の筋求心性神経、応答特性の他のサブタイプの研究をサポートしています。
骨格筋は、筋肉環境に関する重要な情報を中枢神経系を提供する感覚ニューロンにより神経支配されています。筋紡錘は、高度extrafusal筋線維と平行に配置されている錘内筋線維から構成されるカプセル化された構造を特化されます。スピンドルは、Ia族によって支配され、筋肉の長さと錘内繊維のトーンの変化をエンコードII求心性神経支配が動的ガンマ運動ニューロン1によって調節される。 Ib族求心性神経は、筋収縮の2中に筋線維とその腱の挿入の間に配置され、筋力の変化に敏感である、例えばれている。 Ia族、IbおよびIIの求心性は、適切なモータ制御に役立つ固有受容フィードバックを提供する。筋肉全体に配置筋求心性神経の追加の集団(群IIIおよびIV)代謝産物の蓄積、侵害刺激の存在、および筋肉の温度を通知するために役立つ<sup> 3。この筋肉感覚情報は、恒常性を維持する筋肉損傷を防止し、動きを調節するために重要である。筋肉求心性は、以前の経験4に基づいて発火パターンを変更することができます。侵害受容器の活性化は、バランスや動き6で問題につながる可能性の筋自己受容器からの慢性疼痛状態5と異常なシグナル伝達の誘導につながることができます。私たちは、(図示2-4月齢のC57BL / 6マウスからの応答である)両方の性別の成体マウスから筋肉感覚神経受容体終末の応答を研究するために体外に備えて孤立筋肉神経を使う。マウスは、哺乳類での研究のためのモデルの遺伝種である。この準備は、坐骨神経の深い腓骨枝と長指伸筋(EDL)筋、下腿の外側部で見つかった腓骨グループの速筋の筋肉の単離を必要とする。 EDLは、多くの場合、筋肉の収縮特性7-9を研究するために使用され、TEを持ってい隔離し、安静時および合理的な収縮のデューティ·サイクル10で十分な拡散性の酸素供給を可能にするのに十分に小さいが容易であるndons。 (インスタンスヒラメと前脛骨用)このエリアの他の筋肉が同様の大きさのものであり、この準備は簡単にこれらの筋肉からの求心性神経から記録するように修正することができる。吸引電極は、筋肉感覚求心性発火を記録するために、神経の切断端上に配置される。個別のニューロンを識別し、スパイクソーティングソフトウェアを使用してスパイク形状に基づいて分析することができる。浴中または神経に刺激電極は、筋収縮を誘発するために使用することができる。筋肉の長さおよび力が制御され、市販のシステムを用いて測定することができる。同様のin vitro調製物は、ラットのEDL 11、Ia族およびラットの第四虫様つま先筋12とtにおけるグループIIIおよびIV筋求心性神経のII紡錘求心性神経でのグループIIIおよびIV筋求心性神経を研究するためにげっ歯類で使用されてきた彼のマウス足底筋13。
in vitroの系では、薬理学的ア クセシビリティと温度およびpHなどの灌流液および生理化学的変数を直接制御の利点を有している。 in vitroでのアプローチは、麻酔や筋肉灌流状態の潜在的なin vivoでの交絡を排除します。筋肉神経準備が求心上の摂動の直接的な反応の研究を可能にするが、in vivoで14またはex 3の製剤のように犠牲にされている生体内で可能な主軸感度および他の集積反応のガンマ遠心性変調を研究する能力この準備には神経細胞体は存在しない。
この調製は、以前のランプの電池に対するマウス筋紡錘求心性神経の応答を特徴付けストレッチや振動を保持するために使用し、これをマウススピンドル求心性RESPONSことが決定されたエスは、ラット、ネコ、及びヒトのような他の種で報告されたものと同様であった。マウススピンドル求心性応答は、34℃、絶対発火率で速かったものの、24℃と34℃の浴温の両方で類似していることが判明し、求心性は、15を変えるより速く長さに対応することがよりできたました。私たちは、この準備が筋紡錘求心性神経を特定し、研究するために使用する方法を下に説明します。さらに、この調製物は、容易に薬物または疾患状態または各種他の変数( 例えば 、年齢、性別、遺伝子ノックアウト)に応答して、感覚求心性神経の特性を比較するために、他の筋肉の求心性亜型13の応答を研究するために修飾することができる。
この記事の目的は、単離したマウスの筋肉の神経に備えて筋紡錘求心性神経から記録するための方法を説明することでした。私たちは、マウスのスピンドル求心性神経は、ラット、ネコとヒト15からのもののように伸ばすことも同様に応答することを見出し、他の研究室は、in vitroで 、筋肉と皮膚の両方で感覚ニューロンを研究するためのモデル生物としてマウスを使用していた(例えば、3,13用) 。
筋肉感覚求心性は、24℃と34℃の両方で少なくとも6-8時間記録することができる。 EDLや神経を扱う最小限に抑えるために、可能な限り、組織を処理するためにFHLの残りの部分を使用しています。解剖後、組織浴温度にし、回復するための正常なシナプス伝達のために平衡化させるためにデータ収集を開始するために、少なくとも1時間待つ。以前は、筋肉の健康は最大の強縮コントラことを決定することによって、この調製に用いられる筋肉のサブセット上で検証した筋肉によって生成されたctile力は、実験15の最初と最後に他者によって報告されたものと同様である。
