Muscle neurônios sensoriais estão envolvidos na sinalização proprioceptor e também informar sobre eventos estaduais e lesão relacionada com o metabolismo. Nós descrevemos um rato adulto em preparação músculo-nervo vitro para estudos sobre músculos aferentes ativado por estiramento.
Muscle neurônios sensoriais que inervam os fusos musculares e os órgãos tendinosos de Golgi codificar mudanças essenciais para a propriocepção comprimento e força. Fibras aferentes adicionais monitorizar outras características do ambiente muscular, incluindo a acumulação do metabolito, a temperatura e os estímulos nociceptivos. No geral, a ativação anormal dos neurônios sensoriais pode levar a perturbações do movimento ou síndromes de dor crônica. Descreve-se o isolamento do extensor digitorum longus (EDL) do nervo do músculo e para estudo in vitro de respostas evocadas por estiramento aferentes no rato adulto. Actividade sensorial é gravado a partir do nervo com um eléctrodo de sucção e aferentes individuais podem ser analisados usando software de ponto de triagem. Preparações in vitro para permitir estudos bem controlados em aferentes sensoriais, sem os potenciais confunde de anestesia ou perfusão muscular alterados. Aqui nós descrevemos um protocolo para identificar e testar a resposta de aferentes do fuso muscular para esticar. É importante ressaltar queesta preparação também suporta o estudo de outros subtipos de aferentes musculares, propriedades de resposta após a aplicação de drogas e a incorporação de abordagens genéticas potentes e modelos de doença em ratinhos.
Os músculos esqueléticos são inervados por neurônios sensoriais que fornecem o sistema nervoso central, com informações importantes sobre o meio ambiente muscular. Os fusos musculares são altamente especializados estruturas encapsulados, constituído por fibras musculares intrafusais que estão localizados em paralelo com as fibras musculares extrahusales. Eixos são inervados pelo Grupo Ia e II aferentes que codificam mudanças no comprimento muscular e tom fibra intrafusal é regulada de forma dinâmica por inervação gama neurônios motores 1. Grupo aferentes Ib estão posicionadas entre as fibras musculares e suas inserções dos tendões e são sensíveis a mudanças na força muscular, por exemplo, durante a contração muscular 2. O Grupo Ia, Ib e II aferentes fornecer feedback proprioceptivo que auxilia no controle motor adequado. Populações adicionais de aferentes musculares localizados ao longo do músculo (Grupo III e IV) serve para sinalizar a acumulação do metabolito, na presença de estímulos nociceptivos, e a temperatura muscular <sup> 3. Esta informação sensorial muscular é fundamental para manter a homeostase, evitando danos musculares e modulando movimento. Aferentes musculares podem alterar os seus padrões de disparo com base na experiência anterior 4. A ativação dos nociceptores pode levar à indução de estados de dor crônica 5 e sinalização aberrante dos proprioceptores musculares pode levar a problemas de equilíbrio ou movimento 6. Usamos um isolado músculo-nervo em preparação vitro para estudar a resposta do músculo terminações receptoras neurônio sensorial de camundongos adultos de ambos os sexos (mostrados são respostas 2-4 meses de idade C57BL / 6). O rato é a espécie genética modelo para estudos em mamíferos. Esta preparação requer o isolamento do ramo profundo fibular do nervo ciático e o músculo extensor digitorum longus (EDL), um musculares rápidas do grupo fibular encontrado na parte lateral da parte inferior da perna. A EDL é frequentemente usado para estudar as propriedades contráteis do músculo 7-9, tem tendons que são fáceis de isolar e é pequeno o suficiente para permitir o fornecimento de oxigénio por difusão adequada em repouso e com razoáveis ciclos de contração 10. Outros músculos nesta área (por exemplo, sóleo e tibial anterior) são de tamanho semelhante e esta preparação pode ser facilmente modificado para gravar a partir de aferentes destes músculos. Um eléctrodo de sucção é colocado sobre a extremidade cortada do nervo para o músculo gravar sensorial aferente disparo. Neurônios individuais podem ser identificadas e analisadas quanto a sua forma spike spike usando software de classificação. Eléctrodos de estimulação no banho ou no nervo pode ser utilizado para evocar a contracção muscular. Comprimento do músculo e força pode ser controlada e medida usando sistemas disponíveis comercialmente. Similar preparações in vitro têm sido utilizados em roedores para estudar músculos aferentes do grupo III e IV no rato EDL 11, Grupo IA e II aferentes do fuso muscular no quarto dedo do pé lumbrical rato 12 e Grupo III e IV musculares aferentes em tele muscular rato plantar 13.
Um sistema in vitro, tem as vantagens de acessibilidade farmacológico e um controlo directo de variáveis de perfusão e físico-químicas, como a temperatura e pH. Uma abordagem in vitro elimina o potencial in vivo confunde de anestesia e muscular estado de perfusão. Embora a preparação do músculo-nervo permite o estudo da resposta directa de uma perturbação nos aferentes, a capacidade para estudar gama eferente modulação da sensibilidade do fuso e outras respostas integradas, que é possível com 14 in vivo ou ex vivo três preparações são sacrificados como não existem corpos celulares neuronais em esta preparação.
Esta preparação foi previamente usada para caracterizar a resposta de aferentes do fuso muscular do rato a uma bateria de rampa e mantenha alongamentos e vibrações e foi determinado que respons aferentes do fuso ratoes foram semelhantes aos relatados em outras espécies, como ratos, gatos e seres humanos. Rato respostas aferentes fuso foram encontrados para ser semelhante em ambos os 24 ° C e 34 ° C temperatura do banho, embora a 34 ° C as taxas de queima absoluto foram mais rápidas e os aferentes eram mais capazes de responder mais rapidamente a alterações de comprimento 15. Descrevemos abaixo como esta preparação pode ser usado para identificar e estudar os aferentes do fuso muscular. Além disso, esta preparação pode ser facilmente modificado para estudar a resposta de outros subtipos aferentes músculo 13, para comparar as propriedades de aferentes sensoriais em resposta a um estado de doença ou de drogas ou de outras variáveis variados (por exemplo, idade, sexo, knockout de genes).
O objetivo deste artigo foi descrever um método para gravar a partir de aferentes do fuso muscular em uma preparação do mouse músculo-nervo isolado. Descobrimos que aferentes do fuso rato responder de forma semelhante para esticar como aqueles a partir de ratos, gatos e seres humanos 15, e outros laboratórios têm usado ratinhos como organismos-modelo para estudar os neurónios sensoriais, tanto no músculo e a pele, in vitro (por exemplo 3,13) .
Fibras aferentes sensoriais pode ser registada, pelo menos, 6-8 horas a tanto 24 ° C e 34 ° C. Para minimizar o manuseamento EDL e nervo, utilizar a parte restante do FHL para tratar o tecido sempre que possível. Após a dissecção, espere pelo menos uma hora para começar a coleta de dados para permitir que o tecido para equilibrar a temperatura do banho e para a transmissão sináptica normal, para se recuperar. Anteriormente, a saúde muscular foi verificada em um subconjunto de músculos usados nesta preparação, determinando que o máximo tetânica contractile força gerada pelos músculos é similar ao relatado por outros no início e no fim da experiência 15.
Aferentes do fuso de músculo foram identificados funcionalmente nesta preparação, procurando uma pausa na característica de disparo em resposta a contorcer contracção (Figura 2), bem como o aumento da frequência instantânea esperadas em resposta a alterações de comprimento (Figura 3). Em nossa experiência, a maioria dos aferentes que o fogo em condições de controle são aferentes do fuso muscular. O comprimento do nervo mantida nesta preparação (~ 7 mm, no máximo) não é suficientemente longo para utilizar as diferenças de velocidade de condução aferentes para identificar subtipos aferentes muscular 13. Além disso, ao contrário de gatos e seres humanos, as medidas de sensibilidade dinâmica não foram capazes de diferenciar claramente Grupo Ia e aferentes II em camundongos (para uma discussão mais aprofundada ver Wilkinson et al. 15). Outros subtipos de aferentes (por exemplo,. Grupo III e IV) podem ser identificados utilizando testes funcionais adicionais nesta preparação, por exemplo, por adição de substâncias, tais como a capsaicina, o ATP, ou a bradicinina, a diminuição do pH do banho, para expor o músculo isquemia, etc 3,13,21-23 Usando eletrodos de sucção permite que a atividade de múltiplos neurônios sensoriais a ser gravado de uma só vez, o que aumenta a quantidade de dados que podem ser coletados a partir de um único músculo. Esta preparação pode ser utilizada para avaliar o efeito global de uma perturbação nas respostas da população de neurónios sensoriais ou as respostas de aferentes identificados. Se as formas de pico são únicos o suficiente, até 4 neurônios sensoriais pode ser discriminado por software (ambos Spike2 (Cambridge Electronic Design) e LabChart Pro (AD Instruments) realizaram semelhante). Nos casos em que os neurônios não podem ser discriminados, mudança de posicionamento do eletrodo ou diâmetro da ponta pode ser facilmente implementado.
Em resumo, o nervo-músculo do rato em vitro preparção é um método experimental simples que pode ser utilizada para investigar as propriedades de resposta de fibras aferentes sensoriais para vários modelos de perturbação, lesões e doenças físico-químicas. Além disso, esta preparação é ideal para aproveitar as poderosas ferramentas genéticas disponíveis em ratinhos transgénicos, incluindo animais e ferramentas optogenetic.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.
Force and Length Controller & Tissue Bath | Aurora Scientific, Inc. | 300C-LR & 809B-IV | |
Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump & Easy Load II Pump Head | Cole Parmer | EW-07523-80 & EW-77200-60 | |
2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier & Headstage Amplifier | A-M Systems | Model 1800; 700000 & 700500 | |
Simulator | Grass OR Aurora Scientific, Inc. |
S88 OR 701 C |
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Dissecting Microscope | Swift | 892070 | |
Fiber Optic Light Source | Fiberlite | Model 190 | |
Analog to Digital Board | AD Instruments | PL3508/P (PowerLab 8/35) | |
Data Acquisition & Analysis Software | AD Instruments | LabChart Pro 7 | |
Electrode Holder | A-M Systems | 672445 | |
Electrode Glass | Dagan | SA16 | |
Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | P-80/PC | |
Microforge | Narishige | MF-9 | |
Isoflourane | MWI Veterinary Supply | 18627 | |
Surgical Tools | |||
Large Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
Large Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
#5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
#55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | |
6-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF (Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 ± 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 ± 0.05) |
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Sodium Chloride | Sigma | S9888-1KG | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma | 230391-500G | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Sodium Gluconate | Sigma | S2054-500G | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282-500G | |
Glucose | Sigma | G5767-500G | |
Sucrose | Sigma | S5016-500G | |
HEPES | Sigma | H3375-250G | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P0662-500G | |
Potassium Chloride | Sigma | P3911-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014-500G |