筋紡錘の求心性は、( 図3)(図2)収縮をけいれんに応じて、焼成中に特徴的なポーズを探しているだけでなく、長さの変化に応じて、予想される瞬間的な周波数が増加することによって、この準備として、機能的に同定された。われわれの経験では、制御条件に火災最も求心性は、筋紡錘求心性はある。この調製物(約7ミリメートル最大)に保持神経の長さは、筋求心性亜型13を識別するために求心性伝導速度の違いを利用するのに十分な長さではない。また、猫と人間とは異なり、動的な感度の指標は明らかにマウスではIa族およびII求心性を区別することができませんでした(さらなる議論のためにウィルキンソンらを参照してください。15)。求心性神経の他のサブタイプ( すなわち、グループIIIおよびIV) など 、カプサイシン、ATP、またはブラジキニンのような物質を添加浴pHの低下、虚血筋肉を露出することによって、例えば、この製剤中の追加の機能テストを用いて同定することができる3,13,21-23吸引電極を使用すると、単一の筋から採取することができるデータ量を増加させる、複数の感覚ニューロンからの活動を一度に記録することができる。この調製物は、感覚ニューロン群の応答または識別された求心性神経の応答に対する摂動の全体的な効果を評価するために使用することができる。スパイク形状が十分に一意である場合、最大4感覚ニューロンは(Spike2(ケンブリッジ電子設計)とLabChartのプロ(のAD·インスツルメンツ)の両方が同様に行われている)ソフトウェアによって判別することができる。ニューロンが判別できない場合において、電極配置や先端径の変化を容易に実現することができる。
体外 prepar における要約すると、マウスの筋肉神経ationは、さまざまな物理化学的摂動、傷害および疾病モデルに筋肉感覚求心性神経の応答特性を調べるために使用することができる簡単な実験的アプローチである。さらに、この製剤は、理想的にトランスジェニック動物および光遺伝学的ツールを含むマウスで利用できる強力な遺伝子ツール、を活用するために適しています。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.
Force and Length Controller & Tissue Bath | Aurora Scientific, Inc. | 300C-LR & 809B-IV | |
Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump & Easy Load II Pump Head | Cole Parmer | EW-07523-80 & EW-77200-60 | |
2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier & Headstage Amplifier | A-M Systems | Model 1800; 700000 & 700500 | |
Simulator | Grass OR Aurora Scientific, Inc. |
S88 OR 701 C |
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Dissecting Microscope | Swift | 892070 | |
Fiber Optic Light Source | Fiberlite | Model 190 | |
Analog to Digital Board | AD Instruments | PL3508/P (PowerLab 8/35) | |
Data Acquisition & Analysis Software | AD Instruments | LabChart Pro 7 | |
Electrode Holder | A-M Systems | 672445 | |
Electrode Glass | Dagan | SA16 | |
Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | P-80/PC | |
Microforge | Narishige | MF-9 | |
Isoflourane | MWI Veterinary Supply | 18627 | |
Surgical Tools | |||
Large Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
Large Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
#5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
#55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | |
6-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF (Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 ± 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 ± 0.05) |
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Sodium Chloride | Sigma | S9888-1KG | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma | 230391-500G | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Sodium Gluconate | Sigma | S2054-500G | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282-500G | |
Glucose | Sigma | G5767-500G | |
Sucrose | Sigma | S5016-500G | |
HEPES | Sigma | H3375-250G | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P0662-500G | |
Potassium Chloride | Sigma | P3911-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014-500G |